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PBMC分离及冻存流程
PBMC分离及冻存流程
本实验采用密度梯度离心原理（Ficoll密度为1.077，PBMC平均密度为1.072），并通过反复离心洗涤，获得相对较纯的PBMC。
1. 试剂与耗材
DPBS (PH=7.4, GIBCO, C14190)，RPMI 1640 (GIBCO, C22400)，FBS (GIBCO,10099)，Ficoll分离液（LymphoprepTM, 1114740），台盼蓝（Sigma, 117K2332），DMSO(Sigma, D5879-1l)，15ml和50ml Falcon离心管
2. 缓冲液配置
P0：即不含FBS的PBS
R0：即不含FBS的RPMI 1640
R10：即10%FBS的RPMI 1640
冻存液：即含10%DMSO的FBS
所有液体配置后4°Ｃ保存，使用前30分钟平衡至室温。
3. 分离步骤（以每份血样25ml为例）
1) 在分离前30分钟，准备超净台，将缓冲液(P0, R10)和Ficoll分离液复温至室温；每个患者20ml的肝素钠抗凝血（绿色帽管），需要50ml离心管2个，15ml离心管3~4个
2) 登记样本基本信息，姓名，ID号，采血日期；
3) 650g离心7min，30ml血一共可留取3~4ml血浆（2ml ep管 圆底的3管）,以尽量不吸取到红细胞为原则，注意无菌操作，巴斯管不能伸进ep管。
4) 吸取的血浆离心3000rpm，10min，吸取上清。
5) 每位患者需要分装为4管血浆（1.5ml ep管），血清视情况（10ml普通帽管）而定，1.5ml离心管每管1ml；5ml普通管中吸出300~400ul到1.5ml EP管中，标记后和HBV DNA申请单卷在一起，然后把5ml的普通管与雅培申请单卷在一起，送到血清室，反别放入相应的盒子中（盒子在台上或在透明玻璃门冰箱里），血清血浆放到小实验室卧室冰箱中。
6) 在50ml离心管中，加入PBS（2倍稀释），用巴斯管反复混匀剩下的血，倒入离心管中，反复混匀再转移至加入5ml Ficoll分离液的15ml Falcon离心管3或4管（这样的分离效果会均匀一些，避免有一些管PBMC多一些）
7) 个别患者离心完第1步之后可能会呈现云雾状细胞团，吸取PBMC之后吹散即可，离心完第2步之后一定要彻底打散细胞。）
8) 将稀释的血液缓慢加入Ficoll分离液的表面（倾斜45度）；
9) 按程序1离心(800 g，25分钟，室温，加速/减速设置为1)；
10) 轻柔的收集淋巴细胞带置于新的50ml Falcon离心管（1支），并加入PBS至50ml；尽量避免吸到分离液。
11) 按程序2离心(1800 rpm，10分钟，室温，加速/减速设置为9)；
12) 弃去上清，轻弹管底打散细胞沉淀，并将细胞在4ml R10及16ml PBS中重新混悬；
13) 进行细胞计数(吸取20ul 细胞悬液到计数板中，human fresh PBMC，稀释20倍，校正)；等记，每5~8×106个细胞为一管
14) 按程序3进行离心(1500 rpm，10分钟，室温，加速/减速设置为9)；
15) 弃去上清，轻弹管底打散细胞沉淀，按下一步实验要求用冻存液调整细胞浓度或冻存。
4. 冻存步骤
1) 预先配制相应体积的冻存液，置4℃冷却；
2) 在冻存管上标记样本姓名，冻存日期；
3) 接上述第15步，按6~8*106/ml密度计算冻存管数，按1ml/tube添加冻存液；
4) 将添加冻存液的细胞轻柔混匀后，1ml/tube分装至细胞冻存管；
5) 将冻存管置于细胞梯度冻存盒，后者置于-80℃冰箱（4号）；
5. 注意事项
1) 全过程无菌操作，动作轻柔细致；
2) 实验前必须将各种缓冲液和Ficoll平衡至室温，有必要可采用37°C水浴加热；
3) 第6步尽可能将所有PBMC吸取干净而少吸取Ficoll分离液；
4) 计数取样前务必充分混匀以确保计数准确；
5) 添加冻存液后细胞脆性增加，混匀时应该动作轻柔。
6) 冻存盒用了 5 次后应补充异丙醇。使用冻存盒务必先用吸水纸擦干孔的水，以免低温冻存后冻存管与冻存盒粘连，抹掉管上的字迹。使用后在冻存盒试用本登记。