实验九纳他霉素的发酵生产.doc

实验九 纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测 此实验为综合性设计性实验，需至少24学时。以下时间安排供参考。
第一周：老师做好斜面；学生领取并清洗仪器，接种斜面制备孢子，配制种子培养基。
第二周：学生在显微镜下观察孢子的形状；将斜面孢子接种到种子培养基中摇瓶培养；配制发酵培养基。24hr后在显微镜下观察检查种子培养物的形态，将培养1天的种子接种到发酵培养基中摇瓶培养；做标准曲线。
第三周：在显微镜下观察培养物的形态，测定发酵48小时后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。并每隔24hr在显微镜下观察培养物的形态，测定相应发酵时间后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。直到发酵196小时为止。
第四周：合并所有发酵液，提取纯化纳他霉素。
第五周：按正式发表的科技论文格式完成实验报告。

一. 实验目的：
通过摇瓶发酵生产纳他霉素，加深对好氧发酵过程中菌体生长与次级代谢产物积累的关系的认识，积累代谢调控发酵及相关产品分离纯化和分析检测的经验。
二. 实验原理：
纳他霉素（Natamycin）是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素(Pimaricin)。它是由5个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成。由于它能够专性地抑制酵母菌和霉菌，被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。
1. 纳他霉素的结构和性质

图8-1 纳他霉素的分子结构
纳他霉素是近白色至奶油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280℃（分解），分子式C33H47O13，相对分子量665.75，结构式如图所示。纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5。
纳他霉素在水中和极性有机溶剂中溶解度很低，不溶于非极性溶剂，室温下在水中的溶解度为30～50mg/L。易于溶于碱性和酸性的水溶液中。转变为胆酸盐形式后溶解度可以迅速增加。纳他霉素的低水溶性不利于它的生物利用度。因为溶解的纳他霉素必须扩散到目标物的活性部位，并且和目标物结合才能发挥作用。
在大多数食品的pH值范围内，纳他霉素是非常稳定的。高温、紫外线、氧化剂及重金属等会影响纳他霉素低的稳定性。但可以瞬时高温（温度可达100℃）不影响其活性。N-Natamycin(3-N-dimethylaminopropylsuccimido)的活性比较低，可能是对它的化学修饰都会降低其活性，纳他霉素是经深层发酵和多步提取工艺精制而成，其制剂通常是50%纳他霉素和50%乳糖的混合物。
纳他霉素的生产菌种主要有Streptomyces chattanovgensis, Streptomyces natulonso, Streptomyces gilvosporeus等3种链霉菌。本实验所用菌种为褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus），孢子丝螺旋形。孢子表面带刺。
在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源(葡萄糖)。纳他霉素在以葡萄糖作为碳源时产量最高，这是因为葡萄糖能渗入纳他霉素的分子中去。有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物。
2. 纳他霉素的抑菌作用机制
纳他霉素是26种多烯烃大环内酯类抗真菌剂的一种，多烯是一平面大环内酯环状结构，纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子结合，形成抗生素－甾醇复合物，破坏细胞质膜的渗透性；分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。
三. 药品及仪器设备
1. 药品
酵母提取粉、麦芽提取粉、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、氯化钠、大豆分离蛋白、麦芽糊精、酵母提取粉、乙醇、甲醇、20％NaOH、抗氧化剂BHA、1，2丙二醇、纳他霉素标准品
2. 仪器设备
250ml三角瓶、摇床、生化培养箱、离心机、紫外分光光度计
四. 操作步骤
1. 孢子、种子液的制备和摇瓶发酵
(1) 菌种：褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）
(2) 斜面孢子培养
① 孢子培养基
酵母提取粉 4g/L
麦芽提取粉 10 g/L
葡萄糖 4g/L
琼脂 20g/L
pH7.0
② 孢子斜面制备
按斜面孢子培养基配方称好原料，用融化琼脂溶解，定容，用20％氢氧化钾调pH，121℃灭菌15分钟，摆斜面冷却后置于37℃培养1－2天，备用。用斜面转管接种，25℃培养10天，待孢子长满后，放置冰箱5天以上再用。
涂片观察孢子形态，并显微拍照。
(3) 摇瓶种子培养
① 摇瓶种子培养基共100ml，分装2瓶
葡萄糖 15g/L
蛋白胨 10g/L
氯化钠 10g/L
pH7.0
② 摇瓶种子制备
按摇瓶种子培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250ml装50ml），121℃灭菌15分钟。待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。，29℃，200rpm振荡培养24小时。无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。
(4) 摇瓶发酵培养
① 摇瓶发酵培养基1000ml，分装6瓶
大豆分离蛋白 19.5g/L
麦芽糊精 50g/L
酵母提取粉 4g/L
葡萄糖 6g/L
pH7.0
② 摇瓶发酵
按摇瓶发酵培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250mL装40mL），121℃灭菌25分钟。待培养基冷却后，取摇瓶种子1ml接种，29℃，200rpm振荡培养120－168hr。每隔24hr无菌取样，涂片观察菌球形态，并显微拍照。
染色方法：取一滴样品，小心打散后，加一滴染料，静置30秒染色。酒精灯（离火焰稍远点）固定20秒，细流水冲洗掉染料，盖上盖玻片，用吸水纸吸干多余水分，分别在低倍镜、高倍镜和油镜（如果需要）下观察孢子、种子和菌丝球形态。
2. 纳他霉素的提取与检测
纳他霉素不溶于水，因此它在发酵液中呈晶体状。纳他霉素晶体有针型的，圆盘型的等等。它们都是在发酵过程中形成，直径一般在0.5～20nm。
从接种后第48hr开始，每隔24hr从每瓶发酵液中取0.5mL的发酵液，混合均匀，取混合后的发酵液0.5mL，加4.5mL的丙二醇（此过程样品稀释了10倍
][9），在摇床上震荡1小时，12000rpm离心10min，取0.5mL上清液，加4.5ml蒸馏水（此过程样品再次稀释了10倍），摇匀，在紫外分光光度计303nm测定光密度。如果吸光度太大，需要再稀释一次，计算结果时记得乘以此稀释倍数。剩余的混合后的发酵液平批分成2份，分别用于测定还原糖和氨氮。
标准曲线：取50mg的纳他霉素，溶于100mL丙二醇，得浓度为500μg/mL的纳他霉素原液。按表8-1制作曲线，横坐标为纳他霉素工作溶液浓度，纵坐标为OD303nm。注意给出回归方程（y=kx+b）和相关系数（R2），如果相关系数＜0.98，要求重做标准曲线。产物浓度计算公式为：
纳他霉素含量（mg/L）=X×100×n
其中：X为将所测样品的OD303nm作为y值，代入回归方程中求出的相应的x值。100为样品处理时2次稀释倍数之积。如果所得样品OD303nm超出标准曲线范围为，则稀释n倍后再次测定。
表8-1 纳他霉素标准曲线工作表
管号
1
2
3
4
5
6
工作溶液浓度（μg/mL） 此行为自动生成数据，不需学生计算。

0
2.5
5
7.5
10
12.5
纳他霉素原液（mL）添加量
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
水（mL）
10
9.95
9.9
9.85
9.8
9.75
OD303
CK

3. 纳他霉素的分离纯化 如果使用低速大容量离心机，转速可能达不到要求，可适当延长离心时间。

(1) 发酵液6000rpm离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积。
(2) 湿菌泥加2倍体积 95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5hr（注意一定要调过pH后再计时），以便纳他霉素充分溶解。
(3) 6000rpm离心10min，保留上清液。
(4) 用1N盐酸调pH6.5，静置3hr以上（或冰箱过夜），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出。
(5) 6000rpm离心10min，保留沉淀（产物）。
(6) 55℃真空干燥2hr，称重。
五. 结果及分析讨论
表8-2 实验结果
发酵时间（h）
菌球形态
还原糖含量（g/L）
氨氮含量（g/L）
纳他霉素浓度（g/L）
48

72

96

120

144

168

六. 实验报告
1. 按正式发表的科技论文格式撰写成小论文（老师可提供格式范本）。
2. 同组同学可以共享实验数据，但不允许相互抄袭。对同一实验现象或实验结果可以有不同的理解和分析。
3. 写出实验心得体会，比如自己对实验结果是否满意，学会了什么，还有哪些做的不够。
七. 思考题：
4. 种子液菌球与发酵液菌球在形态上有什么区别？为什么会有这种区别？
5. 纳他霉素的分离纯化中需要两次调节pH值，其目的和作用分别是什么？
6. 各时期取样观察到的菌丝形态、还原糖含量、氨基氮含量和产物产量之间有什么关联性？

日程安排
11生工（2）
日程安排
11生工（1）
第8周
周一
老师做好斜面；学生领取并清洗仪器，接种斜面制备孢子，配制种子培养基。配制发酵培养基。灭菌枪头
第8周
周五
老师做好斜面；学生领取并清洗仪器，接种斜面制备孢子，配制种子培养基。配制发酵培养基。灭菌枪头
第9周
周一
学生在显微镜下观察孢子的形状；将斜面孢子接种到种子培养基中摇瓶培养；
第9周
周五
学生在显微镜下观察孢子的形状；将斜面孢子接种到种子培养基中摇瓶培养；配制发酵培养基。

周二
种子培养24hr后：在显微镜下观察检查种子培养物的形态，将培养1天的种子接种到发酵培养基中摇瓶培养；做标准曲线。

周六
种子培养24hr后：在显微镜下观察检查种子培养物的形态，将培养1天的种子接种到发酵培养基中摇瓶培养；做标准曲线。

周四
无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定发酵48小时后的纳他霉素含量
第10周
周一
无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定发酵48小时后的纳他霉素含量
第10周
本周五至下周二
每隔24hr无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定相应发酵时间后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。直到发酵168小时为止。最后一次测定产物后合并所有发酵液，12000rpm离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积。湿菌泥加2倍体积 95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5hr（注意一定要调过pH后再计时），置于冰箱中以便纳他霉素充分溶解。

周二至周六
每隔24hr无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定相应发酵时间后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。直到发酵168小时为止。最后一次测定产物后合并所有发酵液，12000rpm离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积。湿菌泥加2倍体积 95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5hr（注意一定要调过pH后再计时），置于冰箱中以便纳他霉素充分溶解。
第11周
周一
12000rpm离心10min，保留上清液。用1N盐酸调pH6.5，静置3hr以上（冰箱），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出。
第11周
周五
12000rpm离心10min，保留上清液。用1N盐酸调pH6.5，静置3hr以上（冰箱），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出。
第12周
周一
12000rpm离心10min，保留沉淀（产物）。55℃真空干燥2hr，称重。按正式发表的科技论文格式完成实验报告。
第12周
周五
12000rpm离心10min，保留沉淀（产物）。55℃真空干燥2hr，称重。按正式发表的科技论文格式完成实验报告。