DB34∕T 3855-2021 水果和蔬菜中六种链格孢霉毒素的测定液相色谱-串联质谱法.pdf

ICS 67.050 CCS X 04 34 安徽省地方标准 DB34/T 38552021 水果和蔬菜中六种链格孢霉毒素的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of six Alternaria toxins in fruits and vegetables LC-MS-MS 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施安徽省市场监督管理局 发 布DB34/T 38552021 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。 本文件由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位： 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、 农业部农产品质量安全风险评估实验室（合肥）、池州市农产品质量安全监测中心、合肥市农产品质量检测检验中心、阜阳市农产品质量安全监测中心、繁昌县农业技术推广中心、潜山市种植业服务中心。 本文件主要起草人：董旭、孙明娜、褚玥、童舟、许四五、吴延灿、范希芹、高宗仙、朱松涛、吴彩萍、王梅、段劲生、高同春。 DB34/T 38552021 1 水果和蔬菜中六种链格孢霉毒素的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了水果和蔬菜中交链格孢酚、交链孢酚单甲醚、交链孢霉烯、细格菌素、细交链格孢酮酸、腾毒素六种链格孢霉毒素残留量的液相色谱-串联质谱法中的原理。 本文件适用于梨、葡萄、猕猴桃、苹果、柑桔、西红柿、黄瓜、普通白菜、辣椒等水果、蔬菜中交链格孢酚、 交链孢酚单甲醚、 交链孢霉烯、 细格菌素、 细交链格孢酮酸、 腾毒素六种链格孢霉毒素测定。 本文件方法六种链格孢霉毒素的定量限均为 0.01 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 2763 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量 GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第1部分：总则与定义 GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 789 农药残留分析样本的采样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样用含甲酸的乙腈和水混合溶液提取，经分散固相萃取氮气吹干，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水 。 5.1 乙腈（C2H3N）：色谱纯。 5.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 5.3 甲酸（CH2O2）：色谱纯。 5.4 无水硫酸镁（MgSO4）。 5.5 氯化钠（NaCl）。 DB34/T 38552021 2 5.6 无水乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。 5.7 微孔滤膜：PTFE 聚四氟乙烯 0.22 m。 5.8 溶液配制 5.8.1 0.1甲酸-乙腈溶液：取 1 mL 甲酸（4.3）用乙腈（4.1）定容至 1000 mL。 5.8.2 5 mmol 乙酸铵-甲醇溶液：称取 0.3854 g 无水乙酸铵（4.6），用甲醇（4.2）溶解并定容至 1000 mL。 5.8.3 5 mmol 乙酸铵-水溶液：称取 0.3854 g 无水乙酸铵（4.6），用水溶解并定容至 1000 mL。 5.9 分散固相萃取净化包：每份样品称取 3.0 g 无水硫酸镁（4.4）和 1.0 g 氯化钠（4.5），混匀。 5.10 六种链格孢霉毒素标准物质（见表 1）。 表1 链格孢霉毒素标准物质信息表 序号 名称 分子式 CAS号 纯度 （） 1 细交链格孢酮酸 C10H15NO3 610-88-8 98.0 2 交链格孢酚 C14H10O5 641-38-3 98.0 3 交链孢酚单甲醚 C15H12O5 26894-49-5 98.0 4 细格菌素 C15H14O6 31186-12-6 98.0 5 交链孢霉烯 C15H16O6 889101-41-1 98.0 6 腾毒素 C22H30N4O4 28540-82-1 98.0 5.11 标准溶液配制 5.11.1 标准储备液： 分别准确称取 10.2 mg 的六种链格孢霉毒素， 用乙腈 （4.1） 溶解并定容至 10 mL，配成 1000 g/mL 的标准储备液，于 04下避光保存，有效期 3 个月。 5.11.2 混合标准储备液：分别吸取 1 mL 六种链格孢霉毒素的标准储备液，用乙腈（4.1）定容至 10 mL配成 100 g/mL 的混合标准储备液，于 04 下避光保存，有效期 3 个月。 5.11.3 混合标准工作液： 将六种链格孢霉毒素的混合标准储备液， 用乙腈 （4.1） 稀释， 配成 0.005 g/mL、0.01 g/mL、0.05 g/mL 、0.1 g/mL、0.5 g/mL 和 1.0 g/mL 的标准工作溶液，现配现用。 5.11.4 基质混合标准工作液：吸取适量的六种链格孢霉毒素的混合标准储备液，用样品空白液稀释，配成 0.005 g/mL、0.01 g/mL、0.05 g/mL、0.1 g/mL、0.5 g/mL 和 1.0 g/mL 的基质混合标准工作溶液，现配现用。 注： 空白基质溶液取样量应与相应的试样处理取样量一致。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 6.2 电子天平：感量 0.01 mg 和 0.01 g。 6.3 高速均质机, 转速12000 r/min。 6.4 离心机，转速4000 r/min。 6.5 涡旋仪，转速2500 r/min。 6.6 氮吹仪。 7 分析步骤 DB34/T 38552021 3 7.1 试样的制备与保存 按照 NY/T 789 的规定抽取样品，取样部位按 GB 2763 附录A 的规定执行，经切碎，充分混匀后高速匀浆，取 500 g 样品，分成两份，放入洁净试样瓶中密封，贴上标签，于 -20下保存，待测。 7.2 提取及净化 称取试样 2.5 g（精确至 0.01 g），置于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 0.1甲酸-乙腈 （4.8.1） ，2.5 mL 水，12000 r/min 均质 2 min，加入分散固相萃取净化包（4.8），3000 r/min 涡旋 2 min，静置 10 min，4000 r/min 离心 10 min，移取上清液 4 mL 至 10 mL 离心管中，氮吹近干，加入 1 mL 乙腈（4.1）-5 mmol 乙酸铵水溶液（4.8.3）溶解残渣（20：80，v/v），过 0.22 m 微孔滤膜（4.7），待测。 7.3 色谱-质谱条件及测定 7.3.1 液相色谱条件 7.3.1.1 色谱柱：C18，50 mm 2.0 mm 1.6 m； 7.3.1.2 柱箱温度：40； 7.3.1.3 流动相：A 相 5 mmol 乙酸铵-水溶液（4.8.3），B 相 5 mmol 乙酸铵-甲醇溶液（4.8.2）； 7.3.1.4 流速：0.3 mL/min； 7.3.1.5 进样体积：10 L； 7.3.1.6 流动相梯度洗脱程序见表 2。 表2 梯度洗脱程序 梯度时间 /min 流动相比例 /（） 流动相A 流动相B 0.0 90 10 0.5 70 30 4.0 10 90 5.5 10 90 6.7 90 10 8.0 90 10 7.3.2 质谱条件 7.3.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）， 7.3.2.2 离子源温度：450 ， 7.3.2.3 离子源接口电压：4.5 KV； 7.3.2.4 扫描方式：正/负离子模式； 7.3.2.5 检测方式：多反应监测（MRM）； 7.3.2.6 雾化气 3 L/min、干燥气 15 L/min 均为高纯氮，碰撞气氩气 230 KPa； 7.3.2.7 脱溶剂管温度：250 ； 7.3.2.8 参考条件和定性离子对、定量离子对见表 3。 DB34/T 38552021 4 表3 MRM 检测参数 被测物名称 ESI模式 定量/定性离子对 m/z 碰撞电压1 (V) 碰撞能 碰撞电压2 (V) 交链格孢酚 - 257.0/215.2* 13.0 28.0 22.0 257.0/213.1 13.0 22.0 21.0 交链孢酚单甲醚 + 273.2/128.2* -10.0 -49.0 -14.0 273.2/115.1 -13.0 -53.0 -12.0 交链孢霉烯 + 293.2/257.0* -11.0 -15.0 -19.0 293.2/275.0 -11.0 -10.0 -21.0 细格菌素 - 289.0/245.1* 11.0 18.0 25.0 289.0/230.2 11.0 22.0 23.0 细交链格孢酮酸 - 196.0/139.1* 10.0 22.0 26.0 196.0/112.1 10.0 25.0 21.0 腾毒素 + 415.4/58.1* -12.0 -29.0 -23.0 415.4/312.2 -10.0 -21.0 -23.0 注： *为定量离子对。 7.3.3 测定 将基质混合标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱-质谱联用仪中， 保留时间和定性离子定性,测得定量离子峰面积， 待测样液中目标物的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内， 超过线性范围时，应稀释后进样。 7.4 定性及定量 7.4.1 保留时间 被测试样中目标物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,相对误差应在 2.5之内。 7.4.2 定性测定 在相同实验条件下进行样品测定时,若检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致,并且在扣除背景后的样品质谱图中,目标化合物的质谱定量和定性离子均出现,且同一检测批次,对同一化合物,样品中目标化合物的定性离子和定量离子的相对丰度比与质量浓度相当的基质标准溶液相比,其允许偏差不超过表4 规定的范围,则可判断样品中存在目标物。 表4 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位： 相对离子丰度 50 2050（含） 1020（含） 10 允许相对偏差 20 25 30 50 7.4.3 定量测定 7.4.3.1 本方法采用外标校准曲线法单离子测定。 DB34/T 38552021 5 7.4.3.2 为减少基质对定量测定的影响，需用空白样液来制备一系列基质标准工作液，分别进样绘制标准曲线，并保证所测试样中毒素的响应值均在仪器线性范围内。 7.5 平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行测定。 7.6 空白实验 除不加试样外，均按上述步骤测定。 8 结果计算 试样中每种链格孢霉毒素含量按公式(1)计算： mSVCSR (1) 式中：R 试样中每种链格孢霉毒素含量（mg/kg）； S 样液中链格孢霉毒素的峰面积； C 基质标准溶液的浓度（mg/L)； V 样液最终定容体积（mL）； S基质标准溶液中链格孢霉毒素的峰面积； m 称取的试样量（g）。 注： 计算结果应扣除空白值。 9 方法的准确度和精密度 9.1 准确度 本方法在 0.01 mg/kg0.2 mg/kg 添加浓度范围内的回收率在 75110之间。 9.2 精密度 本标准精密度数据是按照 GB/T 6379.1 和 GB/T 6379.2 的规定确定的，获得重复性和再现性的值是以 95的可信度来计算，本标准方法的精密度数据见附录A。 9.3 重复性 在重复性条件下， 获得两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r， 被测物的含量范围及重复性限见附录A。 10 色谱参考图 参见附录B。 DB34/T 38552021 6 附录A （规范性） 六种链格孢霉毒素精密度数据表 表A.1 六种链格孢霉毒素精密度数据表 中文名称 英文名称 含量 （mg/kg）重复性限 r 再现性限R 含量 （mg/kg） 重复性限 r 再现性限R 交链格孢酚 Alternariol (AOH) 0.01 0.0016 0.0029 0.2 0.0095 0.0126 交链孢酚单甲醚 Alternariol monomethyl ether (AME) 0.01 0.0016 0.0018 0.2 0.0129 0.0208 交链孢霉烯 Altenuene (ALT) 0.01 0.0011 0.0014 0.2 0.0073 0.0155 细格菌素 Altenusin (ALS) 0.01 0.0011 0.0016 0.2 0.0106 0.0110 细交链格孢酮酸 Tenuazonic acid (TeA) 0.01 0.0011 0.0012 0.2 0.0114 0.0164 腾毒素 Tentoxin (Ten) 0.01 0.0012 0.0020 0.2 0.0119 0.0139 DB34/T 38552021 7 附录B （资料性） 参考谱图 参考谱图如下： 图B.1 0.1 g/mL 水果蔬菜混合基质中交链格孢酚提取离子色谱图 图B.2 0.1 g/mL 水果蔬菜混合基质中交链孢酚单甲醚提取离子色谱图 图B.3 0.1 g/mL 水果蔬菜混合基质中交链孢霉烯提取离子色谱图 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.50250050007500100001250015000175002000022500250005:257.00215.20(-)5:257.00215.20(-)AOH/3.6950.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.501000002000003000004000005000006000007000008000002:273.20128.05(+)2:273.20128.05(+)AME/4.3970.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.50250000500000750000100000012500001500000175000020000001:293.20257.05(+)1:293.20257.05(+)ALT/3.186DB34/T 38552021 8 图B.4 0.1 g/mL 水果蔬菜混合基质中细格菌素提取离子色谱图 图B.5 0.1 g/mL 水果蔬菜混合基质中细交链格孢酮酸提取离子色谱图 图B.6 0.1 g/mL 水果蔬菜混合基质中腾毒素提取离子色谱图 图B.7 交链格孢酚质谱图 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.501000002000003000004000005000006000004:289.00245.15(-)4:289.00245.15(-)ALS/2.5490.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.50100002000030000400005000060000700006:196.05139.15(-)6:196.05139.15(-)TeA/1.7690.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5025000050000075000010000003:415.4058.15(+)3:415.4058.15(+)Ten/3.805212.5213.0213.5214.0214.5215.0215.5216.0m/z0.01.02.03.04.05.06.07.0Inten.(x10,000)215.20213.15DB34/T 38552021 9 图B.8 交链孢酚单甲醚质谱图 图B.9 交链孢霉烯质谱图 图B.10 细格菌素质谱图 图B.11 细交链格孢酮酸质谱图 115.0117.5120.0122.5125.0127.5m/z0.000.250.500.751.00Inten.(x100,000)128.05115.15257.5260.0262.5265.0267.5270.0272.5m/z0.60.70.80.91.01.1Inten.(x1,000,000)257.05230.0232.5235.0237.5240.0242.5245.0m/z0.000.250.500.751.001.251.50Inten.(x100,000)245.15230.20112.5115.0117.5120.0122.5125.0127.5130.0132.5135.0137.5m/z0.01.02.03.04.05.0Inten.(x10,000)139.15112.15DB34/T 38552021 10 图B.12 腾毒素质谱图 75.0100.0125.0150.0175.0200.0225.0250.0275.0300.0 m/z0.000.250.500.751.00Inten.(x1,000,000)58.15312.20