EP_7.0_2.6.12_非无菌产品的微生物限度检查.doc

欧洲药典 7.0 2.6.12非无菌产品的微生物限度检查：微生物计数试验1.简介：该法所描述的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制剂是否符合微生物质量的既定标准。如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来进行结果解释。该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。如果与药典的等效性作了相关说明，可以使用自动收集法作为替代法。2.一般步骤设计方法时所用条件要避免外在微生物对待测产品的污染。必须釆取措施，使其不影响任何待测微生物。如果待测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。3.计数方法按规定用微孔滤膜法或平板计数法。MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但如果某些产品所含微生物的量极少，则该法是最合适的。方法选择基于下列因素：如产品的特性和所要求的微生物限量。所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断其是否符合标准。所选方法的适用性必须建立。4.促生长实验、计数法的适用性和阴性对照4-1 总则该试验检测产品中微生物的检测能力必须被验证。如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适适用性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。4-2 试验菌株的准备使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。使用批菌种培养技术（seed-lot systems）使得用于接种的微生物从最初的主批种子传代不多于5次。细菌和真菌试验株的生长分别见表2.6.12-2。使用氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或pH 7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。对于黑曲霉菌需要加入0.05聚山梨醇酯80到缓冲液中。在两小时内使用该菌悬液或2-8下可保存24小时。作为一种可替代的制备方法，稀释含有黑曲霉菌或枯草芽孢杆菌的新鲜悬浮液，该悬浮液中加有营养细胞，从而可以制得一种稳定的孢子悬浮液，对于接种试验来说需要将该孢子悬浮液调整到一个合适的体积下。该孢子悬浮液可以在2-8保存至已经验证的期限。4-3 阴性对照为了验证试验条件，必须使用特定的稀释液作为阴性对照来替代测试液。在该阴性对照品中必须没有微生物生长。按“5”项的方法检测样品时，同样需要对照组。如果阴性对照试验失败的话需要分析原因。4-4 促生长培养基测试每一批准备好的培养基，每一批培养基，要么为脱水培养基要么含有所述成分。用表2.6.12-1中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到含有大豆蛋白胨消化肉汤的液体/平板和大豆蛋白胨消化琼脂上，对每一种使用各自的含有培养基的液体/平板。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到沙氏葡萄糖琼脂平板，对每一种微生物使用含各自培养基的平板。接种条件见表2.6.12-1。对固体培养基而言，以标准接种物来说，所得的生长值不超过计算值的两倍。与用先前的测试方法和验证的批培养基所得的测试结果相比，新制备的接种物将会出现微生物的生长值。与用先前的测试方法和验证的批培养基所得的测试结果相比，如果微生物生长清淅可见，则液体培养基是合适的。9表2.6.12.-1-微生物制备和使用微生物受试菌株制备促生长在产品存在的情况下的计数方法的适应性需氧菌总数总酵母菌和霉菌数需氧菌总数总酵母菌和霉菌数金黄色葡萄球菌如：ATCC6538NCIMB9518CIP4.83NBRC13276酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤30-3518-24小时酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤100CFU30-353天 酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤100CFU30-353天铜绿假单胞菌 如：ATCC 9027NCIMB 8626CIP 82.118NBRC13275酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤30-3518-24小时酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤100CFU30-353天酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤100CFU30-353天枯草杆菌如：ATCC 6633NCIMB 8054CIP 52.62NBRC 3134酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤30-3518-24小时酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤100CFU30-353天酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤100CFU30-353天白色念珠菌如：ATCC 10231NCPF 3179IP 48.72NBRC 1594沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤20-252-3天 酪蛋白大豆消化琼脂100CFU30-355天沙氏葡萄糖琼脂100CFU20-255天酪蛋白大豆消化琼脂100CFU30-355天MPN： 不能适用沙氏葡萄糖琼脂100CFU20-255天黑曲霉菌如：ATCC 16404IMI 149007IP 1431.83NBRC 9455沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡糖萄糖琼脂20-255-7天或能达到有很好的芽孢形成酪蛋白大豆消化琼脂100CFU30-355天沙氏葡萄糖琼脂100CFU20-255天酪蛋白大豆消化琼脂100CFU30-355天MPN： 不适用沙氏葡萄糖琼脂100CFU20-255天4-5对于待测产品合适的计数方法4-5-1 样品制备 ：样品制备方法选择依赖于待测产品的物理特性。如果下述方法均不合适的话，可选用替代方法。水溶性产品：溶解或稀释（通常1：10的稀释液）待测产品于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液, pH7.2的磷酸缓冲液或酪蛋白大豆消化肉汤。如有必要，调节pH 6-8。如果必要可用相同稀释液进一步稀释。不溶于水的非脂类产品：使待测物（通常以1：10稀释制备）悬浮在pH7.0 的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2 的磷酸缓冲液或酪蛋白大豆消化肉汤中。加入如1g/l的聚山梨醇酯80表面活性剂使几乎能润湿的物质悬浮。如有需要，调节pH为6-8。如果必要可用相同稀释液进一步稀释脂类产品：将受检产品溶解在豆蔻酸异丙脂中，通过过滤或把产品与最小需要量的无菌聚山梨醇酯80或与其他的非抑制表面活性剂混合进行灭菌，如果需要，加热到不超过40，或者在特殊情况下不超过45。仔细混合且如有必要在水浴中保温。加足量预热的所选稀释液来制备原产品的1：10的稀释溶液。仔细混合同时在所需的最短时间内保温来形成乳状液。可以使用含有合适浓度的无菌聚山梨醇酯80或其它的非抑制无菌表面活性剂来制备一系列的十倍稀释液。液体或固体的气溶胶：将产品在无菌条件下转移到一个膜过滤装置或者一个无菌容器中来进一步取样。或使用总含量或使用每个容器剂量确定的量。透皮贴剂。去掉透皮贴剂的保护层(“隔离衬垫”)并把它们向上贴在无菌玻璃或塑料盘上。用无菌多孔物质例如无菌纱布来覆盖粘贴面，避免透皮贴剂粘在一起并把透皮贴剂转移到含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂的灭活剂的所选适当体积的稀释液中。至少用力振摇制备溶液30分钟。4-5-2 接种和稀释：加上述制备的样品（4-5-1）到一个控制的（不含待测物质）足够量的微生物混悬溶液中来获得一个不超过100CFU的接种液。接种液的体积不能超过稀释产品的体积的1%。 为说明产品的可接受微生物回收率，实验中应该使用制备样品的最低可能稀释因子。如果因为抗微生物活性或者差的溶解性而不可能做到，需要进一步探索合适的方案。如果样品的生长抑制不可避免，在中和、稀释或过滤后可加入微生物混悬液。4-5-3 中和/去除抗微生物活性把根据4-5-2所述稀释制备的样品和按照4-5-4中所述步骤培养的微生物数和与对照制备中回收的微生物数作比较。如果生长被抑制（抑制因子大于2），修改计数测试的方法来保证结果的有效性。修改可能包括，如，（1） 稀释液或培养基体积的增加，（2）特殊的或一般的中和剂与稀释液的结合，（3）膜过滤，或（4） 上述措施的组合。中和剂： 中和剂可被用来中和抗菌剂的活性（表2.6.12.-2）。可在灭菌前加入到所选稀释液或更好的培养基中。如果使用的话，它们的功效和对微生物无毒性必须通过使用中和剂而不使用产品的空白实验进行说明。表2.6.12.-2 干扰物质的一般中和剂干扰物质 可能的中和方法戊二醛，汞硫酸氢钠（亚硫酸氢钠）酚，醇，醛，山梨酸酯稀释乙醛甘氨酸季铵化合物(QACs)，对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸酯），二-二双胍类卵磷脂QACs， 碘，对羟基苯甲酸酯聚山梨醇酯汞剂硫乙醇酸盐汞剂，卤素，醛硫代硫酸盐EDTA（乙二胺四乙酸盐）Mg2+或Ca2+若没有合适的中和方法，可认为分离接种微生物失败归因于产品自身的杀菌活性。这说明产品不可能被上述微生物污染。然而，产品可能只对其中一些有抑制作用，而对其他一些测试菌株没有作用或菌株没有代表性。然后，以微生物生长和标准所允许的最高浓度系数进行试验。4-5-4. 产品存在情况下微生物的回收率对以上列出的微生物进行单独的试验。仅对加入的测试菌微生物进行计数。4-5-4-1. 膜过滤： 使用孔径不大于0.45m的滤膜过滤。选择滤膜材料类型时，要求滤膜对微生物的滞留能力不受到待测样品成份的影响。每种上述微生物使用一张滤膜。将适量按4-5-1至4-5-3制备的样品（含1g产品，若预期CFU较大，则小于1g）用膜过滤，立即过滤并用适量稀释液冲洗滤膜。将膜转移到酪蛋白大豆消化琼脂表面上，以确定厌氧菌总数(TAMC)。将滤膜转移到沙氏葡糖琼脂上，以确定总酵母菌/霉菌数（TYMC）。按表2.6.12-2接种，进行计数。4-5-4-2. 平板计数法：至少在对各培养基使用两次平板计数法，对结果取平均值。4-5-4-2-1. 倾注培养法在直径9cm的培养皿中，加入1ml按4-5-1至4-5-3法制备的样品以及15-20ml酪蛋白大豆消化琼脂或沙氏葡糖琼脂。培养基温度均不超过45。若使用更大的培养皿，则琼脂的量也要相应增加。对于表2.6.12.-2中列出的每种微生物，至少要使用2个培养皿。根据表2.6.12.-2进行培养。取各培养基的菌落数的算术平均值计算原接种物的CFU。4-5-4-2-2. 表面涂布法在各直径9cm的培养皿中加入15-20ml酪氨酸大豆消化琼脂或沙氏葡糖琼脂，放置使其凝固。培养基温度均不超过45。若使用更大的培养皿，则琼脂的量也要相应增加。在层流通风柜或培养箱中干燥。对于表2.6.12.-2中列出的每种微生物，至少要使用2个培养皿。量取不少于0.1ml按4-5-1至4-5-3制备的样品涂布于培养基表面。培养并按4-5-4-2-1描述的方法计数。4-5-4-3最大概率数法（MPN）MPN法的精密度和准确度不及膜过滤法和平板计数法。对霉菌计数的结果尤为不可靠。因此，在其他方法不可行时，才可以考虑使用MPN法对TAMC计数。如果认定该法可用，则按以下方法进行。按4-5-1至4-5-3制备至少3个系列10倍产品稀释液。对于每个浓度梯度的溶液，将3等分试样接种于含9-10ml酪蛋白大豆消化培养基的试管内。若有必要，应向培养基中加入表面活性试剂，例如山梨酸酯80，或微生物抑制剂。这样，若使用3个梯度的稀释度，则共接种9个试管。在30-35培养不超过3天。若因产品本身的性质难以读出结果或不能确定，则在同一培养基或酪蛋白大豆消化琼脂上在同一温度下传代培养1-2天，得到的结果。根据表2.6.12.-4确定每克或每毫升产品微生物最大概率数。4-6. 结果和解释在确定膜过滤法和平板计数法的适用性时，任意试验菌平均数与4-5-2中无产品存在的对照值相差不大于2。在确定MPN法适用性时，接种值的计算值与对照值必须在95置信区间内。若不符合上述标准或试验菌大于以上方法所述，则使用最接近标准的方法和试验条件。5. 产品试验5-1.试验使用量除另有规定外，参照上述方法取10g或10ml待测品。液体或固体的气溶胶，取10个容器的样品。若为透皮贴剂，取10片。活性物质按以下方式制备的情况下，试验用量可以减少：单位剂量（如片剂，胶囊和注射剂）少于或等于1mg，或每克或每毫升（对于不以单位剂量为形式的制剂）中活性物质少于1mg。在这些情况下，试验用量不少于产品的10个单位剂量或10g或10ml。对于作为活性物质的原料，若样品的量受限制，或批量很小（如：少于1000ml或1000g），则试验量应为批量的1，除非另有规定允许使用更小的量。对于批量总数小于200（如临床试验使用的样品），则样品可减少为2个单位，若批量小于100，可为1个单位。从原料药或包装的制剂中随机取样。混合一定量包装中的产品，以便得到足量样品。5-2. 产品试验5-2-1. 膜过滤使用规定的过滤装置过滤培养基。根据第4节中所述适用的方法制备样品，并将适量样品各转移到2张膜上，并立即过滤。选取以下合适的方法冲洗各膜。将膜转移到酪蛋白大豆消化琼脂表面上，以确定厌氧菌总数(TAMC)。将滤膜转移到沙氏葡糖琼脂上，以确定总酵母菌/霉菌（TYMC）。接种于酪蛋白大豆消化琼脂上，在30-35下培养3-5天，接种于沙氏葡糖琼脂上，在20-25下培养5-7天。计算每克或每毫升产品的CFU。对于透皮贴剂，根据4-5-1所述，各通过2张无菌膜分别过滤制剂体积的10。将一张膜转移至酪蛋白大豆消化琼脂上确定TAMC，另一张转移到沙氏葡糖琼脂上确定TYMC。5-2-2.平板计数法5-2-2-1. 倾注培养法根据第4节所述制备样品。每一培养基的每种稀释度至少制备2个培养皿。接种于酪蛋白大豆消化琼脂上的，在30-35下培养3-5天；接种于沙氏葡糖琼脂上的，在20-25下培养5-7天。根据上述稀释度选取相应培养皿， TAMC的最大菌落数不少于250个，TYMC最大菌落数不少于50个。取各培养基的菌落数的算术平均值，计算每克或每毫升产品的CFU。表2.6.12.-4.- 微生物的最大概率数观察到的各试管菌数每克或每毫升产品的MPN95置信区间各试管中产品的克数或毫升数0.10.010.00100011005-2-2-2.表面扩散法根据第4节所述选择合适的方法制备样品。每一种培养基和每种浓度和稀释液至少准备2个培养皿。培养和计算CFU数与灌注平板法一致。5-2-3最大概率数法（MPN法）根据第4节所述选择合适的方法制备和稀释样品。所有试管在30-35培养3-5天。如有必要，可选择合适的方法再次培养。对每种浓度的稀释液所在试管中可显示微生物生长的数目进行记录。从表2.6.12-4中计算每克或每毫升样品中的微生物的MPN值。5-3结果解释总需氧微生物数（TMAC）与大豆蛋白胨消化琼脂待测的CFU值一致。如果测真菌所用的是这种培养基则它们的数目只是TMAC的一部分。总酵母菌/霉菌数（TYMC）与沙氏葡萄糖琼脂所得的CFU值一致。如果测真菌所用的是这种培养基，则它们的数目只是TYMC的一部分。当所预期的TYMC值由于细菌增长速度超出了可接受限度，可以使用含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂。如果采用MPN法，所计算的结果即为是TAMC。按规定可接受的微生物质量限度如下：- 101CFU：最大可接受值20- 102CFU：最大可接受值200- 103CFU：最大可接受值2000，等。推荐使用的溶液和培养基见章节2.6.13。