琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,琼脂糖凝胶电泳,Agarose gel electrophoresis,天然琼脂（,agar,）,:,又名琼胶、菜燕、冻粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（,agarose,）,半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷,D-,半乳糖,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化,DNA,或,RNA,片段,1.,因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗,2.,对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。,3.,凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。,4.,透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。,5.,不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定,6.,样品易回收，常用于制备。,琼脂糖凝胶电泳的优点,缺点,1.,机械强度差，易破碎，浓度不能太低。,2.,易被细菌污染，不易保存，临用前配制。,3.,琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。,4.,与,PAGE,相比，分子筛作用小，区带少。,一、实验目的,掌握琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,的原理和方法,DNA,分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同,DNA,的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,二、实验原理,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。,琼脂糖凝胶电泳法分离,DNA,，主要是利用分子筛效应，,迁移速度与分子量的对数值成反比,关系。因而就可依据,DNA,分子的大小使其分离。该过程可以通过把,分子量标准参照物,和样品一起进行电泳而得到检测。,溴化乙锭（,Ethidium Bromide,EB,）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。,EB,可与,DNA,分子形成,EB-DNA,复合物，其荧光强度与,DNA,的含量成正比。据此可粗略估计样品,DNA,浓度。,三、实验材料、器具及药品,质粒,DNA,样品。,电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。,琼脂糖，,1XTBE,电泳缓冲液,，溴化乙锭（,EB,），,6X,载样缓冲液,四、实验步骤,1g,琼脂糖加入,100ml 1,TAE,电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。,（冷却到,60,，加入,100l,的,0.5mg/ml EB,，并摇匀。）,用胶带将制胶板两端封好，,插入适当梳子,，将溶解的琼脂糖（约,50,）倒入，室温冷却凝固。,充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加,1,TAE,电泳缓冲液至液面覆盖凝胶,1-2mm,，小心垂直向上拔出梳子。,用移液器吸取总,DNA,或质粒样品,4l,于封口膜上，再加入,2l,的,6X,载样缓冲液，混匀后，,小心加入点样孔,。,打开电源开关，调节电压至,3-5V/cm,，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约,30min-60min,。,将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的,DNA,条带。,将凝胶放入,EB,染液中染色,5-10min,用清水稍微漂洗。,1,2 3 M,1,、,DNA,分子的大小,双链,DNA,分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；,2,、琼脂糖浓度,浓度越低，相同核酸分子迁移越快；,3,、,DNA,的构象,同一分子：超螺旋环状线状切口环状,DNA,的迁移速率决定因素,4,、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭,溴化乙锭（,EB,）插入双链,DNA,造成其负电荷减少、刚性和长度增加。,5,、所用的电压,低电压时,DNA,片段迁移率与所用的电压成正比。,6,、琼脂糖种类,常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；,不同类型琼脂糖的性质,琼脂糖类型,凝结温度,/,熔化温度,/,标准琼脂糖,3538,9095,不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异,4042,8590,高强度琼脂糖,3443,8595,修饰的低熔点,/,凝点琼脂糖,2535,6365,35,65,超低熔点,815,4045,低黏性低熔点琼脂糖,2530,70,38,85,30,75,不同类型琼脂糖分离,DNA,片段的范围,浓 度（,%,）,标 准,(kb),高强度,(kb),低熔点,(kb),低黏度低溶点,(kb),0.3,150,0.5,0.725,0.8,0.515,0.810,0.810,1.0,0.2512,0.48,0.48,1.2,0.156,0.37,0.37,1.5,0.084,0.24,0.24,2.0,0.13,0.13,3.0,0.051,0.51,4.0,0.10.5,6.0,0.010.1,常用的电泳缓冲液,4,保存备用,.,7,、电泳缓冲液,TAE,和,TBE,电泳缓冲液比较,都是常用电泳缓冲液，二者相比：,1,）,TAE,的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；,2,）,TBE,比,TAE,花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；,3,）双链线状,DNA,片段在,TAE,中比在,TBE,中迁移快,10%,；,4,）对于高分子质量的,DNA,，,TAE,的分辨率略高于,TBE,，对于低分子质量的,DNA,，,TAE,要差些。超螺旋,DNA,在,TAE,中的电泳分辨率要好于,TBE,。,凝胶载样缓冲液,载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。,载样缓冲液有三个作用：,1,）增加样品密度保证,DNA,沉入加样孔内；,2,）使样品带有颜色便于简化上样过程；,3,）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,6,凝胶载样缓冲液,类型,6,缓冲液,贮存温度,I,0.25%,溴酚蓝,4,0.25%,二甲苯氰,40%(m/V),蔗糖水溶液,II,0.25%,溴酚蓝,室温,0.25%,二甲苯氰,15%,聚蔗糖,(Type400),水溶液,III,0.25%,溴酚蓝,4,0.25%,二甲苯氰,30%,甘油水溶液,IV,0.25%,溴酚蓝,4,40%(m/V),蔗糖水溶液,琼脂糖凝胶中,DNA,的检测,通过染色,紫外灯下检测。,主要采用溴化乙锭（,ethidium bromide,EB,）染色法。,使用,EB,染色注意事项,（,1,）,EB,被认为是一种强致癌物质,（,2,）,EB,可用来检测单链或双链核酸,（,3,）,EB,使用时的配制、贮存及使用,EB,常用水配制成,10 mg/ml,的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为,0.5 g/ml,。,（,4,）当要知道,DNA,片段准确大小时，凝胶应在无,EB,情况下电泳，电泳结束后再用,EB,染色。,凝胶中,DNA,的成像,可以用透射或入射紫外光对,EB,染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。,关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法,几点注意事项,1,）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则,DNA,的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。,2,）每孔最大,DNA,上样量决定于,DNA,样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。,3,）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。,4,）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于,Southern,印迹转移和需要回收,DNA,片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）,5,）凝胶中加入,EB,进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但,EB,会导致线形,DNA,迁移率下降，这在酶切质粒与空白对照质粒一起电泳时应值得注意。,6,）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与,DNA,泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子,DNA,片段检测困难。处理方法是：将凝胶在,0.5ug/ml,的,EB,溶液中染色,30,45,分钟。,7,）判断正负极的另一方法是负极气泡（,H2,）比正极气泡（,O2,）多一倍。,