牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺优化及膜法分离纯化.pdf

邹平，徐莹，陈文涛，等.牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺优化及膜法分离纯化 J.食品工业科技，2023，44（18）：258267.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100241ZOU Ping,XU Ying,CHEN Wentao,et al.Optimization of Extraction Process and Purification of Flavonoids from Peony Seed Mealby Membrane MethodJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):258267.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100241 工艺技术 牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺优化及牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺优化及膜法分离纯化膜法分离纯化邹平，徐莹，陈文涛，张迎阳，徐荣*（常州大学石油化工学院，江苏常州 213164）摘要：本研究采用微滤-纳滤二级膜分离的方法对牡丹籽粕中的黄酮类化合物进行分离提纯。通过单因素实验研究料液比、提取温度、乙醇体积分数和提取时间对总黄酮提取量的影响，在单因素的基础上采用响应面法对提取工艺进行优化及验证。选用聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚醚砜（PES）、聚四氟乙烯（PTFE）、聚丙烯（PP）、混合纤维素（MCE）、聚丙烯腈（PAN）、水系醋酸纤维（CA）和聚酰胺（PA）8 种材料微滤膜对牡丹籽粕黄酮类化合物（PSMF）提取液进行初级分离。纳滤膜为实验室自制的有机硅/PA 复合膜。结果表明，PSMF 最佳的提取条件为料液比1:15 g/mL，提取温度50，乙醇体积分数为70%，提取时间为30 min，PSMF 提取量为（240.282.25）g/mL。将粗提液稀释 10 倍用于比较 8 种不同微滤膜对于 PSMF 粗提液的过滤效果，发现 PA 膜具有较好的分离效果，复合膜对 PSMF 存在较好的纯化效果，且分离后黄酮水溶性提升至 90%以上。经过 800 煅烧之后，原料液的残余质量为 1.43%，PA 膜分离液的残余质量为 0.76%，BTESE/PA 复合膜降至 0.26%，杂质更少纯度较高。对比其分离前后的抗氧化活性，分离后的OH、DPPH清除率以及还原力有所提升，O2清除率由 79.94%下降至 64.82%。本研究对牡丹籽粕中的活性成分进行分析，PSMF 是一种新型的植物黄酮资源，组成丰富，具有一定的研究空间。关键词：牡丹籽粕，黄酮类化合物，膜分离，液-质联用，抗氧化活性本文网刊:中图分类号：TS201.2 文献标识码：B 文章编号：10020306（2023）18025810DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100241OptimizationofExtractionProcessandPurificationofFlavonoidsfromPeonySeedMealbyMembraneMethodZOUPing，XUYing，CHENWentao，ZHANGYingyang，XURong*（School of Petrochemical Engineering,Changzhou University,Changzhou 213164,China）Abstract：In this study,the flavonoids in peony seed meal were separated and purified by microfiltration-nanofiltrationsecondary membrane separation method.The effects of material-liquid ratio,extraction temperature,ethanol volume fractionand extraction time on the extraction amount of total flavonoids were investigated by single-factor experiments,and theextraction process was optimized and validated by response surface methodology on the basis of single factors.Eight typesof microfiltration membranes,including polyvinylidene fluoride(PVDF),polyethersulfone(PES),polytetrafluoroethylene(PTFE),polypropylene(PP),mixed cellulose(MCE),polyacrylonitrile(PAN),aqueous acetate(CA)and polyamide(PA),were selected for the primary separation of PSMF extracts.The nanofiltration membranes were homemade organosilicon/PA composite membranes in the laboratory.The results showed that the optimum extraction conditions for PSMF were1:15 g/mL,50,70%ethanol volume fraction,30 min,(240.282.25)g/mL of PSMF extraction amount.The PAmembrane had a better separation effect,and the composite membrane had a better purification effect on PSMF,and the 收稿日期：20221024 基金项目：常州市科技计划（CE20225057）；江苏省科技项目（BY2021215）。作者简介：邹平（1985），男，博士，讲师，研究方向：食品加工与保藏，E-mail：。*通信作者：徐荣（1983），男，博士，副教授，研究方向：反渗透和渗透汽化膜过程及有机硅膜材料，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 water solubility of flavonoids was increased to more than 90%after separation.After calcination at 800,the residualmass of the raw material solution was 1.43%and that of the PA membrane separation was 0.76%,and the BTESE/PAcomposite membrane was reduced to 0.26%,with fewer impurities and higher purity.Comparing its antioxidant activitybefore and after separation,the OH,DPPH scavenging rate and reducing power were improved after separation,and theO2 scavenging rate decreased from 79.94%to 64.82%.In this study,the active components in peony seed meal wereanalyzed.PSMF would be a novel phytoflavonoid resource with rich composition and certain research space.Keywords：peony seed meal；flavonoids；membrane separation；liquid-mass spectrometry；antioxidant activity 牡丹籽榨油后的残渣即牡丹籽粕通常被随意堆放、丢弃或用作肥料、动物饲料等，综合利用率极低已被用来研究蛋白和多肽1，但对其中存在的黄酮类化合物研究很少。有机溶剂萃取法2成本较低，操作简单，提取效率较高，且所用有机溶剂安全无毒副作用，适合工业生产中提高生产率降低成本。徐莹等3采用 75%乙醇-水（v/v）提取橄榄仁红皮的类黄酮化合物，提取物对 DPPH、OH 以及 ABTS+有较高的清除率。LU 等4使用 90%的甲醇优化了凤丹牡丹总黄酮的提取工艺，凤丹牡丹总黄酮具有显著的抗氧化、美白和抑菌效果，但甲醇具有毒性，会对人体呼吸道黏膜和视力造成损伤，而且甲醇易燃易挥发，因此高纯度的甲醇具有一定的安全隐患。JI 等5采用超声辅助乙醇/磷酸二氢钠混合液萃取银耳中的总黄酮，最大提取量为 0.158 mg/g，与单一的乙醇溶液相比，提取量大大降低。这表明选用合适浓度的乙醇-水溶液作为牡丹籽粕总黄酮的萃取液不仅操作简单且提取量高，但在提取过程中一些醇溶性的杂质也会随之被萃取出来，因此将提取液进行分离，期望得到杂质更少，纯度较高的黄酮提取物。近 20 年来迅速发展的膜分离技术是当代新型高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有节能、高效、过程易控、环境友好等特点。膜分离方法不需要经过相变或添加辅助剂，仅通过控制膜的孔径提取目标产物，十分节能环保。QUIROS 等6采用集成膜工艺，从酿酒厂和橄榄厂废料中分离回收了黄酮多酚。KHEMAKHEM 等7通过微滤、超滤、纳滤结合的方法成功从橄榄叶中提取出橄榄苦苷，相较于橄榄叶中含量提高了约 10 倍，并发现其具有较好的总抗氧化能力和三价铁离子还原能力。目前，植物中黄酮类物质的提取分离工艺已经相当成熟，但仍存在选择性差，污染环境，工业应用成本高等缺点。因此，本研究尝试将现有的提取工艺与高新技术相结合，建立基于几种分离提取方法的连续分离提取设备，使提取过程更加高效、安全、无污染，使黄酮类化合物成为一种优质的自然资源，得到更广泛的应用。将牡丹籽粕黄酮（PSMF）应用到医药保健8、食品加工9、化妆品生产等行业，深入研究其健康价值，不仅可以促进相关研究机构成果转化，还能有效推动当地种植业发展，带动农民增收，具有显著的社会效益，为 PSMF 的提取、纯化及高值化综合开发应用提高了参考价值。本论文以牡丹籽粕为研究对象，采用乙醇-水溶液进行萃取，在单因素的基础上通过响应面分析方法得到 PSMF 最佳提取工艺，采用不同种类微滤膜进行分离，将分离前后活性物质进行比较，采用 LC-MS 技术对最优条件下提取液中黄酮类化合物进行分析，为进一步开展植物黄酮的研究和开发应用打下基础。1材料与方法 1.1材料与仪器油牡丹籽粕中国江苏国色天香油用牡丹科技发展有限公司；芦丁、1,2-双（三乙氧基硅基）乙烷阿拉丁试剂有限公司；无水乙醇上海沃凯生物技术有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚 上海凌峰化学试剂有限公司；氯化铝六水、30%过氧化氢、福林酚试剂、去离子水（H2O）、氢氧化钠、硫酸亚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、水杨酸、邻苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗坏血酸（Ascor-bic acid，Vitamin C，VC）、邻二氮菲、盐酸、氯化硝基四氮唑兰（NBT）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）国药集团化学试剂有限公司；上述实验试剂均为分析纯。721N 可见光分光光度计上海仪电分析仪器有限公司；MDF-U5412 低温冰箱三洋电机株式会社；SHB-A 循环水式真空泵上海聚昆仪器设备有限公司；DF-数显集热式磁力搅拌器金坛市杰瑞尔电器有限公司；UV-3600 紫外可见近红外分光光度计日本岛津公司；ATY224 精密电子天平常州万泰天平仪器有限公司；Tissuelyser-48 高通量组织破碎仪上海净信实业发展有限公司；Q Exactive质谱仪、Reacti-thermo 氮气吹扫仪美国 ThermoFisher Scientific 公司；Acquity 高效液相色谱仪美国 Waters 公司；XH-T 漩涡混合器金坛区白塔新宝仪器厂。1.2实验方法 1.2.1 牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺将牡丹籽粕粉碎过 80 目筛，选择乙醇-水（v/v）溶液作为溶剂对牡丹籽粕中的天然黄酮类化合物进行浸提，将浸提液离心取上清液，上清液浓缩后在40 冻干保存，将冻干粉研磨可得到 PSMF 冻干粉末。1.2.2 总黄酮含量测定总黄酮标准曲线的绘制：取 3 mL 芦丁对照品溶液置于 10 mm 比色皿，再加入 5 mL 1%AlCl3溶液，摇匀后静置 10 min，以吸光第 44 卷 第 18 期邹平，等：牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺优化及膜法分离纯化 259 度值（y）为纵坐标，芦丁含量（x）为横坐标，在 415 nm处测定吸光度并绘制标准曲线图。吸光度值与的浓度呈良好的线性关系，回归方程为：y=(0.032.01E4)x+(0.010.006)，R2=0.999 4。取 200 L 样品溶液加 30%乙醇-水（v/v）溶液定容至 5 mL 再加入 5 mL1%AlCl3溶液，摇匀后静置 10 min，在 415 nm 处测定吸光度，可根据公式（1）计算出样品液中总黄酮含量。CPSMF=(A0.01)n0.03式（1）式中，A、n 分别代表样品吸光度和稀释倍数。1.2.3 单因素实验称取 1.0 g PSMF 粉末，固定提取时间 30 min、乙醇体积分数 70%、提取温度 50，改变料液比（m 牡丹籽粕:V 乙醇）1:5、1:10、1:15、1:25、1:50 g/mL；固定料液比 1:15 g/mL、乙醇体积分数 70%、提取温度 50，改变提取时间 10、20、30、40、50 min；固定料液比 1:15 g/mL、提取时间30 min、提取温度 50，改变乙醇体积分数 40%、50%、60%、70%、80%；固定料液比 1:15 g/mL、提取时间 30 min、乙醇体积分数 70%，改变提取温度40、50、60、70、80 进行单因素实验，对总黄酮类化合物进行提取并使用紫外分光光度计对 PSMF 含量进行计算。1.2.4 响应面优化总黄酮提取工艺响应面试验的因素水平取值由单因素实验得出，选择提取时间、提取温度、乙醇体积分数和料液比为影响因子，以黄酮提取量为响应值（见表 1），利用 Design-Expret 8.0.6软件分别对牡丹籽粕进行曲面响应试验，共 29 个试验点。得到二元多项式回归方程，进行重复实验。表 1 响应面试验因素水平设计Table 1 Level of response surface experimental factors水平因素A料液比（g/mL）B提取时间（min）C乙醇体积分数（%）D提取温度（）11:520604001:1530705011:25408060 1.2.5 黄酮类化合物的分离纯化 1.2.5.1 微滤膜分离由于牡丹黄酮提取物中所含成分较多，本研究采用双层滤纸对粗提液进行预处理，以尽量除去固体悬浮物等物质，延长微滤膜的使用寿命，减轻膜的污染。微滤选用微孔膜，平均孔径0.02 m，能够截留直径 0.0510 m 的微粒或分子量大于 1000 Da 的物质。根据滤膜材质，将聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚醚砜（PES）、聚四氟乙烯（PTFE）、聚丙烯（PP）、混合纤维素（MCE）、聚丙烯腈（PAN）、水系醋酸纤维（CA）和聚酰胺（PA）微滤膜分为水系微滤膜、有机系微滤膜和混合系微滤膜三类。水系滤膜系列包括：CA10（用于乳清和果汁的分离时）、MCE、PES11（具有良好的分子稳定性、优异的机械性能和成膜性能，去除天然存在的有害有机物）等。常用有机系微孔膜：PTFE12（已用于膜蒸馏、油水分离和气固分离等多种分离工艺，是目前最常见的膜分离材料）、PVDF（具有出色的化学、热和机械稳定性13，有利于在不同分离条件下进行有机物的纯化）。混合滤膜过滤：PA14（具有优异的分离性能，耐高温，聚酰胺树脂是一种从植物中分离黄酮的有效吸附剂）、改性的聚偏氟乙烯、改性的聚四氟乙烯膜等。因此选用 PVDF、PES、PTFE、PP、MCE、PAN、CA 和 PA 这 8 种材料微滤膜对处理液进行分离。根据 8 种微滤膜通量、水接触角以及 PSMF 透过液冻干粉的扫描电镜、热重等表征确定分离效果最佳的微滤膜。在操作压力为 0.8 MPa，操作温度为 25，流量为 9.99 mL/min 的条件下，对膜进行预压 30 min 后测定膜通量，根据公式（2）计算膜通量。J=WTA式（2）式中，J 代表膜通量（kg/（m2h）；W 代表过膜液质量（kg）；T 代表取样时间（h）；A 代表膜的有效面积（m2）。1.2.5.2 纳滤膜分离纳滤分离膜为实验室自制，选择 PA 膜为支撑体，采用 1，2-二（三乙氧基甲硅烷基）乙烷（BTESE）作为硅源前驱体，正丙醇为溶剂，以盐酸为催化剂，制备了有机硅聚合溶胶。通过超声喷涂法将有机硅溶胶涂覆在 PA 撑体上制备 BTESE/PA复合膜，对 PSMF 溶液进行纳滤膜分离。1.2.6 微滤膜、溶胶和纳滤复合膜的结构表征 1.2.6.1 扫描电镜分析分离膜在观察前样品进行喷金处理，采用德国-蔡司 SUPRA55 场发射扫描电镜（SEM）观察 BTESE 有机硅复合膜的表面和断面形貌。1.2.6.2 热重分析仪分析采用热重分析仪（NETZSCH，209F3）对 PSMF 溶液、PA 透过液和 BTESE/PA 复合纳滤膜透过液的热稳定性进行表征，升温速率为10 min1，温度范围为50800，在N2氛围下操作。1.2.6.3 液-质联用组分分析基于液-质联用（LC-MS）非靶向的方式进行检测15，重复 3 次，所得到的数据供生物信息学分析，最终得出代谢物。采用Thermo 超高效液相系统（Vanquish，USA），根据化合物的性质，采用 Hyper ODS2 C18 填料，进样量 10 L，流速 0.9 mL/min，柱温 40，流动相 A 为 85%甲酸-水（v/v）溶液，流动相 B 为去离子水溶液。质谱采用的是美国 Thermo 公司的 Qexactive 高分辨质谱检测系统。1.2.7 黄酮类化合物抗氧化能力测定 1.2.7.1 DPPH清除能力测定DPPH清除能力测定实验参照文献 16，稍作改进。样品为 2 mL PSMF 溶液（50、100、150、200、250 g/mL）和2 mL 0.1 mmol/L 260 食品工业科技2023 年 9 月DPPH溶液（95%乙醇溶解）。空白为 95%乙醇 2 mL+0.1 mmol/L DPPH 2 mL。室温下避光反应 30 min，在波长为 517 nm 处测定吸光度。DPPH清除率根据式（3）计算。DPPH清除率(%)=(A0A样)A0100式（3）式中，A样、A0分别代表样品和空白的吸光度。1.2.7.2 OH 清除能力测定OH 清除能力测定实验方法参照文献 17，稍作改进。混合液由 4 mL1,10-邻菲咯啉（5 mmol/L）和 4 mL FeSO4（5 mmol/L）组成，然后依次加入 3 mL 磷酸盐缓冲液（16 mL0.2 mol/mL 磷酸二氢钠+84 mL 0.2 mol/mL 磷酸氢二钠配制，pH7.4），3 mL H2O2（0.01%）和 4 mL PSMF样品液，摇匀后静置 1 h，在 536 nm 处测量吸光度。对照组用蒸馏水代替 PSMF 溶液，其他试剂与样品相同。空白组用蒸馏水代替过氧化氢，其他试剂与样品相同。根据式（4）计算OH 清除率。OH清除率(%)=(A样A损)(A0A损)100式（4）式中，A样、A损和 A0分别代表样品、对照和空白的吸光度。1.2.7.3 O2清除能力测定按照文献 18 修改如下，取 1.5 mL 样品液，再分别按顺序加入 0.5 mL0.30 mmol/L NBT（pH8.0 Tris-HCl 配制）、0.5 mL0.468 mmol/L NADH（pH8.0 Tris-HCl 配制）和0.5 mL0.060 mmol/L PMS（pH8.0 Tris-HCl 配制），混合均匀后在 25 水浴 5 min。测定其波长在 560 nm 处的吸光度，O2清除率计算方程式为：O2清除率(%)=(A0A样)A0100式（5）式中，A样和 A0分别代表样品和空白的吸光度。1.2.7.4 还原力测定按照文献 19，取 1.5 mL 样品液，再分别按顺序加入 1 mL 0.20 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH8.0 Tris-HCl 配制）、1 mL 1%氰化钾 1 mL，混合均匀后在 50 水浴 20 min，快速冷却后加10%三氯乙酸（TCA），3000 r/min 离心后取上清液1.5 mL，加入 1.5 mL 蒸馏水和 0.4 mL 0.1%氯化铁溶液，反应 10 min。测定 700 nm 处的吸光度，还原力强弱反应在吸光值上。1.2.7.5 半抑制浓度计算按照公式（6）计算 IC50值：lgIC50=XmIP(3PmPn)4式（6）式中，Xm代表样品最大浓度的对数；I 代表样品最大浓度与样品相邻浓度之比的对数；P、Pm和Pn分别代表样品浓度之和、样品最大浓度和样品最小浓度（g/mL）。1.3数据处理采用 Origin 9.0 对提取实验和单因素实验数据进行处理；利用 Design-Expert 8.0.6 对响应面优化测试数据进行分析。2结果与分析 2.1单因素实验结果PSMF 提取量的提取受到料液比、提取时间、乙醇体积分数以及提取温度的影响，各因素对其影响关系通过单因素实验表明。按照 1.2.1 中条件进行实验，得到结果如图 1 所示。1:1001:201:301:401:50120160200240cdbbbeaa提取量(g/mL)料液比(g/mL)baaA1020304050180200220240260B提取量(g/mL)dcb提取时间(min)4050607080160180200220240DC提取量(g/mL)edc乙醇体积分数(%)4050607080160180200220240edc提取温度()提取量(g/mL)图 1 料液比、提取时间、乙醇体积分数和提取温度对PSMF 提取量的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio,extraction time,ethanolvolume fraction and extraction temperature on theextraction amount of PSMF注：不同小写字母表示差异显著，P0.05。第 44 卷 第 18 期邹平，等：牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺优化及膜法分离纯化 261 如图 1A 所示，不同小写字母表示 PSMF 的提取量在不同料液比时的差异显著（P0.05），提取量随着浸提溶剂量的增加而减少。由于 PSMF 具有易溶于乙醇的性质，所以在料液比较小的时候，溶液中的黄酮类化合物很快溶出达到饱和20。考虑到随着浸提溶剂体积的增加，也会增大浓缩工艺的难度，因此浸提溶剂量不宜过大，采用料液比为1:15 g/mL 最为合适。如图 1B 所示，不同小写字母表示 PSMF 的提取量在不同提取时间时的差异显著（P0.05），提取时间在 30 min 时，提取量达到峰值（234.841.17）g/mL，超过 30 min 有所下降，可能是由于时间的延长，黄酮类化合物中酚羟基结构遭到破坏分解为杂质，导致提取量下降。如图 1C 所示，不同小写字母表示 PSMF 的提取量在不同乙醇体积分数时的差异显著（P0.05），黄酮类物质为典型的有机化合物，易溶于有机试剂21，因而提高乙醇体积分数，总黄酮的提取量也会随之升高，但过高的乙醇体积分数导致大量有机杂质被溶出并挤占黄酮分子的溶出空间，从而导致活性有所下降。最终萃取剂选择为 70%乙醇-水（v/v）溶液。如图 1D 所示，不同小写字母表示 PSMF 的提取量在不同提取温度时的差异显著（P0.05）。由于黄酮类化合物中含有酚羟基结构，适当的温度可以激活羟基自由基活性，但过高的温度会使其氧化分解，50 后黄酮类化学物的结构遭到破坏，导致提取量降低。最终提取温度选择 50。由单因素实验结果可知 PSMF 提取的最佳条件为料液比 1:15 g/mL，提取温度 50，乙醇体积分数70%，提取时间 30 min，PSMF 提取量最高为（234.841.17）g/mL。2.2响应面试验结果利用 Design-Expert 软件对回归模型进行方差和显著性分析，结果如表 2、表 3 所示。利用 Design-Expert 软件进行多元次拟合分析，得出 PSMF 提取量与料液比、提取时间、乙醇体积分数以及提取温度为变量的相关回归方程为：Y=238.86+8.41A2.55B+2.57C+4.46D5.64AB+5.14AC1.94AD+9.15BC+5.64BD10.44CD53.32A253.10B251.13C253.12D2由表 3 可知，模型的 P0.0001，表明该模型具有极显著性，失拟项 P 值为 0.5600，因而该模型拟合程度较好，实验误差小，可用此模型对 PSMF 进行预测和分析。在这种情况下，A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、D2对响应值具有极显著影响（P0.01），C2对响应值具有显著性影响（P0.05）。PSMF 与料液比、提取时间、提取温度和乙醇体积分数的等高图和 3D 响应面见图 2。将所得结果利用 Design-Expert 软件进行响应面预最优点预测，得到料液比 1:15 g/mL，提取温度50，乙醇体积分数 70%，提取时间 30 min，预测PSMF 提取量（240.282.25）g/mL。2.3微滤膜对 PSMF 的分离纯化效果 2.3.1 8 种材料微滤膜膜通量分析膜通量指单位 表 2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results实验号A料液比B提取时间C乙醇体积分数D提取温度Y：PSMF提取量（g/mL）11001117.2121010151.8630000240.2840101136.9851001144.1660000239.5670011147.3481010134.1290000239.38100101132.85111001131.13121010124.44130011131.06141100148.68151100127.09161100132.25170110121.19180101139.61190011142.37200000237.43210011116.88220110145.11231001137.98240101121.17251100120.97261010127.27270000237.67280110142.85290110130.16 表 3 回归模型的方差分析及显著性结果Table 3 Analysis of variance and significance results ofthe regression model项目平方和自由度均方差F值P值显著性模型48328.22143452.022262.150.0001*A849.071849.07556.410.0001*B77.98177.9851.100.0001*C79.21179.2151.910.0001*D239.061239.06156.660.0001*AB127.131127.1383.310.0001*AC105.781105.7869.320.0001*AD14.98114.989.810.0073*BC335.071335.07219.580.0001*BD127.351127.3583.450.0001*CD436.181436.18285.840.0001*A218439.44118439.4412083.600.0001*B218288.44118288.4411984.650.0001*C216958.25116958.2511112.950.0351*D218303.08118303.0811994.240.0001*残差21.36141.530.97失拟项15.13101.512262.150.5600不显著纯误差6.2441.56总离差48349.5828注：*表示显著（P0.05），*表示极显著（P0.01）。262 食品工业科技2023 年 9 月时间内通过单位膜面积上的流体量，对于同一种流体来讲，膜通量越大，溶液透过率就越高，分离的效率越快。8 种不同材料的微滤膜膜通量见图 3。PVDF PES PTFE PP MCEPAN CAPA0.00.40.81.21.62.02.4defgcbb膜通量(kgm2h1)a图 3 8 种微滤膜的膜通量结果Fig.3 Membrane flux histogram of 8 kinds of microfiltrationmembranes注：不同小写字母表示具有显著性差异，P0.05。如图 3 所示，不同小写字母表示膜通量在不同材料微滤膜时的差异显著（PPANCAMCEPVDFPESPTFEPP。由图 5（a）为 PSMF 原料液-质图，原料液中含有 12 种黄酮类化合物。图 5（b）图 5（e）分离程度较弱，大部分化合物未被分离。图 5（f）图 5（i）分离程度有所提高，其中 PA 膜分离效果最好，分离出 5 个组分，分别为桑色素、山奈酚、野漆树苷、羟基芫花素和槲皮素。PA 薄膜的这种强的结合亲和力源于酰胺基团与目标化合物分子的供质子基团之间的氢键相互作用24。采用场发射扫描电镜观察微滤膜过膜后 PSMF 冻干粉的形貌，与其他冻干颗粒相比，PA 冻干粉颗粒更均匀。由膜通量、扫描电镜和液相出峰共同确定了选用 PA 膜分离 PSMF，可以达到较好的分离效果。其中桑色素含量最高（Morin）含量最多，其分子式为 C15H10O7（表 4、图 6），桑色素具有许多药理功能，包括抗氧化剂、抗癌剂、抗炎抗菌药物等。ZHANG 等25通过对细胞抑制、周期分析、细胞凋亡、mRNA 表达和通过活性氧产生的抗氧化机制研究，验证了桑色素在诱导癌细胞凋亡中起重要作用。JARINYAPORN等26发现桑色素可以抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠的脂肪的生成。2.3.4 BTESE/PA 复合膜表征以及分离效果分析PA 薄膜具有良好的化学稳定性且耐溶剂性强，且对 20 25 30 35 40 1:5 1:10 1:15 1:20 1:25100 120 140 160 180 200 220 240 260 PSMF 提取量(gmL1)PSMF 提取量(gmL1)PSMF 提取量(gmL1)A:料液比(g/mL)40 45 50 55 60 60 65 70 75 80100 120 140 160 180 200 220 240 260 60 65 70 75 80 20 25 30 35 40100 120 140 160 180 200 220 240 260 B:提取时间(min)1:51:101:151:201:252025303540A:料液比(g/mL)B:提取时间(min)B:提取时间(min)/min140160160160160180180180200220560657075804045505560C:乙醇体积分数(%)D:提取温度()D:提取温度()/140160160160160180180180180200220520253035406065707580PSMF 提取量(gmL1)PSMF 提取量(gmL1)PSMF 提取量(gmL1)B:提取时间(min)C:乙醇体积分数(%)C:乙醇体积分数(%)C:乙醇体积分数(%)/%1401601601601601801801801802002205图 2 PSMF 的 3D 响应面图Fig.2 3D Response surface of PSMF 第 44 卷 第 18 期邹平，等：牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取工艺优化及膜法分离纯化 263 于 PSMF 有较好的分离效果，将 PA 膜过膜液进行纳滤分离，纳滤膜为实验室自制的 BTESE/PA 复合膜，膜表面形貌如图 7（右）所示。(a)5 m5 m5 m5 m5 m5 m5 m5 m(d)(c)(b)(e)(f)(g)(h)(a)(d)(c)(b)(e)(f)(g)(h)图 4 8 种微滤膜表面 SEM 图Fig.4 SEM images of the surface of 8 kinds of microfiltration membranes注：（a）（h）分别为 PVDF、PES、PTFE、PP、MCE、PAN、CA 和 PA。0 2 4 6 8 10015030045060012115109876341mV时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)0 2 4 6 8 10时间(min)abcdefghi2030609012015018067582431mV030609012015018087654321mV0306090120150180697854312mV050100150200987654321mV030609012015018032541mV0306090120150180654321mV0306090120150654321mV05010015020025035142mV图 5 PSMF 膜分离纯化物的液-质检测结果Fig.5 Liquid-mass spectrometry detection results of PSMF membrane separation purified substances注：a.原料液；b.PVDF 膜；c.PES 膜；d.PTFE 膜；e.PP 膜；f.MCE 膜；g.PAN 膜；h.CA 膜；i.PA 膜。表 4 PSMF 成分组成分析结果Table 4 Composition of PSMF编号化合物名称质荷比（m/z）时间（s）分子式1桑色素303.05132.20C15H10O72木樨草苷449.11136.50C21H20O113山奈酚287.05136.74C15H10O64野漆树苷579.17191.62C27H30O145羟基芫花素301.07235.35C16H12O66去甲丁香色原酮193.05312.94C10H8O47圣草酚287.06356.58C15H12O68木樨草素287.05362.09C15H10O69槲皮素301.04368.29C15H10O710短叶松素255.07409.00C15H12O511根皮素273.08450.90C15H14O512异鼠李素317.07475.80C16H12O7 100806040200相对强度(%)20137.02153.02229.05303.05303.05153