气相色谱法测定基因毒性杂质S-环氧氯丙烷.pdf

广东化工2023年 第16期第50卷 总第498期气相色谱法测定基因毒性杂质气相色谱法测定基因毒性杂质S-环氧氯丙烷环氧氯丙烷张洁，许建良*，姚舒舒(南京正大天晴制药有限公司，江苏 南京210046)摘要目的：建立气相色谱法测定利伐沙班起始物料中卤代烷烃类潜在基因毒性杂质S-环氧氯丙烷。方法：色谱柱AgilentDB-624(30 m0.53 mm，3 m)；升温程序起始温度40，以每分钟5的速率升温至140，维持3 min；进样口温度200；进样量10 L；分流比51；柱流量3.0 mL/min；检测器温度：250。结果：杂质S-环氧氯丙烷质量浓度在5-20 g/mL范围内线性关系良好(r=0.9989)，检测限为0.68 g/mL，定量限为2.27 g/mL，平均回收率为92.60%(RSD=5.0%，n=9)，重复性良好(RSD=4.1%，n=6)。3批利伐沙班起始物料中未检出S-环氧氯丙烷。结论：经方法学验证，本法适用于利伐沙班起始物料中S-环氧氯丙烷的测定。关键词利伐沙班；卤代烷烃类杂质；潜在基因毒性杂质；S-环氧氯丙烷；(S)-(+)-N-(2,3-乙氧基丙基)邻苯二甲酰亚胺；气相色谱法中图分类号TQ文献标识码A文章编号1007-1865(2023)16-0160-03Determination of Genotoxic Impurity S-epichlorohydrin by Gas ChromatographyZhang Jie,Xu Jianliang*,Yao Shushu(Nanjing Zhengda Tianqing Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nanjing 210046,China)Abstract:Objective:To establish a gas chromatographic method for the determination of potential genotoxic impurity S-epichlorohydrin in rivaroxaban startingmaterial.Methods:The chromatographic column was Agilent DB-624(30 m0.53 mm,3 m).The initial temperature of the heating program is 40,and thetemperature rises to 140at a rate of 5per minute for 3 minutes.Inlet temperature 200;Injection volume 10 L;Split ratio 51;Column flow rate 3.0 mL/min;Temperature of detector:250.Results:The concentration of S-epichlorohydrin in the range of 520 g/mL had a good linearity(r=0.9989),the limit of detectionwas 0.68 g/mL,the limit of quantification was 2.27 g/mL,the average recovery was 92.60%(RSD=5.0%,n=9).The repeatability was good(RSD=4.1%,n=6).No S-epichlorohydrin was detected in three batches of rivaroxaban starting material.Conclusion:The method is suitable for the determination of S-epichlorohydrinin rivaroxaban starting material.Keywords:rivaroxaban；halogenated alkane impurities；potential genotoxic impurities；S-epichlorohydrin；(S)-(+)-N-(2,3-ethoxypropyl)phthalimide；gaschromatography利伐沙班(Rivaroxaban)是一种高选择性Xa因子抑制药。Xa因子是第一个负责扩增凝血酶生成的位点，Xa因子的失活可有效抑制凝血酶分子的形成，从而预防静脉血栓的形成，降低深静脉血栓复发和肺栓塞的风险。利伐沙班在对需抗血栓治疗的心房颤动及急性冠状动脉综合征等心血管疾病也有较好的疗效1-4。利伐沙班较其他传统抗凝药物使用更便捷、生物利用度高、无需监测，在临床上应用广泛。基因毒性杂质是指能直接或间接损伤DNA，产生致突变或致癌的物质。根据物质的结构和致癌性，基因毒性杂质可分为基因毒性杂质(Genotoxic Impurities，GTIs)和潜在的基因毒性杂质(Potentially Genotoxic Impurities，PGIs)。基因毒性杂质是指能直接或间接损害DNA，引起DNA突变、染色体断裂、DNA重组及DNA复制过程中共价键结合或插入，导致基因突变或癌症的物质(如烷基磺酸酯类等)。潜在的基因毒性杂质是指结构中含有与基因毒性杂质反应活性相似的基团(如肼类、环氧化合物、N-亚硝胺类等)，即含有警示结构的化合物，通常也作为基因毒性杂质来评估5-6。(S)-(+)-N-(2,3-乙氧基丙基)邻苯二甲酰亚胺(S)-(+)-N-(2,3-ethoxypropyl)phthalimide)，以下简称利伐沙班R4)是利伐沙班合成用重要起始物料7-9，利伐沙班R4合成过程中用到S-环氧氯丙烷(S-epichlorohydrin)，S-环氧氯丙烷结构中含有卤代烷烃基团，具有潜在基因毒性，该物质会残留到利伐沙班R4中，进而影响利伐沙班原料药的质量，需要在利伐沙班R4中进行控制10。气相色谱法(Gas Chromatography)是采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号，从而达到分析检测的目的11。气相色谱法是检测残留溶剂的常用方法，火焰离子化检测器(FID)可以对含有碳原子的液体溶剂产生响应。S-环氧氯丙烷为无色液体，沸点为115，分子结构中含有3个碳原子，因此可以用带有火焰离子化检测器气相色谱进行分析检测。美国食品药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMEA)及人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)颁布了多份基因毒性杂质控制的指导文件，建议以毒理学关注阈值(Threshold ofToxicological Concern，TTC)来控制用药风险，毒理学关注阈值是一个默认值，一个潜在基因毒性杂质的毒理学关注阈值为1.5 g/d12。TTC(g/d)(ppm)=(g/d)基因毒性杂质允许残留量原料药最大日服用剂量基于TTC，以利伐沙班最大日口服剂量0.02 g/d计算，S-环氧氯丙烷在利伐沙班中允许残留的限度为不得过75 ppm。因此，在利伐沙班R4中将S-环氧氯丙烷的残留量控制在此限度以下更为安全。1.利伐沙班(rivaroxaban)；2.邻苯二甲酰亚胺(phthalimide)；3.S-环氧氯丙烷(S-epichlorohydrin)；4.(S)-(+)-N-(2,3-乙氧基丙基)邻苯二甲酰亚胺(S)-(+)-N-(2,3-ethoxypropyl)phthalimide)收稿日期2023-02-15作者简介张洁(1982-)，女，黑龙江大庆人，本科，中级工程师，主要研究方向为药品生产与质量研究。*为通讯作者。2023年 第16期广东化工第50卷 总第498期161本研究建立了直接进样气相色谱法定量测定利伐沙班R4中的S-环氧氯丙烷，该方法较顶空气相色谱法和气相色谱-质谱联用法操作更加便捷，且能降低检测成本13-15。为了充分保证用药安全，S-环氧氯丙烷在利伐沙班R4中的残留限度提高为50 ppm16。经验证，该方法可有效检测利伐沙班R4中残留的S-环氧氯丙烷，为利伐沙班的用药安全提供可靠保证。1仪器与试药仪器与试药1.1仪器气相色谱仪 岛津(Shimadzu)GC2010 Plus氢火焰离子化检测器(FID)；进样器 岛津(Shimadzu)AOC-20i+s；电子天平梅特勒托利多(Mettler Toledo)XSR205DUA精度十万分之一。1.2试药利 伐 沙 班R4(批 号YY19012514、YY20122602、YY21010801)由吴江市协和药业有限公司购买；S-环氧氯丙烷色谱纯(纯度99.5%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇 色谱纯 美国天地(TEDIA)有限公司；二甲基亚砜 色谱纯美国天地(TEDIA)有限公司。2方法与结果方法与结果2.1色谱条件气相色谱柱Agilent DB-624(30 m0.53 mm，3 m)填料：6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷；升温程序：起始温度40，以每分钟5的速率升温至140，维持3 min；进样口温度200；进样量10 L；分流比51；色谱柱流量3.0 mL/min；检测器温度：250。2.2溶液配制空白溶剂：二甲基亚砜供试品溶液：取利伐沙班R4适量，用二甲基亚砜溶解并稀释制成每1 mL约含200 mg的溶液，作为供试品溶液。对照品贮备液：取乙醇和S-环氧氯丙烷各适量，精密称定，分别用二甲亚砜溶解并稀释制成每1 mL约含乙醇100 mg、S-环氧氯丙烷1 mg溶液，作为对照品贮备液。混合对照品溶液：分别取乙醇和S-环氧氯丙烷对照品贮备液适量，加二甲亚砜溶解并稀释制成每1 mL中分别约含乙醇1 mg、S-环氧氯丙烷10 g的混合溶液作为对照品溶液。加标对照品溶液：分别取S-环氧氯丙烷对照品贮备液适量，加二甲亚砜溶解并稀释制成每1 mL中分别约S-环氧氯丙烷5 g(50%)、10 g(100%)和20 g(200%)的溶液作为加标对照品溶液。加标供试品溶液：取利伐沙班R4适量，用各S-环氧氯丙烷加标对照品溶液溶解并稀释制成每1 mL约含200 mg的溶液，作为加标供试品溶液。2.3专属性试验专属性试验主要考察空白溶剂、乙醇(利伐沙班合成用溶剂)和样品对S-环氧氯丙烷检测的干扰情况。取“2.2”项下空白溶剂、混合对照品溶液、供试品溶液和加标供试品溶液，分别进样，记录色谱图。空白溶剂和供试品溶液不干扰S-环氧氯丙烷检测。S-环氧氯丙烷的保留时间为10.698 min，与相邻杂质的分离度均大于1.5。方法专属性良好。1.空白；2.混合对照品；3.供试品溶液图图1专属性试验专属性试验Fig.1Specificity test2.4线性关系考察线性关系考察主要是测试不同浓度的S-环氧氯丙烷与其产生的峰面积的线性关系是否满足既定的要求。精密量取“2.2”项下S-环氧氯丙烷对照品贮备液适量，用二甲基亚砜分别稀释制成每1 mL约含S-环氧氯丙烷5 g、7.5 g、10 g、15 g和20 g的溶液，分别进样，记录色谱图。以S-环氧氯丙烷峰面积A为纵坐标，S-环氧氯丙烷浓度C为横坐标，按最小二乘法进行线性回归，得回归方程：y=1127.5x-1173.4相关系数r=0.9989(接受标准r不小于0.998)。表明S-环氧氯丙烷质量浓度在520 g/mL范围内线性关系良好。2.5检测限和定量限测定检测限和定量限测定主要考察检测器对低浓度的S-环氧氯丙烷产生足够的响应，以信噪比31作为S-环氧氯丙烷的检测限(LOD)，以信噪比101作为S-环氧氯丙烷的定量限(LOQ)。精密量取“2.2”项下S-环氧氯丙烷对照品贮备液溶液适量，用二甲基亚砜稀释制成S-环氧氯丙烷系列浓度溶液，分别进样，记录色谱图。S-环氧氯丙烷的检测限(LOD)为0.68 g/mL，定量限为(LOQ)为2.27 g/mL。2.6回收率试验回收率试验主要考察方法的准确度，通常配制高、中、低3个不同浓度的加标供试品溶液进行测试。取利伐沙班R4(批号：YY19012514)适量，按“2.2”项下制备供试品溶液，作为本底溶液。再分别取利伐沙班R4(批号：YY19012514)适量，用“2.2”项不同浓度的加标对照品溶液溶解并稀释制成每1 mL约含200 mg的溶液，分别作为低(50%)、中(100%)、高(200%)浓度的加标供试品溶液，每个浓度各3份，进样测定，记录色谱图；另取“2.2”项下100%水平加标对照品溶液，进样测定，记录色谱图；按外标法以峰面积计算回收率。在低、中、高浓度溶液中S-环氧氯丙烷回收率平均回收率(n=9)为92.60%，RSD为5.0%，表明本法准确度良好。表表1S-环氧氯丙烷回收率环氧氯丙烷回收率Tab.1S-epichlorohydrin recovery rate浓度回收率平均回收率/%总回收率/%RSD/%低浓度(50%)89.2589.3792.605.089.5889.28中浓度(100%)90.2690.5490.8190.55高浓度(200%)97.5497.9098.1298.042.7精密度、重复性和稳定性试验精密度试验和重复性试验分别考察仪器的进样精密度和平行样品测定结果的重现性。取“2.2”项下100%水平加标对照品溶液，连续进样6次，计算S-环氧氯丙烷峰面积的RSD(n=6)为3.9%。照“2.2”项下100%水平加标供试品液配制方法平行配制6份，进样测定，按外标法以峰面积计算S-环氧氯丙烷的浓度，RSD(n=6)为4.1%。结果表明进样精密度和重复性均良好。稳定性考察主要测试在一定的时间和特定温度内，样品溶液的稳定性。取“2.2”项下对照品溶液和100%水平的加标供试品溶液各1份，室温条件下均分别于0、2、4、6、8、12 h时进样测定。计算2种溶液中S-环氧氯丙烷峰面积的RSD(n=6)分别为2.9%和3.6%；表明对照品溶液、加标供试品溶液在室温下12 h内均稳定。2.8样品测定取3批利伐沙班R4(批号YY19012514、YY20122602、YY21010801)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定；另制备100%加标对照品溶液，进样测定；结果表明3批利伐沙班R4中均未检出S-环氧氯丙烷。广东化工2023年 第16期第50卷 总第498期3讨论讨论3.1检测方法的选择S-环氧氯丙烷为无色液体，沸点为115，分子结构中含有3个碳原子。该化合物沸点不高，碳原子对氢火焰离子化检测器(FID)有响应，所以优选气相色谱法对S-环氧氯丙烷进行检测。3.2色谱条件的选择17-20Agilent DB-624气相色谱柱的填料为6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷。该款色谱柱固定液属中等极性，可分离化合物的种类较多，应用范围较广，所以选择该款色谱柱进行方法开发与验证。S-环氧氯丙烷中含有3个碳原子，为了保证化合物在FID检测器上有足够的响应，采用较大的进样量10 L和较小的分流比51进行测试。S-环氧氯丙烷沸点为115，为了保证其在进样口能够完全气化且在检测器不冷凝，进样口温度选择200，检测器温度选择250。乙醇为利伐沙班R4合成中使用的溶剂，分析方法建立过程中要考察乙醇对S-环氧氯丙烷检测的干扰情况。乙醇的沸点为78.3，为了保证乙醇在色谱柱上能充分保留且与S-环氧氯丙烷有效分离，经优化升温程序为起始温度40，以每分钟5的速率升温至140，维持3 min，柱流量为3.0 mL/min，能够保证乙醇和S-环氧氯丙烷的充分保留和有效分离。4结论结论本方法能够对利伐沙班R4中的潜在基因毒性杂质S-环氧氯丙烷进行有效检测，该方法专属性强，灵敏度高，准确性好，能够满足基因毒性杂质测定的特殊要求，可作为利伐沙班起始物料R4的质量控制方法。参考文献参考文献1杨晴，梁岩利伐沙班预防血栓的研究进展J 心血管病学进展，2022，43(10)：932-9362Nathalie R Wingert，Natlia O dos Santos，Matheus A G Nunes，etalCharacterization of three main degradation products from noveloralanticoagulantrivaroxabanunderstressconditionsbyUPLC-Q-TOF-MS/MSJJournal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2016，123：10-153张蔚然，吴涛利伐沙班的药学机制、临床应用及安全用药影响因素J中国药物滥用防治杂志，2022，28(10)：1358-13614袁冬冬，王亚蕾，张寒娟，等LC-MS/MS法测定中原汉族房颤患者利伐沙班血浆药物浓度J药物分析杂志，2020，40(8)：1399-14045万君玥，陈华，尹婕化学药品中杂质的基因毒性评估策略以及相关分析方法研究进展J药物分析杂质，2022，42(04)：557-5716文海若，闫明，王亚楠，等 药物杂质遗传毒性评价策略与监管研究J 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S-环氧氯丙烷J广东化工，2023，50(16)：160-162)(上接第141页)优的处理效率，我国不同地区的研究者们对人工湿地系统运用到污水处理上的研究取得了丰硕的成果，这些研究成果不仅可以加快人工湿地的进一步推广和应用，而且可为人工湿地在离子型稀土矿区氨氮废水上的应用提供理论基础和可靠的技术支持。4结语结语大量的实践证明，人工湿地对常规污染物均具有较好的去除效果，人工湿地应用到污水的二级处理和深度处理均取得了很好的效果。现在各国的研究者们开始将各种其他污水处理技术耦合到人工湿地系统中来，对人工湿地进行优化升级。同时，在对人工湿地的优化过程中，还以天然湿地作为参考，以达到更好的生态效益。我国对人工湿地的研究起步较晚，但是发展速度非常快，近年已得到大量的推广和应用。人工湿地污水处理技术因其优良的特性，有望成为简单、低成本处理离子型稀土矿区氨氮污水的一种新方法。参考文献参考文献1郑伟强原地浸矿采矿法氨氮对环境影响及控制措施J现代矿业，2015，(8)：161-1642邓振乡，秦磊，王观石，等离子型稀土矿山氨氮污染及其治理研究进展J稀土，2019，40(2)：120-1293潘伟，陈国梁，李青离子型稀土矿区小流域级地表水氨氮治理工程效果分析及建议J有色金属，2021，73(01)：103-1074浦晨霞基质型生态浮床对富营养化水体中氮磷强化净化性能研究D杭州：浙江农林大学，20185郭士林，叶春，李春华，等水位波动对水平潜流人工湿地脱氮效果的影响J中国环境科学，2017，37(3)：932-9406Li L Z，He C G，Ji G D，et alNitrogen removal pathways in a tidal flowconstructedwetlandunderfloodedtimeconstraintsJEcologicalEngineering，2015，81：266-2717吴振斌，王启烁，胡晗，等碳氧调控下人工湿地净化效果的协同与拮抗研究J中国环境科学，2015，(12)：3646-36528Zhang Y，Ji G，Wang RFunctional gene groups controlling nitrogentransformation rates in a groundwater-restoring denitrification 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