抗生素微生物效价测量实验的研究.doc

抗生素微生物效价测量实验的研究

学 院：化学与制药工程学院
专业班级：制药09-3班
姓 名：朱秋红
学 号：200904041098

抗生素微生物效价测量实验的研究
一、实验简介：
抗生素微生物效价检定法是以抗菌活性为指标来衡量抗生素中有效成分效力的一种方法。此方法恰好与临床应用的要求相符合，能够确定抗生素的医疗价值，虽然随着仪器分析的发展，部分抗生素含量测定被物理、化学方法所代替，但微生物效价检定法仍然作为抗生素含量测定的经典方法之一被各国药典所采用。
抗生素微生物效价测定法可分为稀释法、比浊法和渗透法三类[1]，通常稀释法用于测定药物的MIC，各国药典均未收载该方法。除中国药典外，《USP》23 版第六增补版，《BP》1998，《EP》1997第三版，《日抗基》1998均收载了比浊法，其优点是采用液体培养基，无扩散因素的影响。试验过程短于渗透法。轩书堂[2]也曾用比浊法测定过泰乐星效价，但该法要求仪器设备较高，且菌种容易污染，故一直未被中国药典所采用。《日本药局方》虽然收载了该方法，但几乎没有机构使用。渗透法也称扩散法，其中管碟扩散法即管碟法是国内外最常用的方法。中、美、英、日和欧洲药典均收载了该方法。
管碟法是利用抗生素在培养基内的扩散渗透作用，将抗生素稀释液加入已放置含有高度敏感性的试验菌培养基的小管内，经培养后，在抗生素扩散到达的适当范围内，形成一定浓度的球型区，产生透明的抑菌圈。通过测量抑菌圈的大小可进行效价计算。管碟法分为一剂量法，二剂量法，三剂量法三种。一剂量法是用已知效价的标准品溶液制备出标准曲线，并在同样条件下测出供试品溶液所致抑菌圈直径的平均值后，再求出其与标准品溶液所致抑菌圈直径平均值之差，以换算出效价。该方法较为繁琐，目前除《日抗基》1998及《USP》23 版收载外，其他药典均未收载，而《中国药典》自1997年版后已经淘汰了该方法。
基于抗生素对微生物作用所产生的抑菌圈的大小是随着抗生素剂量的变化而变化，是可以测量的，二剂量法采用标准品与供试品对比试验的平行线原理，实验设计出其浓度与反应的直线关系。即在一定浓度的抗生素范围内，其对数剂量和抑菌圈直径(或面积)呈直线关系，用统计分析方法算出标准品与供试品的等反应剂量，对比出供试品效价的检定方法。而三剂量法是标准品和供试品各用三种剂量在同一条件下比较，比二剂量法多了一个剂量，因而增加了结果的准确性，我国只有在标化标准品时才被采用，而《BP》1998、《EP》1997 规定，在结果发生异议时用之仲裁[3]。
《中国药典》自1985年版之后，对于实验结果采用统计学处理，进行F值的显著性测验，二剂量法控制直线回归，剂间P<0.01(差别非常显著8，偏离平行P<0.05(差别无显著意义8 三个参数。三剂量法除符合上述要求外，还要进行二次曲线，反二次曲线P<0.05(差别无显著意义8的验证以判断实验可靠与否，并要求实验的可信限率<5%，个别品种<7%，这大大提高了实验的可信性及准确性。
抗生素微生物效价检定法影响因素很多，如培养温度、培养基成分、酸碱度、实验菌种的老化、菌层厚度、药液的稀释、钢管等，只要实验中加以注意和改进，这些问题基本能得到很好的解决。
抗生素效价测定药典规定，标准品溶液的最初浓度配成1000U/ml，体积一般约为50ml，配制前根据标准品效价计算称量范围，然后称量，称定后根据重量计算出配制的准确体积，如果稀释体积低于50ml，只能用滴定管加入稀释液，多于50ml 只得溶于50ml 容量瓶后用刻度吸管加入零头，且零头体积不宜太多，以免容量瓶可容纳体积被超出。王承芬[19]等用F值校正法，不必准确调整体积至应配体积值，均稀释至50ml，在最后的结果计算中折算F值，以消除稀释的误差。
由于微生物效价检定法采用预实验确定加菌量，以符合药典规定的高剂量直径为18- 24 mm，胡公允[20]等人对常用实验菌藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌所检定抗生素品种的上层培养基中的加菌量进行了系统的研究，表明以规定原菌液的透光率和稀释数即可直接获得药典规定的要求，当透光率分别为T八叠(60±5）%、T枯草(55 ±5）%、T短小45%-50 %较为适宜，基本满足了12种抗生素的预试验结果。
二、实验步骤：
（一）实验一：常用培养基的制备和灭菌与消毒
1、实验目的
（1）了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（2）了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具体操作方法。
2、实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
水 1000ml
pH 7.4～7.6。

3、实验器材
（1）药品及试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水
（2）仪器及其它：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠。
4、方法步骤
（1）培养基的制备与分装
a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。
b.熔化在沸水浴锅中加热熔化。
c.调pH用1NNaOH调pH至7.4-7.6。
d.过滤趁热用多层纱布过滤（本实验勿需过滤）
e.分装将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，装量不超过试管的1/4，注意管口不要沾上培养基。
f.加棉塞然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。
（二）无菌水的制备
g.用量筒量取45ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
h.用5ml吸管取4.5ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
（三）器皿的准备
i.培养皿的包装每6套一包，用旧报纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。
j.吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。
k.玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。
（四）培养基、无菌水、器皿的灭菌
l.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌。
m.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。
n.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。
(二)实验二 菌种保存
1、实验目的
学习和掌握菌种保藏的基本原理,比较几种不同的包藏方法
2、基本原理
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。现有的保藏方法主要有：
斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3-6个月。如放线菌于4-6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4-6℃保存，每4-6个月移接一次；霉菌于4-6℃保存，每6个月移接一次。
3、实验器材
（1）菌种：大肠杆菌，粉红色酵母菌，枯草杆菌
（2）培养基：肉汤培养基，
（3）试剂仪器：无水氯化钠，食盐，无菌吸管，无菌滴管，无菌培养皿，安瓿管，冻干管，油纸，滤纸条，干燥器
4、实验步骤
斜面法：将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。
培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。
保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。
斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。（三）实验三 药物敏感实验
1、目的要求
（1）熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判断方法。
（2）了解药敏试验在实际生产中的重要意义
2、实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。3、实验器材
（1）菌种 大肠杆菌，枯草杆菌，粉红色酵母菌
（2）培养基 MH（Mueller-Hintion）琼脂。
（3）试剂 无菌生理盐水，抗菌药物纸片：选用直径6.35mm吸水量20μl的专用药敏纸片，磺胺嘧啶
（4）其他 无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
4、方法步骤
（1）菌液制备
a对数生长法：从琼脂平板上选取至少3~5个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含4~5ml的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，35℃孵育2~6h。用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于0.5麦氏标准。
b直接菌落法：从孵育18-24h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成0.5麦氏标准浊度的悬液。
(2)接种 细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。
(3)贴药敏纸片
涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
(4)孵育
将平板倒置放入35℃孵箱（苛养菌敏平板应放置于5%~10%CO2环境中），16~18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。
5、结果判断
抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。根据CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生素是敏感、中介还是耐药。
(四)实验四 细菌形态观察及单染色
1、目的要求
（1）学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。
（2）了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。
（3）学习掌握水浸片观察霉菌形态特征。
2、实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。微生物的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
3、实验器材
（1）菌种：大肠杆菌，枯草杆菌，粉红色酵母菌。
（2）显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管。
（3）草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、藏红。
4、方法步骤
（1）单染色步骤：
a、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。
b、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。
c、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。
d、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。
e、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。
f、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。
g、镜检：油镜观察并绘图。
（2）革兰氏染色步骤
a、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/2处下面用记号笔做标记，并滴一滴蒸馏水，将大肠杆菌涂布在相应的区域内。
b、干燥与固定：方法同（一）中2，3步骤。
c、染色：
结晶紫染色1-2分钟--水洗--碘液媒染1-2分钟--水洗--酒精脱色15-20秒--水洗—藏红复染色2-3分钟--水洗--干燥--镜检记录。
5、结果与思考
1、绘图记录观察结果

(五)实验五 校园环境空气微生物的调查
1、实验目的
通过本实验的学习，使学生掌握微生物的分离与纯化的原理与方法，熟练掌握微生物的染色方法以及微生物的计数等基本技能，为今后微生物的遗传、生理以及分子生物学等学习打下基础。
2、实验原理
空气中微生物的主要来源于土壤、水体表面、动植物、人体及生产活动、污水污物处理等，其组成浓度不稳定，种类多样，有细菌、真菌、病毒、噬菌体等。空气微生物是大气污染物之一。空气微生物往往吸附在悬浮颗粒物上，随风飘荡，可导致人类和动植物某些疾病的发生与传播，且常与环境的其他污染物协同作用，致使环境恶化，空气质量降低。空气微生物的浓度是评价空气质量的重要指标之一。
近年来，室内空气污染问题已经引起人们的极大关注，其中微生物污染的监测也逐步受到重视。随着我校办学规模不断加大，校园已是人群比较密集的场所。为了解我校室内空气微生物污染现状，对学生宿舍、食堂、教学楼、图书馆等场所进行了空气细菌总数监测与分析，对影响室内空气中微生物污染的原因进行分析，提出防治措施，这对于加强卫生监督、预防和控制传染病的传播以及校园文明建设都将起着积极作用。
校园是学生集中生活学习的区域，采用微生物学方法，检测校园空气微生物的时空分布，可进一步了解校园空气污染现状，对于防止呼吸道疾病的传播，保护学生身体健康具有重要的现实意义。
3、实验器材
（1）主要仪器
高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、电子分析天平、干燥箱、显微镜、超净工作台（2）主要试剂
牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水
4、方法步骤
（1）培养基的配制（牛肉膏蛋白胨培养基）
（2）选定采样点（教学楼、宿舍、图书馆、食堂、体育馆、操场等）建议每个采样点至少有2个组进行采样，即每个采样点有2组以上重复；
（3）不同采样时间进行采样（上午、中午、下午各1次），每次采样时间分5分钟、10分钟、30分钟（平皿暴露时间）采样。
（4）讲采样的平皿进行培养
（5）菌落观察。
三、注意事项
1.培养基要严格按配方配制。
2.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度及时间的控制。
3.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
4.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。
5．应.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。
6.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
7.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。
8.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀。
9.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。
四、参考文献
1.郑钧镛等.药品微生物学及检验技术
2.轩书堂. 全国抗生素，微生物药物( 分离、纯化、合成及质量分析学术研讨会论文汇编
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讨论会论文汇编
9.刘英等4 药物分析杂志
10.李凡等4 全国抗生素 微生物药物 分离4 纯化4 合成及质量
分析学术研讨会论文汇编
11.王艳秋等4 中国药事
12.王承芬等4 北京市药检所技术论文汇编
13. 胡公允等4 药物分析杂志
五、心得体会
这次综合实验进一步加深了我对专业知识的理解，为以后专业课程的学习打下坚实的基础。也使我对课题有了新的认识，明白了完成一个综合实验所进行的准备工作及相关流程。同时通过运用所学的专业知识进行观察，也锻炼了提出、分析并解决问题的能力。另外通过实习培养我们吃苦耐劳和团结协作的精神，体会合作达到成功所带来的乐趣。利用这次综合实验可以很好地让同学们感受到花蹙额探究实验的乐趣，培养热爱科学、实践探究的意识。激发学生积极探索化学工艺的奥秘的兴趣。
实验报告已接近了尾声，回想过去的点点滴滴，我感觉学到了很多东西，感觉很充实。
短暂的实验虽匆匆结束了，但通过本次探究实验，有了很多的感悟。实践出真知的道理对于我有了更深的理解。理论是死的，实践才是活的，在探索实验过程中我看到书上的理论是如何应用于实践的。“纸上得来终觉浅，绝知次事躬行。”说的很有道理，在今后的学习和工作过程中我将把从书上学到的东西进一步更好地用于指导实践，同时在实践中进一步检验和完善自己的理论体系，以便更好的服务于实践。
这次综合探究性实验是我在大学实验的重要组成部分，我和大家一样都很珍惜这次难得的机会，尽我的全力学习我不懂的东西。我基本达到了实验增长见识、开阔眼界、联系社会、了解实践等目的，我深知实验的一个重要目的是为了做好毕业设计，在设计过程中我会把在实验中学到的设计技巧、加工工艺、制造技术等用于我的设计上，更好地完成毕业设计。
最后向在实验过程中给予我指导和帮助的老师和同学表示衷心的感谢！