LI-COR Odyssey 红外荧光扫描成像.doc

一. Odyssey红外成像系统技术特点
一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。

主要特点
1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。
2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。
3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。
4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。
5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号
6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易
7．系统操作和维护简单

Odyssey的应用
应用领域：蛋白质研究，核酸研究
具体包括：Western分析，In-Gel Western分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot等
二．系统安装条件
1. 位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射
2. 空间及载重要求：
操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm
操作平台载重：40kg
3. 温度要求：15-25℃
4. 湿度要求：不超过60%
5. 电源：90-250V AC，47-63Hz。
6. 其它：通用插头接线板（至少3个插孔）`

三．培训所需试剂设备及样品
Western Blot实验所需试剂耗材：
客户自备的蛋白样品(建议为新鲜制备的蛋白，最好用western验证过)
细胞裂解液
SDS-Page胶
电泳缓冲液
PVDF膜(硝酸纤维素膜也可)
转移缓冲液
PBS
TBS
封闭液（建议使用5%进口脱脂奶粉）
Tween-20
一抗
荧光标记的二抗（IRDye700和IRDye800）
锡箔纸
（通用试剂详细配方请参照《分子克隆实验指南》）
其它配套设备：
1) 蛋白电泳仪
2) 脱色摇床
3) 转膜仪
4) 分子生物学实验室常用工具：
加样器，Tip头，量筒，离心管，离心机，冰盒等。

以上物品请您提前准备妥当，我们将使用以上物品进行仪器使用的培训工作。

四、培训程序及时间安排

（请至少安排2名实验室长期工作人员参加培训，方便以后有人员变动您也能进行仪器内部培训。）

1. 仪器安装及使用培训（2小时）
2. 实验安排布置，用户实际操作培训（不同的实验时间有所不同，以Western Blot为例，时间为1天半）。实验的安排上建议同时做红外荧光检测与化学发光检测的对比实验，方便两种方法结果的对比。
3. 软件基本功能综述及使用培训（1小时）

五、仪器及试剂系统介绍
1. Odyssey红外成像系统技术特点讲解
2. 仪器系统组成和工作原理讲解
3. 配套试剂介绍

六． 实验操作流程
实验设计：化学发光及荧光检测对比实验
1先将蛋白样品做3个浓度梯度稀释如1：10，1：100，1：1000，加上未稀释的蛋白共4个实验样品，再加上预染marker我们称之为一组样品
2蛋白电泳上样的顺序为预染marker，未稀释样品，1：10，1：100，1：1000，预染marker，未稀释样品，1：10，1：100，1：1000（两组样品中间建议空一个样品孔，方便以后的剪膜）
3转膜完成后，开始进行封闭及一抗孵育的操作步骤
4一抗孵育及洗膜完成之后，将两组样品膜剪开。两张膜分别按照荧光检测及化学发光检测的方式进行二抗的孵育，洗脱及结果的分析。Western的实验流程可以参照下面的荧光检测Western操作流程，部分化学发光的实验流程请参照所在实验室的方法。
荧光检测Western操作流程（以硝酸纤维素膜为例）：
1. 吸去培养液，用预冷的PBS洗细胞两次
2. 加入细胞裂解液，4℃放置20min
3. 用细胞铲刮下细胞，转移到1.5ml离心管，13000rpm，4℃，20min
4. 取上清
5. 取20-100µg蛋白进行电泳
6. 电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子克隆实验手册操作
7. 硝酸纤维素膜于转移缓冲液（PBS）中平衡20min。（如果使用PVDF膜，请先用甲醇浸湿，再用去离子水冲洗后转移到转移缓冲液中平衡20min。）
8. 电泳胶置转移缓冲液中平衡20min。
9. 裁两张与胶同样大小的滤纸,置转移缓冲液中平衡。
10. 转膜顺序：负极－专用滤纸－电泳胶－PVDF膜－专用滤纸－正极。15V，电转30min。
11. 电转后，封闭液中封闭1～3hour。
注：封闭液可以用5%的进口脱脂奶粉（用PBS溶解），因为Tween-20和BSA会对Odyssey造成高背景，所以在封闭完成前尽量不要让膜接触到这两种物质，所以麻烦您确定封闭液中没有Tween-20和BSA成分。
12. 封闭液稀释一抗（建议比例为1：1000－1：5000），膜在一抗中室温至少1hour或者4℃过夜。
注：抗体的稀释倍数与抗体质量和实验中的蛋白样本相关，麻烦您根据经验选择合适稀释倍数。同时，不同的抗体可能需要在抗体稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20来降低背景，您可以根据您要检测的蛋白以及平时操作经验来选择需否在一抗稀释液中添加0.1-0.2%的Tween-20。
13. 之后用PBST于摇床洗膜4×5mins。
14. 封闭液稀释二抗（建议比例为1：3000~10000），膜在二抗中室温于摇床1hour（避光）。
注：如果一抗稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20，则二抗稀释液也添加相同的Tween-20。如果使用Tween-20的同时添加0.01-0.02%的SDS于二抗稀释液中可以比较好的降低背景
15. 洗膜同13（避光）
16. 用PBS洗去膜上残留的Tween-20，接下来可直接进行扫描。
实验的详细的操作流程、注意事项、问题解决请参见附件以及《分子克隆实验指南》。

仪器的操作流程：
1． 在面板上打开仪器电源开关，再开启电脑，关机时相反。
2． 用软布或无尘纸蘸双蒸水将扫描平面的玻璃擦拭干净。
3． 将要扫描的胶或膜放到扫描平面上，记下坐标，扣上舱盖。
4． 双击软件图标，输入用户名、密码，进入主菜单。
5． 点击scan快捷键，选择要扫描的区域、介质、通道及合适的灵敏度、分辨率，开始扫描。
6． 扫描结束后对扫描结果进行分析。
7． 依次进行图象裁切、定道、定分子量标准、背景扣除等操作。
8． 根据需要输出图形或数据报告表格。

七． 软件使用培训
以下是关于Odyssey配套软件的简要操作说明，便于初次操作的研究者能快速掌握如何使用软件进行扫描。关于进一步的如何使用软件对实验结果进行分析，请参见随机所带的英文原版使用手册。

1． 扫描操作流程
1） 打开软件，点击“File”栏中的“New”创建一个新项目（如果是在已有项目中添加新内容，则点击“File”栏中的“Open”，打开已有项目）
2） 在窗口“New Project”中设定项目文件存储的路径和项目名称
3） 点击“Scan”按钮创建该新项目
4） 在登陆窗口输入用户名和密码
5） 点击“OK”按钮，进入扫描控制窗口
6） 在“Name”栏输入该次扫描的名称
7） 在“Group”栏选择用户所属的组
8） 在“Preset”栏选择目前进行扫描的介质（eg：膜还是胶？）
9） 选择合适的分辨率，扫描质量和焦距（对于膜来说，一般选择分辨率为169，扫描质量为medium，焦距为0，假如是胶，焦距为胶厚度的1/2）
10）在“Channels”栏根据所用二抗标记的荧光选择合适的通道，700或800或两者皆选，每个通道的激光强度可分别在“Intensity”栏调节
11）扫描控制窗口的右下侧矩形框为扫描区域，根据待扫描的膜的位置调节红色矩形框，使其将膜的区域完全覆盖（注意：膜或胶一般均放置在扫描平面的左下方）。
12）扣上舱盖开始扫描
13）点击“Alter Intensity”按钮可以根据需要分别调节两个通道的亮度，对比度和灵敏度，调节好后点击“OK”按钮确认
14）扫描结束后会弹出一个“New Analysis”窗口，在“Name”栏输入Original Analysis，点击“OK”将未做更改的原始图片保存
2． 如何中止扫描
要提前中止扫描过程，可以点击扫描控制窗口中的“Stop”按钮或者连续按两次扫描仪面板上的“Stop”键，此时扫描图像文件会被关闭并被保存下来，假如不希望将图象保存，点击扫描控制窗口中的“Cancel”按钮而非“Stop”按钮。

八.常见问题处理

问题：高背景，但是是均匀分布的
可能原因
建议
封闭液中有Tween-20存在
在封闭完成前不要让膜接触到Tween-20
封闭液中有BSA
永远不要将BSA用于封闭或者抗体稀释，BSA会造成不可逆的高背景
没有使用最佳的封闭试剂
对不同的封闭液进行比较找到最适合自己体系的封闭液；另外可以延长封闭时间
硝酸纤维素膜上的背景
在稀释的抗体中加入Tween-20从而降低背景。Tween-20的浓度需要根据所用的一抗进行优化，一般为0.05-1%
PVDF膜上的背景
减少或者除去稀释抗体中的Tween-20，特别是在使用牛奶作为封闭液的时候
抗体浓度太高
优化一抗和二抗的稀释倍数
洗膜不彻底
增加洗膜次数和洗膜液的量。确保洗膜液中含有0.1%的Tween-20,必要时可提高Tween-20的浓度。但要注意，过量的Tween-20(0.5-1%)可能会使信号减弱。
封闭液有污染，污染物和抗体发生交叉反应
用Odyssey配套的封闭液，而不是牛奶。牛奶里经常会有IgG,IgG会和抗羊的二抗发生交叉反应。
使用的抗体量不合适
增加抗体的量，使膜完全浸没其中。
膜的污染
操作要小心，处理膜的时候使用镊子，要防止膜干掉。

问题：背景上有不均匀的斑点分布
可能原因
建议
封闭液中同时处理了多张膜
如果多张膜同时放在一起进行封闭，请确保封闭液的量能够使所有的膜都能接触到溶液同时移动自如。
膜被Ponceau S污染
Ponceau S和膜接触后即使Ponceau S已被洗脱仍会使膜的背景增高
膜没有始终保持湿润，部分被吹干
使膜始终保持湿润状态。特别是要重复使用膜的时候这一点非常重要。
如果使用PVDF膜，记住要先把膜用100%甲醇浸湿。
使用的镊子和容器被污染
镊子在接触过抗体，特别是染料标记的二抗后要洗干净。脏的镊子会将染料带到膜上，无法洗脱。
孵育时使用干净的镊子和容器

问题：信号微弱或者没有信号
可能原因
建议
蛋白没有成功从胶中转移出来
检查转移液是否正常，检查转膜过程的各个步骤是否正确
用Odyssey预染marker指示转膜情况，另外转膜后对胶进行染色以确定没有蛋白留在胶中
检测过程中蛋白从膜上丢失
过长的封闭时间或者抗体稀释液中高浓度的Tween-20（0.5-1%）会导致膜上抗原部分丢失
使用的抗原量不足
增大跑胶时的上样量；使点样孔尽可能的小从而浓缩抗原。
使用了错误的封闭液
为了提高灵敏度和结合得牢固度，使用Odyssey封闭液。
转移过程中蛋白没有保留在膜上
转膜后先让膜在空气中自然风干，再去封闭。这样能使蛋白结合得更为牢固。
根据所用的抗原对转膜条件和时间进行优化。检查转膜时的“三明治”中间是否有气泡。
尝试其他牌子或者类型的膜（不同的抗原同膜结合的能力不同）
在转移液中添加20%的甲醇会有助于抗原同膜的结合（注意：甲醇会使胶的孔径缩小对大蛋白的转移会造成阻碍）
转移液中的SDS会降低转移的蛋白同膜的结合力，特备是那些低分子量的蛋白。尝试降低或者去除SDS（注意：溶液中不超过0.5%的SDS对某些蛋白来说确实能提高转移效率）。
小蛋白在转移过程中会穿过膜。使用孔径小一些的膜或者缩短转移时间。
使用的抗体量不足
一抗的结合力也许不够强。增加抗体的量，优化出最适合的浓度。
延长一抗得孵育时间（室温下4-8小时或者4℃过夜）。
增加二抗的量，优化出最适合的浓度。
由于放置时间过长或者保存不当抗体失去作用；用dot blot检测抗体。
膜的类型不合适
尝试另一种膜。硝酸纤维素膜要比PVDF膜灵敏度更高。

问题：出现非特异性或者非预期的条带
可能原因
建议
抗体浓度过高
减少抗体用量。
缩短抗体孵育时间。
增加抗体稀释液中Tween-20的量
双色实验中抗体间的交叉反应
对所用一抗和二抗的来源、种属再次检查（请参照附件中关于双色western部分）。
双色实验中交叉反应很可能出现。减少二抗用量可使这种情况出现的机会降低。
双色反应之前先做一下单色实验，从而了解哪些是目的条带以及目的条带所在的位置。
如果可能的话，避免同时使用鼠抗和兔抗。因为这两个种属的亲缘关系很近，在某些情况下，鼠抗会和兔的IgG发生反应，兔抗也会和鼠的IgG发生反应。
信号从一个通道流失到另一个通道
如果某个通道的信号非常强（接近或处于饱和状态），其中一小部分的信号会流失到另一个通道。要解决这一问题，可以在扫描时减弱该通道的激发强度。同时在以后的实验中减少蛋白点样量以及使用的抗体量。