细胞工程-动物组织和细胞培养.doc

第3章动物细胞和组织培养工程第一节 植物组织和细胞培养的基础知识一 动物细胞培养的基本条件无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，高压灭菌器，抗生素细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高速离心机，移液器细胞保存条件：液氮罐实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全(一) 无菌条件 净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，高压灭菌器，抗生素.1 净化工作室- 我国药品生产洁净室（区）空气洁净度标准 -洁净度级尘粒最大允许数/立方米尘粒最大允许数别10010,000100,000300,0000.5um3,500350,0003,500,00010,500,0005um02,00020,00060,000浮游菌/立方5100500NA沉降菌/皿1310152 风淋室:风淋室是生物洁净室的理想配套设备，用于吹除进入洁净厂房的人、物表面附着的尘埃是进行人身、物料净化和防止室外空气侵入洁净区的有效设备风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。3 传递窗:该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。4 高效过滤器:高效过滤器是用超细玻璃纤维纸作滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合金框、木框及镀锌钢板框组合而成。特点：具有低阻高效、轻质、容尘量大等特点，适用于常温常压常湿条件下环境空气的净化.5 洁净层流罩:层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化设备。洁净层流罩是将空气经风机以一定的风压通过高效空气过滤器后，使洁净空气呈垂直气流送入工作区，从而保证了工作区内达到工艺所需的高洁净度。6 超净工作台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。7 生物安全柜:一种既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境，保证检验、检测不受污染，又能保证被研究的对象（如病菌、细菌等）不外溢，保护周围环境及操作人员的安全隔离设备。该设备可广泛应用于低、中等危险度的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研究，加工、检验部门。 如何除菌？ 灭菌8 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 。9 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 。10蔡氏（ Zeiss）滤器：过滤除菌，滤器中的滤膜一般用0.20.3m孔径的微 孔滤膜。凡在高温或射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合成培养液、血清、消化 用胰酶等都须用滤器过滤除菌。滤 器大容量高压灭菌器(二) 细胞生长条件 纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清1自动双重纯水蒸馏器2 纯水仪精滤、活性碳吸附反渗透3 标准型细胞培养板 （Tissue Culture Plates）6孔，12孔，24孔，48孔，96孔4 培养瓶5 CO2培养箱CO2培养箱主要由箱体结构件、温度控制系统和CO2浓度控制系统三部分组成。CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。再现活体环境对于温度、PH值CO2浓度、氧分压（O2浓度）、相对湿度等细胞生长关键的因素，6 移液器(三) 细胞检测条件： 倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高速离心机，移液器15用于微生物、细胞、细菌、组织 培养、悬浮体、沉淀物等的观察，并可将此过程中的任一形态拍摄下来。2酶标仪3 微孔板震荡器通过自动酶标仪计数来检测活细胞数量。主要用于酶标板、细胞培养板(如6孔板、12孔板、24孔板、48孔、96 孔板等)等溶液的混匀或细胞的混匀。(四) 细胞保存条件： 液氮罐-196 (五) 实验室安全： 生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全实验室安全层流净化细胞培养室管理规则一级生物安全防护实验室二级生物安全防护实验室三级生物安全防护实验室四级生物安全防护实验室层流净化细胞培养室管理规则局部小环境空气达到洁净度等级层流净化细胞培养室的总体要求：经济、有序、高效、安全。初步制定相关制度如下：实验室安全级别一级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。二级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。二级生物安全防护实验室1 可能产生致病微生物气溶胶或出现溅出的操作均应在生物安全柜(级生物安全柜为宜)或其他物理抑制设备中进行，并使用个体防护设备。2 处理高浓度或大容量感染性材料均必须在生物安全柜(级生物安全柜为宜)或其他物理抑制设备中进行，并使用个体防护设备。上述材料的离心操作如果使用密封的离心机转子或安全离心杯，且它们只在生物安全柜中开闭和装载感染性材料，则可在实验室中进行。3 当微生物的操作不可能在生物安全柜内进行而必须采取外部操作时，为防止感染性材料溅出或雾化危害，必须使用面部保护装置(护目镜、面罩、个体呼吸保护用品或其他防溅出保护设备)。4 在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。用过的工作服应先在实验室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。5 当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。三级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗。例如：艾滋病病毒的研究(血清学实验除外)应在三级生物安全防护实验室中进行。例如：重症SARS病人传染性 较强，这与病人产生的大量呼吸道飞沫有关。三级生物安全防护实验室1 实验室中必须安装级或级以上生物安全柜。2 所有涉及感染性材料的操作应在生物安全柜中进行。当这类操作不得不在生物安全柜外进行时，必须采用个体防护与使用物理抑制设备的综合防护措施。3 在进行感染性组织培养、有可能产生感染性气溶胶的操作时，必须使用个体防护设备。4 当不能安全有效地将气溶胶限定在一定范围内时，应使用呼吸保护装置。5 工作人员在进入实验室工作区前，应在专用的更衣室(或缓冲间)穿着背开式工作服或其他防护服。工作完毕必须脱下工作服，不得穿工作服离开实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。6 工作时必须戴手套(两副为宜)。一次性手套必须先消毒后丢弃。7 在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于取用。可配备应急药品。四级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。与上述情况类似的不明微生物，也必须在四级生物安全防护实验室中进行。待有充分数据后再决定此种微生物或毒素应在四级还是在较低级别的实验室中处理。1 在实验室中所有感染性材料的操作都必须在级生物安全柜中进行。如果工作人员穿着整体的由生命维持系统供气的正压工作服，则相关操作可在级生物安全柜中进行。2 所有工作人员进入实验室时都必须换上全套实验室服装，包括内衣、内裤、衬衣或连衫裤、鞋和手套等。所有这些实验室保护服在淋浴和离开实验室前均必须在更衣室内脱下。(六) 培养细胞生长的条件1 细胞的营养需要2 细胞的生存环境温度: 37 ，O2CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-pH: 7.2-7.43 无污染4 无毒1 细胞培养用液的配制1）水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2）平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液，维持一定渗透压和pHPBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4加水至1000 ml0.203）消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。4） 培 养 基 ：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ；多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；各种生长因子；转移蛋白；不明成分。一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10血清血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 无血清培养基:在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清细胞培养基优点保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌补体是热敏性的，是机体免疫防御系统的重要组成部分，其主要功能是抗感染，补体虽然具备杀死病菌的作用，但有时也伤害好细胞，引起炎症的作用。 抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定。完全培养基的组成基础培养基血清碳酸氢钠青、链霉素80一955一202.0 g/L各100单位毫升