印迹法的基本原理及应用.doc

(word完整版)印迹法的基本原理及应用印迹法的基本原理及应用印迹法(blotting)即转移电泳,是20世纪70年代发展起来的一种新方法。Southern于1975年建立了检测特异DNA片段的DNARNA杂交法，称作Southern印迹法。1977年Alwine等把此方法应用到RNA的研究方面，称作Nouthern印迹法。1979年Towbin等则把该方法扩展应用到蛋白质分析方面，称作Western印迹法。1982年Reinhart报道的双向蛋白质印迹法，称作Eastern印迹法。目前，有人把Southern，Nouthern，Western印迹法分别称作DNA印迹法，RNA印迹法和蛋白质印迹法.而每一种印迹法又可以分为斑点印迹法和电泳转移印迹法.前者是将样品直接吸附于固相载体上，而后者则是将样品先经过电泳后在转移到固相载体表面上，其余操作基本相同。由于核酸和蛋白质等大分子物质印迹到固相载体，容易和各种探针发生化学或免疫反应,因而对检测样品（尤其是粗样品）中某些组分的理化性质是有益的.其操作过程所需的试剂量少,灵敏度高，所以应用较为普遍。印迹法的基本原理（一)概念1探针 用化学方法将有识别能力的物质(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根过氧化物酶）或核素（如3H、35S、32P），或荧光物质(如异硫氰荧光素、地高辛等）结合成的复合物称作探针。2固相载体 即用于吸附生命大分子物质的固体材料.这类材料有硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜，尼龙膜（nylon-membranes，NDM），重氮苄氧甲基(yloxymethyl，DBM)膜和重氮苄硫醚(diazophenylthiaether，DPT）纸等。最常用的是孔径为045lm的NC膜，因为它成本低廉，结合力强,背景较清晰。而对于检测核酸和酸性蛋白质来说，理想载体是带正电的尼龙膜，它与负电荷物质结合力很强,操作亦简单。但因为其与负离子型染料也易结合,背景值高，故使用受到一些限制.3封阻 用一种与待测物不反应的物质（如蛋白质、核酸、吐温20等)封阻载体印迹区域以外的剩余吸附位点,使探针与印迹物反应，且不吸附到载体上,此过程称为封阻,从而使印迹结果背景干净,印迹的斑点或谱带更为清晰。4印迹 把经过凝胶电泳后的组分,通过吸附或电泳方法转移或者以直接点样方式吸附到固相载体上，此过程称电泳印迹，或称点印迹。5放射自显影 将含放射性核素的复合物置X线感光胶片上压片，当放射性核素电离辐射时，胶片上会发生化学“感光”作用,随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带，此法较灵敏。(二)原理生命大分子物质（如核酸或蛋白质)印迹到固相载体上，经淬灭试剂处理后，可与相应的探针(酶标记）反应，接着用适当的溶液漂洗,置含底物的溶液中显色,即可现出谱带。如所用探针为放射性核素标记物时，则应将漂洗后的载体进行放射自显影,即可检测出样品中特异的成分。印迹法的应用(一)分析和制备特异成分一般生命大分子如蛋白质等的粗制品经过凝胶电泳后，常常产生许多谱带。但它再经印迹转移程序分析后，就可以从中找出所需的某一特殊成分，而这种特殊成分又可以从相应的凝胶区段回收.用此方法得到的物质纯度较高,纯化步骤也较简单.（二)检测生命大分子之间的相互作用不同生命大分子之间的相互作用是经常发生的，特别是在有机体内.因此,建立一种检测生命大分子物质之间相互作用的有效方法一直是人们研究的重要课题.而用印迹法就可以检测出如DNA-RNA、DNA蛋白质、RNA-蛋白质、酶-底物、糖蛋白凝集素、激素受体等物质之间的相互作用,同时也可用此方法寻找各种大分子物质的相应配体简述Southern Blot杂交的原理、步骤及应用原理Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原 则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方 法的灵敏性，综合凝胶电泳和 核酸内切限制酶分析的结果,便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图， 或进行目的基因序列的 测定以满足基因克隆的特殊要求,还必须掌握DNA分子中基因编 码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。步骤1琼脂糖电泳（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.10.5g即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要1020g;当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要3050g。（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳.(3）电泳结束后，EB染色,长波紫外线下观察电泳结果及照相.2印迹转移（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位,然后将凝胶置于一容器中。（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中,室温下放置1h 使之变性,不间断地轻轻摇动。（3)将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。(4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜)剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。(6）虹吸转移1216h。3固定DNA（1)取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上,中和两遍,每遍5min。（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80烘烤12h。4预杂交（1)将膜浸入5SSC 中2min，将膜放入干净的塑料袋中.（2）将预杂交液事先在65 预热,然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。（3)65预杂交1h 以上,不时摇动.5杂交（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5l 变性探针,排除气泡后封口。(2）将杂交袋放入65 水中杂交过夜.6按下列条件洗膜2SSC， 0.1%SDS 50ml 室温 5min /2次0。1SSC， 0.1SDS 50ml 65 15min /2次7免疫酶联检测（1）偶联反应用中和液 洗膜2min，室温。用封闭液50ml洗膜30min,室温，轻摇。 用中和液将稀释抗体Dig Ap 至750 mU/ml ，将膜封入杂交袋，加入5 ml稀释抗体轻摇50min。 用中和液 50 ml洗膜，10min 2次，室温，轻摇，除去未结合的抗体。（2）显色反应用平衡液20 ml平衡膜2min.将膜装入杂交袋中，加入5ml显色液，避光30min 左右，当出现颜色时不要晃动。用TE洗膜终止反应。80烤干.应用遗传病诊断，DNA图谱分析，检测样品中的DNA及其含量，PCR产物分析等。常用分子生物学技术的原理及其应用一、学习重点印迹技术（包括Southern blotting、Northern blotting、Western blotting）的原理和应用、探针的概念、PCR技术的工作原理、反应体系和反应步骤、Sanger法测序的原理、基因文库（包括基因组文库和cDNA文库）的概念、生物芯片技术（包括基因芯片和蛋白质芯片）的概念，酵母双杂交技术的基本原理二、学习提纲（一）分子杂交与印迹技术分子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性、印迹技术、探针技术。1印迹技术：将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹)或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术，包括DNA、RNA、蛋白质印迹技术。（1）DNA印迹术又称为Southern blotting，主要用于基因组DNA的定性和定量分析，亦可分析重组质粒和噬菌体.（2）RNA印迹技术又称Northern blotting，其基本原理与Southern blotting相同，主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。（3）Western blotting：又称蛋白质印迹术或免疫印迹技术，指蛋白质在经聚丙烯酰胺电泳分离之后转移到膜上,再与溶液中的其它抗体探针相互结合的技术。用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白分子间的相互作用研究等。印迹转移技术包括：毛细作用转移、电转移和真空吸引转移.2探针技术(二)聚合酶链反应（PCR）1基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5端和3端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸完成新的DNA合成.2反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、耐热性DNA聚合酶、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。3基本反应步骤包括:变性、退火和延伸。4主要用于：目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA测序、基因突变分析。5PCR经过发展形成了反转录PCR、原位PCR、实时PCR等多种衍生技术。（三)核酸序列分析主要有化学裂解法和DNA链末端合成终止法，以后者应用最为广泛。目前自动化测序已基本取代手工测序。（四）基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体，分为基因组DNA文库和cDNA文库。1基因组DNA文库是指包含某一个生物细胞全部基因组DNA序列的克隆群体，它以DNA片段的形式贮存着某一生物的全部基因组DNA信息。2cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。(四)疾病相关基因的克隆与鉴定单基因致病情况下的致病基因克隆主要有两种策略：功能克隆、定位克隆.（五）遗传修饰动物模型的建立主要用到以下三种技术：转基因技术、核转移技术和基因剔除技术。转基因技术和基因剔除技术在医学中最重要的用途是建立疾病的可遗传的动物模型。(六)生物芯片技术是20世纪末发展起来的一项规模化生物信息分析技术,包括基因芯片和蛋白质芯片等。（七）酵母双杂交技术。Northern Blot原理及实验方法原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应. 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 实验方法: 仪器、试剂、材料 （一)仪器恒温水浴箱,电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计,微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯,量筒，三角瓶等。 （二)材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜 （三）试剂：NorthernMax Kit（Cat. 1940,Ambion, Inc。)，琼脂糖，DEPC， X光底片，底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture，111 TBq/mmola-32PdCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer， Sephadex G-50，SDS，双氧水,灭菌水等。方法与步骤1。用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时.电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。2用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子,电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。3制胶： 1 称取0。36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32。4mlDEPC水后,微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60空气浴平衡溶液 （需加DEPC水补充蒸发的水分） 2 在通风厨中加入3.6ml的10Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡.3 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘.注：胶的厚度不能超过0.5cm。4胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml 1MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。)5检查点样孔。4。 RNA样品的制备 在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。5.电泳：1.将RNA样品小心加到点样孔中。2。在5V/cm下跑胶（514cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶,混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。3.紫外灯下，检验电泳情况,并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。6。转膜1用3双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。2用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。3连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm)，膜在Transfer buffer浸湿5分钟后,放置在多孔渗水屏的适当位置.4盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁.5将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。6将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。7打开真空泵，使压强维持在5058mbar;立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时.8转膜后，用镊子夹住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。9用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于UV交联仪中自动交联。10将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)12将膜在20保存。 7。探针的制备1在1。5ml离心管中配制以下反应液：模板DNA（25 ng) 1ulRandom Primer 2ul灭菌水 11ul总体积:14ul295C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。3在离心管中按下列顺序加入以下溶液：10Buffer 2.5uldNTP Mixture 2.5ul111 TBq/mmola32PdCTP 5 ulExofree Klenow Fragment 1 ul4混匀后（25ul），37C下反应30分钟.短暂离心,收集溶液到管底。565C加热5min使酶失活。 8.探针的纯化及比活性测定：1准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜.用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次,以除去可溶解的葡聚糖. 2取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G50凝胶。3将注射器放入一支15ml离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处4100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。5倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1。5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1。5ml离心管。6将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8 paper上,其余上样于层析柱上。71600g离心4min,DNA将流出被收集在去盖的离心管中,而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中.取0。5ul己纯化的探针点样于DE8paper。 8 测比活性。 9预杂交:1将预杂交液在杂交炉中68预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。2加入适当的ULRAhyb到杂交管中（以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb杂交液），42预杂交4 hr。10探针变性：1用10 mM EDTA将探针稀释10倍。290热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min.3短暂离心，将溶液收集到管底。11杂交:1加入0。5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后,将探针加到预杂交液中。242杂交过夜(1424hr）。杂交完后,将杂交液收集起来于20保存。12洗膜: 1低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 （100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次. 2高严紧性洗膜: 加入High Stringency Wash Solution2 （100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液），42 摇动洗膜20min两次. 13曝光:1 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。2 检查膜上放射性强度，估计曝光时间3 将X光底片覆盖与膜上，曝光4 冲洗X光底片,扫描记录结果。14去除膜上的探针：将200ml 0。1SDS（由DEPC水配制）煮沸后,将膜放入，室温下让SDS冷却到室温,取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。15杂交结果 操作应该小心，但不必紧张.用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse酶,以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡 Western Blotting的基本原理及应用。Western免疫印迹(Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达.