DB2302∕T 012-2021 马铃薯试管苗继代培养技术规程(齐齐哈尔市).pdf

ICS 650.020.40 B21 DB2302 黑 龙 江 省 齐 齐 哈 尔 市 地 方 标 准 DB 2302/T 0122021 马铃薯试管苗继代培养技术规程 2021 - 12 - 26 发布 2022 - 01 - 26 实施齐齐哈尔市市场监督管理局 发 布 DB2302/T 0122021 I 目 次 前言 . III 引言 . IV 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 3.1 试管苗 . 1 3.2 脱毒试管苗 . 1 3.3 继代 . 1 3.4 继代培养 . 1 4 材料选择 . 1 4.1 症状学观察 . 2 4.1.1 繁殖材料 . 2 4.1.2 症状学观察 . 2 4.2 类病毒与病毒病检测 . 2 4.2.1 RT-PCR 法检测 . 2 4.2.2 DAS-ELISA 法检测 . 3 4.3 材料选择 . 3 5 培养基制备 . 3 5.1 器材与试剂 . 3 5.2 操作程序 . 3 5.2.1 洗涤 . 3 5.2.2 MS 培养基药品母液配制和保存 . 3 5.2.3 MS 培养基制备 . 3 5.2.4 培养基的分装和灭菌 . 4 6 茎段剪切 . 4 6.1 器材与试剂 . 4 6.2 操作程序 . 4 6.2.1 无菌操作室内消毒杀菌 . 4 6.2.1.1 操作前消毒杀菌 . 4 6.2.1.2 操作中消毒 . 4 6.2.2 茎段剪切 . 4 7 组织培养 . 5 7.1 器材 . 5 7.2 组培条件 . 5 DB2302/T 0122021 II 8 档案管理 . 5 附录 A（规范性附录） MS 培养基配方 . 6 DB2302/T 0122021 III 前 言 本文件按照 GB-T1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由齐齐哈尔市农业农村局归口。 本文件起草单位：黑龙江省农业科学院克山分院。 本文件主要起草人：宋继玲、杨梦平、娄树宝、祝海娟、辛丹丹、刘喜才、孙邦升、刘春生、孙旭红、王 聪、王立春、孔德崴。 DB2302/T 0122021 IV 引 言 由于具有繁殖速度快，生长整齐一致，高产高效、优质、性状稳定和便于运输等优点，马铃薯主要生产国都采用马铃薯试管苗继代培养技术。 黑龙江省农业科学院克山分院自 1978 年借鉴国外先进经验，将马铃薯茎尖组织培养技术应用于马铃薯种质资源保存，从 40 多年的试管苗继代培养工作中不断总结经验，改进技术，建立了一套便捷、快速、安全、污染率极低的继代培养技术，总结出一套马铃薯试管苗继代培养技术规程。 DB2302/T 0122021 1 马铃薯试管苗继代培养技术规程 1 范围 本文件规定了马铃薯试管苗继代培养的术语和定义、材料选择、培养基制备、茎段剪切、组培培养技术要求。 本文件适用于齐齐哈尔地域内马铃薯试管苗继代培养的安全生产与保存。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T29378-2012 马铃薯脱毒种薯生产技术规程 NY/T 401-2000 脱毒马铃薯种薯（苗）检测技术规程方法 NY/T1606-2008 马铃薯种薯生产技术操作规程 NY/T 1962-2010 马铃薯纺锤块茎类病毒检测技术规程方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 试管苗 在组织培养中成苗前的过渡阶段，在试管中培育后逐渐转移移栽或运输。 3.2 脱毒试管苗 经检测确认不带马铃薯 X 病毒(PVX)、马铃薯 Y 病毒(PVY)、马铃薯 S 病毒(PVS)、 马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯 A 病毒（PVA） 、马铃薯 M 病毒（PVM）和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的试管苗。 3.3 继代 愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，须转移到新鲜培养基上培养的过程叫做继代。 3.4 继代培养 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。 DB2302/T 0122021 2 4 材料选择 采用田间症状学观察与DAS-ELISA法检测、RT-PCR法检测相结合的方法。 4.1 症状学观察 4.1.1 繁殖材料 每份待观察马铃薯试管苗均扩繁 10 株， 并编号。 5 月上旬于温室内假植， 6 月上旬定植于防虫网棚。每份马铃薯试管苗种植 1 行，行距 60cm，株距 30cm。每隔 5 行马铃薯试管苗种植 1 行当地主栽品种的脱毒种薯为对照。田间管理同当地网棚管理相同。 4.1.2 症状学观察 生育期间观察每份马铃薯试管苗生长发育状况。 当马铃薯被病毒和类病毒致病因子侵染后， 在马铃薯的叶片、整体植株、块茎上可观察到特有的症状（见表 1） 。种植的试管苗出现表 1 中的任一症状，为非生理性原因表现的异常， 将该份试管苗淘汰。 未出现由病毒病和类病毒致病因子引起的症状试管苗进行类病毒与病毒病检测。 表 1 马铃薯由病毒病和类病毒致病因子引起的症状 症状表 现部位 症状类型 症状描述 叶片 颜色异常 1、明脉(叶脉颜色比正常的浅)；2、花叶或斑驳；3、黄化；4、异常着色。 形状、 大小或结构的异常 1、小叶（叶片与健康植株比，明显变小） ；2、卷叶；3、皱缩，4、革质叶片。 叶片坏死 1、顶端坏死（主茎和分支顶部先坏死） ；2、系统坏死（有坏死的条斑、斑点或环斑分布于全部或部分叶片上） ，3、叶脉坏死 植株 植株整体异常 1、矮缩（比健康的植株小，且叶或茎出现某些畸形） ；2、矮化(植株株型变小，不表现畸形)；3、衰弱（植株茎秆十分细弱，匍匐于地面） ；4、簇生（叶片小而严重皱缩，并沿着茎紧密地生长在一起） ；5、丛枝（主茎上的腋枝增生） 块茎 块茎畸形 1、纺锤形块茎；2、过长（块茎比健康植株的块茎明显变长） ；3、气生薯；4、过度生长（块茎芽眼胀大或在大块茎上长出小块茎） ；5、开裂。 块茎坏死 1、坏死斑（块茎表面形成大小各异，深而干燥圆型病斑） ，2、网状坏死（在块茎内部形成网状坏死线） ；3、内部坏死（在块茎内部形成环状或不规则形状坏死点或斑） 。 4.2 类病毒与病毒病检测 DB2302/T 0122021 3 4.2.1 RT-PCR 法检测 首先检测马铃薯试管苗类病毒（PSTVd） ，检测按 NY/T 1962-2010 马铃薯纺锤块茎类病毒检测技术规程方法执行。检测结果为阳性试管苗淘汰，检测结果为阴性试管苗进行病毒病检测。 4.2.2 DAS-ELISA 法检测 马铃薯 X 病毒 （PVX） 、马铃薯 Y 病毒（PVY） 、马铃薯 S 病毒（PVS） 、马铃薯 M 病毒（PVM） 、马铃薯卷叶病毒（PLRV） 、马铃薯 A 病毒（PVA）检测按 NY/T 401-2000 脱毒马铃薯种薯（苗）检测技术规程方法执行。检测结果任一病毒病呈阳性试管苗淘汰，检测结果全阴性试管苗留存。 4.3 材料选择 选择田间无病毒和类病毒致病因子引起的症状、 类病毒与病毒病检测全阴性试管苗， 肉眼观察试管内植株与根系健康、无污染，植株为 5cm以上试管苗作为核心基础苗。 5 培养基制备 5.1 器材与试剂 高压蒸气灭菌锅、蒸馏水器、锅、试管、烧杯、量筒、酸度计、电炉子、天平、pH 试纸、琼脂或卡拉胶、硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、碘化钾、钼酸钠、氯化钴、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、维生素 B1、维生素 B6、甘氨酸、菸酸、肌醇、蔗糖或白砂糖。 5.2 操作程序 5.2.1 洗涤 继代培养使用的各种用具、器皿必须清洗干净后才能使用。新购置的玻璃器皿使用前，用肥皂水洗净，清水冲洗 3 遍，干后备用。已用过的玻璃器皿，先将器皿中的残渣除去，用热的肥皂水浸泡 1h 后洗净，清水冲洗 3 遍，达到瓶壁水珠分布非常均匀，透明感强，干后备用。 5.2.2 MS 培养基药品母液配制和保存 一般配制成比所需浓度高 10100 倍的母液，用时按比例稀释。母液的配制有两种方法，一种方法是将母液配制成单一化合物母液，另一种方法是配制成混合溶液。在配制大量元素无机盐母液时，要防止在混合各种盐类时产生沉淀，为此各种药品必须在分别充分溶解后再按附表 A 药品顺序混合。另外，在混合各种无机盐时，其稀释度要大，慢慢地混合，同时边混合边搅拌。铁盐必须单独配制，因为与其他母液混合容易产生沉淀。配制母液成分见附表 A。配制好的母液分别贴上标签，注明母液号、日期及配制 1L 培养基所取量。室温储存即可，冰箱 4储存最佳，如发现有霉菌和沉淀产生，停止使用。 5.2.3 MS 培养基制备 DB2302/T 0122021 4 首先将储存的药品母液按顺序排好，再将各种玻璃器皿、量筒、烧杯等放在指定的位置备用。称量所需的琼脂或卡拉胶、蔗糖或白砂糖。准备好试管塞或组培瓶盖等。(1)按母液顺序,根据母液的不同倍数量取规定的量。(2)用量杯量出配制培养基所需蒸馏水的 4/5，将称好的琼脂或卡拉胶倒人锅内加热，边加热边搅动，使琼脂或卡拉胶充分溶解，继续加热到沸腾后加入称量好的药品母液和蔗糖或白砂糖，加入量见附录 A，最后用蒸馏水定容至所需体积。(3)调节培养基 pH 值，用酸度计检验 pH 值小于 5.8时，用滴管滴加 5%NaOH，pH 值大于 5.8 时滴加 1mol/L 盐酸溶液，将 pH 值调至 5.8 为宜，培养基配制完毕。 5.2.4 培养基的分装和灭菌 配制好的培养基趁热分装。 分装时注意不要将培养基沾到容器壁上, 以免引起污染。 试管分装 8ml15ml/管后盖试管塞，组培瓶分装 30ml50ml/瓶，然后用组培瓶盖等封口，放入高压灭菌锅 120灭菌15min。灭菌后取出冷却待用。 6 茎段剪切 6.1 器材与试剂 超净工作台、紫外灯、酒精灯、剪刀、组培钩或长镊子、90%酒精、酒精蘸缸、75%酒精脱脂棉、火柴、苯扎溴铵。 6.2 操作程序 6.2.1 无菌操作室内消毒杀菌 6.2.1.1 操作前消毒杀菌 6.2.1.1.1 熏蒸无菌室 间隔 2 个月以上未使用的无菌操作室进行熏蒸消毒，熏蒸消毒使用二氧化氯空间消毒剂。 6.2.1.1.2 紫外线消毒杀菌 将工作服、口罩、工作鞋、酒精蘸缸、剪刀、酒精灯、组培钩或长镊子、火柴、基础苗等无菌室所需物品放在无菌室固定位置，启动超净工作台，开启杀菌，并将室内紫外线灯打开消毒，工作人员快速离开无菌室。紫外线杀菌 30min 后关闭紫外线灯开启通风，15min 后工作人员方可进入。 6.2.1.2 操作中消毒 工作人员洗手后按无菌操作程序进人无菌室，穿戴好消毒服装，就座于无菌操作台前，拉开无菌操作台玻璃门使门下边缘距操作台面25cm30cm，用75%酒精棉将双手消毒，再用75%酒精棉擦拭剪刀、组培钩或长镊子及超净工作台面，用火柴点燃酒精灯，将剪刀、组培钩或长镊子在酒精蘸缸中蘸取90%酒精燃烧消毒，然后进行切段工作，每次使用工具放置到台面前都应蘸取90%酒精燃烧消毒。 6.2.2 茎段剪切 DB2302/T 0122021 5 在点燃的酒精灯附近取掉试管塞或组培瓶盖， 使试管或组培瓶口稍倾斜距酒精灯灯芯 0.5cm处， 用手轻轻转动试管或组培瓶，将试管或组培瓶口边缘消毒，然后放在超净工作台的酒精灯附近，再取掉基础苗的试管塞或组培瓶盖，用同样的方法在酒精灯上进行消毒，注意防止烧伤试管苗。拿起消过毒的组培钩或长镊子将基础苗取出 2/3，手握试管或组培瓶根部上扬使试管苗顶部悬于培养基容器上方，基础苗试管口或组培瓶口与新培养基容器口呈 45角为宜。用剪刀将基础苗剪成若干段带一片小叶的“上短下长”茎段，用组培钩或长镊子将“下长”端插入培养基内，一般每管可插 15 个茎段，每瓶可插1060 个茎段。 将新继代的试管或组培瓶口稍倾斜至酒精灯灯芯 0.5cm 处用手轻轻转动试管或组培瓶，将试管或瓶口边缘消毒， 试管塞或组培瓶盖在酒精灯上消毒后封口， 然后在试管或组培瓶外壁上注明名称、继代日期及操作者。 7 组织培养 7.1 器材 培养室、培养架、组培灯、空调、臭氧机。 7.2 组培条件 把继代的试管苗送到培养室，置于组培架上培养。培养室温度 1822，每天光照 16h，光照强度 2000lx3 000lx，相对湿度 45RH65%。继代 3d4d 后开始每日巡视试管苗，如果发现有污染的试管苗，立刻将其移出培养室。健康的试管苗 25d30d 可再继代或作为扦插用苗，如做保存试管苗可培养 34 个月再用于继代培养的基础苗。组培室每 3d4d 使用臭氧机消毒 2h。 8 档案管理 建立马铃薯试管苗继代培养技术档案，内容包括：症状学观察数据；RT-PCR法检测和DAS-ELISA法检测结果；培养基制备、茎段剪切和组织培养的日期、数量、操作人员、污染率等，档案至少保存2年以上。 DB2302/T 0122021 6 A A 附 录 A （规范性附录） MS 培养基配方 母液序号 成份 使用浓度(mg/L) 扩大倍数 扩大后重量 1 硝酸铵 NH4NO3 1650 20 33g 加蒸馏水溶解后定容至1000ml， 配制 1L 培养基取母液 50ml 硝酸钾 KNO3 1900 20 38g 磷酸二氢钾 KH2PO4 170 20 3.4g 硫酸镁 MgSO4.7H2O 370 20 7.4g 氯化钙 CaCl2.2H2O 440 20 6.6g 2 硫酸亚铁 FeSO2.7H2O 27.8 200 5.57g 加蒸馏水溶解后定容至1000ml， 配制 1L 培养基取母液 5ml 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 Na2.EDTA 37.3 200 7.45g 3 碘化钾 KI 0.83 100 83mg 加蒸馏水溶解后定容至200ml，配制 1L 培养基取母液 2ml 钼酸钠 Na2MoO4.2H2O 0.25 100 25mg 硫酸铜 CuSO4.5H2O 0.025 100 2.5mg 硫酸锰 MnSO4.H2O 22.3 100 2.23g 硫酸锌 ZnSO4.7H2O 8.6 100 860mg 氯化钴 CoCl2.6H2O 0.025 100 2.5mg 硼酸 H3BO3 6.2 100 620mg 4 盐酸硫胺素 VB1 0.4 100 40mg 分别加蒸馏水溶解后定容至 200ml，配制 1L 培养基各取母液 2ml 5 盐酸吡哆辛 VB6 0.5 100 50mg 6 甘氨酸 N2NCH2COOH 2 100 200mg 7 菸酸 NC5H4COOH 0.5 100 50mg 8 肌醇 C6H12O6 10 100 1g 蔗糖或白砂糖 30g/L 琼脂或卡拉胶 79g/L PH 5.8 _