[成都七中生物奥赛培训生化]第13章 PCR.pdf

Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 PCR Polymerase Chain Reaction Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），即试管内），即试管内DNA扩增技术。扩增技术。以其显著的三大以其显著的三大特点特点(特异性、高效率和忠实性特异性、高效率和忠实性)，在生命科学研究，在生命科学研究领域产生了巨大影响。自领域产生了巨大影响。自1983年美国年美国PECetus公公司司Mullis等人发明该技术至今，已从最初的手工操等人发明该技术至今，已从最初的手工操作，完成了自动化操作，并以极快的速度增加了该作，完成了自动化操作，并以极快的速度增加了该技术的应用。这一技术极大地推动了分子生物学及技术的应用。这一技术极大地推动了分子生物学及其相关学科的发展，并已迅速在其它领域得以应用，其相关学科的发展，并已迅速在其它领域得以应用，成为核酸分子水平研究的基础及最为广泛应用的技成为核酸分子水平研究的基础及最为广泛应用的技术术。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 1变性变性 加热至加热至9096时，使模板时，使模板DNA双螺双螺旋的氢键断裂，双链解链，形成单链旋的氢键断裂，双链解链，形成单链DNA。2退火退火 当温度突然降低至当温度突然降低至2565，使引物，使引物与其互补的单链与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。模板在局部形成杂交链。3延伸延伸 7074下，在下，在Taq DNA聚合酶和聚合酶和4种种脱氧核糖核苷三磷酸底物及脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存存在的条件下，在的条件下，以引物为起始点沿着互补的单链模板进行以引物为起始点沿着互补的单链模板进行DNA链链延伸反应。延伸反应。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 常见常见PCR实验实验:(一一)试剂试剂 （1）模板：用合适方法制备模板）模板：用合适方法制备模板DNA。（2）引物：）引物：DNA合成仪合成后，经纯化、定量，无菌去离子水或三蒸水配合成仪合成后，经纯化、定量，无菌去离子水或三蒸水配制成制成1050mol/L。（3）Taq DNA聚合酶：商品供应一般为聚合酶：商品供应一般为5U/l，使用时其在，使用时其在100l反应体积终反应体积终浓度为浓度为22.5U。（4）dNTPs：商品化的中性混合液浓度为各商品化的中性混合液浓度为各2mmol/L，如需自己配制，则，如需自己配制，则将将dATP、dGTP、dCTP、dTTP钠盐各钠盐各100mg合并，加去离子水合并，加去离子水2ml溶解，溶解，用用0.1mol/L NaOH调至调至pH7.07.5（使其浓度为（使其浓度为5mmol/L），分装后），分装后20保存备用。保存备用。（5）PCR反应缓冲液：反应缓冲液：有些公司将反应缓冲液随有些公司将反应缓冲液随Taq酶提供给用户（通常为酶提供给用户（通常为10浓度），若需自己配制，其浓度），若需自己配制，其10浓度组分如下：浓度组分如下：250500mmol/L KCl 100500mmol/L,Tris-Cl(pH8.4)1520mmol/L MgCl2 0.5%Tween-20 1mg/L BSA（组分（组分V）（6）矿物油。）矿物油。（7）琼脂糖。）琼脂糖。（8）溴乙锭（）溴乙锭（EB,10mg/ml）。）。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12(二二)方法方法 1操作程序操作程序 向向0.5ml无菌无菌Eppendorf管内依次加入：管内依次加入：（1）10扩增缓冲液：扩增缓冲液：1/10体积。体积。（2）4dNTP：各各200mmol/L。（3）引物）引物1：1mmol/L。（4）引物）引物2：1mmol/L。（5）DNA模板：模板：102-105拷贝。拷贝。（6）ddH2O：补至终体积（终体积可为补至终体积（终体积可为25100l）。）。（7）混匀后，离心）混匀后，离心10秒，使反应成分集于管底，秒，使反应成分集于管底，95变性变性10分钟，分钟，Taq聚合酶聚合酶2.02.5U（100l），离心混匀。），离心混匀。（8）矿物油：）矿物油：100l。2变性变性90-96 30-60秒。秒。3退火退火25-65 60-90秒。秒。4延伸延伸70-74 30-60秒。秒。5重复重复(2)(4)2535次。每次即为一个次。每次即为一个PCR循环，最后一个循循环，最后一个循环环72增加增加5分钟，迅速冷却。分钟，迅速冷却。6琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。扩增产物。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 注意事项及影响因素注意事项及影响因素:1模板模板 PCR反应的模板可以是反应的模板可以是DNA，也可以，也可以是是RNA，后者需首先逆转录成，后者需首先逆转录成cDNA后才能进后才能进行正常行正常PCR循环。循环。不同来源的核酸标本，如临床标本（血液、不同来源的核酸标本，如临床标本（血液、痰液、尿液、粪便、体腔积液）、法医学标本痰液、尿液、粪便、体腔积液）、法医学标本（血斑、毛发、精斑等）、病理（血斑、毛发、精斑等）、病理 标本（如组织标本（如组织学）以及考古标本等，可以选用不同的方法直学）以及考古标本等，可以选用不同的方法直接提取接提取DNA。无论标本来源如何，。无论标本来源如何，扩增核酸均扩增核酸均需要部分纯化，操作过程应避免需要部分纯化，操作过程应避免DNA的降解，的降解，并尽量使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶，特并尽量使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶，特别是别是Taq DNA聚合酶抑制剂。聚合酶抑制剂。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 2引物引物 引物是待扩增核酸片段两端的已知序列，引物是待扩增核酸片段两端的已知序列，它决定了它决定了PCR扩增产物的大小。引物的选择是整个扩增产物的大小。引物的选择是整个PCR扩增反应成功的关键因素之一。理想的引物应扩增反应成功的关键因素之一。理想的引物应该有效地与靶序列杂交，而不与模板其它序列杂交。该有效地与靶序列杂交，而不与模板其它序列杂交。（1）引物合成的质量：合成的引物必须经聚丙烯）引物合成的质量：合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化，）纯化，以减少发生非特异扩增和信号强度的降低，冻干引以减少发生非特异扩增和信号强度的降低，冻干引物可以在常温下运输。冻干引物于物可以在常温下运输。冻干引物于20可以保存可以保存1224个月，甚至更长，液体状态于个月，甚至更长，液体状态于 20可以保可以保存存6个月或更长。个月或更长。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12（2）引物设计原则：引物设计尤需注意下列影响扩增特）引物设计原则：引物设计尤需注意下列影响扩增特异性和扩增效率诸因素。异性和扩增效率诸因素。1）引物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。）引物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。寡核苷酸引物长度一般为寡核苷酸引物长度一般为1530bp。这些寡核苷酸。这些寡核苷酸引物适于序列无变异，靶位确定的标准引物适于序列无变异，靶位确定的标准PCR。引物。引物长度增加，能提高特异性，但是在扩增退火时被引发长度增加，能提高特异性，但是在扩增退火时被引发的模板会减少，而降低反应效率。的模板会减少，而降低反应效率。实际应用中最适延伸温度不要超过实际应用中最适延伸温度不要超过Taq DNA聚合酶聚合酶的最适温度（的最适温度（74），这样才能保证酶活性和产物），这样才能保证酶活性和产物特异性。特异性。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 2）引物的）引物的3末端和末端和5末端核苷酸：末端核苷酸：引物引物3末端是末端是PCR延延伸的起始端，不能进行任何修饰，避免二级结构的形伸的起始端，不能进行任何修饰，避免二级结构的形成，一般成，一般3端也不能发生错配。端也不能发生错配。引物引物5端仅起限定端仅起限定PCR产物长度，它对扩增特异性影产物长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。3）GC的合理含量：一对引物的的合理含量：一对引物的GC含量和含量和Tm值应该协调，值应该协调，G+C含量一般为含量一般为4060%，如含有，如含有50%的的G+C各各20个个碱基的寡核苷酸链的碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在值大概在5662范围内，根范围内，根据公式据公式Tm=4（G+C）+2（A+T），可估计引物），可估计引物Tm值，值，Tm值最好接近值最好接近72，使变性条件最佳。，使变性条件最佳。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 4）避免引物自身和引物之间的互补：引物自身和引物之）避免引物自身和引物之间的互补：引物自身和引物之间均应避免互补序列，尤应避免间均应避免互补序列，尤应避免3端的互补重叠。一端的互补重叠。一般来讲，单个引物自身连续互补碱基不能超过般来讲，单个引物自身连续互补碱基不能超过3bp，一对引物间也不宜多于一对引物间也不宜多于4个连续碱基的互补。个连续碱基的互补。5）碱基的随机分布：选择模板中缺乏某种单一核苷酸的）碱基的随机分布：选择模板中缺乏某种单一核苷酸的区域设计引物，可以减少广范围引物同源的机会。同区域设计引物，可以减少广范围引物同源的机会。同时，也要注意引物对在长度和碱基组成上的平衡，使时，也要注意引物对在长度和碱基组成上的平衡，使两个引物的两个引物的Tm值相差在值相差在23范围内。范围内。6）避开产物的二级结构区：采用计算机软件可以预测估）避开产物的二级结构区：采用计算机软件可以预测估计计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。的稳定二级结构，有助于选择模板。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12（3）使用引物设计软件：现在引物设计与合成已商品）使用引物设计软件：现在引物设计与合成已商品化，有可免费提供的计算机程序设计服务。在对化，有可免费提供的计算机程序设计服务。在对所研究基因组全部序列并不完全知道的情况下，所研究基因组全部序列并不完全知道的情况下，这些程序既方便又实用，但是即使是最好的程序这些程序既方便又实用，但是即使是最好的程序也并非完美无缺。也并非完美无缺。使用计算机软件时，选择参数设置的越多，计算使用计算机软件时，选择参数设置的越多，计算机需要考虑的情况越多，寻找引物所需的时间会机需要考虑的情况越多，寻找引物所需的时间会越长。因此，在实验设计上明确限定参数应尽可越长。因此，在实验设计上明确限定参数应尽可能狭窄和独特，这样可以得到快速和高质量的引能狭窄和独特，这样可以得到快速和高质量的引物设计。物设计。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12（4）引物浓度：两条引物一般各在）引物浓度：两条引物一般各在0.10.5mmol/L，浓度太高会引起错配及非特异性产物扩增，且可浓度太高会引起错配及非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率及造成浪费，太增加引物之间形成二聚体的几率及造成浪费，太低则可能达不到扩增效果或产量太低。低则可能达不到扩增效果或产量太低。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 3循环温度和时间循环温度和时间 PCR扩增反应的三个基本步扩增反应的三个基本步骤即变性、退火和延伸需要在合适反应体系中进行。变骤即变性、退火和延伸需要在合适反应体系中进行。变性一步很重要，此步必须使靶基因模板完全变性，扩增性一步很重要，此步必须使靶基因模板完全变性，扩增才会成功。变性温度一般在才会成功。变性温度一般在9096，在此温度既能使，在此温度既能使DNA双链模板变性，又能保持双链模板变性，又能保持Taq DNA聚合酶活力。聚合酶活力。如果实验温度低于如果实验温度低于9096，则，则DNA变性不完全并容易变性不完全并容易复性而减少扩增产量。复性而减少扩增产量。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 退火温度必须严格规定，可根据公式退火温度必须严格规定，可根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）进行计算，退火温度太低易出现非特异性扩增。）进行计算，退火温度太低易出现非特异性扩增。一般退火温度应低于一般退火温度应低于Tm值值5。退火温度的范围一般在。退火温度的范围一般在2565之间。延伸温度常用之间。延伸温度常用7074，延伸，延伸3060秒，秒，时间可根据扩增时间可根据扩增DNA的长度而定。循环次数的确定，的长度而定。循环次数的确定，以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原则，一般在则，一般在2035次，循环次数过多将增加非特异产物。次，循环次数过多将增加非特异产物。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 4Taq酶浓度酶浓度 Taq酶在反应体系中的终浓度常为酶在反应体系中的终浓度常为22.5U/100ml。酶量过少合成产物量低，酶量过高则非特异性酶量过少合成产物量低，酶量过高则非特异性产物随之增加。产物随之增加。5镁离子镁离子(Mg2+)浓度浓度 Mg2+浓度对浓度对PCR产物的特异性和产量影响明显，产物的特异性和产量影响明显，特别是对特别是对Taq酶的影响尤为明显。酶的影响尤为明显。过量的过量的Mg2+会导致酶催化非特异产物的扩增，会导致酶催化非特异产物的扩增，而而Mg2+浓度过低，又会使浓度过低，又会使Taq酶的催化活性降低。酶的催化活性降低。一般一般Mg2+浓度在浓度在0.52.5mmol/L之间。之间。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 6.脱氧核苷三磷酸浓度脱氧核苷三磷酸浓度 4种种dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）在）在反应中浓度相等，一般为反应中浓度相等，一般为200mol/L。浓度过高会抑制浓度过高会抑制Taq酶活性，且引起酶活性，且引起Taq酶催化酶催化错配。错配。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 反转录反转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）是以是以RNA为起始模板产生为起始模板产生cDNA，再以再以cDNA为为模板进行模板进行PCR扩增扩增，而获取目的基因或检测基因表达而获取目的基因或检测基因表达。RT-PCR主要用途：直接从总主要用途：直接从总RNA或或mRNA分离获取目分离获取目的基因的基因，合成合成cDNA探针探针。原位原位PCR（in situ PCR）是原位杂交的细胞定位是原位杂交的细胞定位技术与技术与PCR的高灵敏度相结合的技术的高灵敏度相结合的技术。该技术可以获得该技术可以获得靶基因靶基因（靶靶DNA或或RNA）在原始特异细胞的定在原始特异细胞的定。实时实时PCR（real time PCR）即定量即定量PCR或实时定或实时定量量PCR。实时实时PCR可以动态观察可以动态观察PCR反应产物增加的量反应产物增加的量及过程及过程，与常规的与常规的PCR仅能检测终产物仅能检测终产物(end-points)的的生成相比生成相比，具有准确定量的优点具有准确定量的优点，是是PCR技术的一大进技术的一大进步步。目前常用于研究基因表达目前常用于研究基因表达（RNA表达表达）的定量分析的定量分析。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 以以TaqMan探针法为例，探针法为例，实时实时PCR基本原理基本原理如下：当用一如下：当用一对对PCR引物对模板引物对模板DNA（cDNA）进行扩增时，与引物）进行扩增时，与引物内侧（引物内侧（引物3端）模板端）模板DNA序列互补的另一对探针结合序列互补的另一对探针结合于模板上，该探针于模板上，该探针5端带有荧光报告基团（端带有荧光报告基团（R基团），基团），3端带有淬灭基团（端带有淬灭基团（Q基团）。由于完整的探针其基团）。由于完整的探针其R基团与基团与Q基团距离较近，基团距离较近，R基团无荧光产生，而当基团无荧光产生，而当PCR引物沿模引物沿模板延伸到探针结合位置时，板延伸到探针结合位置时，Taq酶的外切核酸酶活性使荧酶的外切核酸酶活性使荧光探针的单核苷酸水解，释放出光探针的单核苷酸水解，释放出R基团，基团，Q基团的淬灭活基团的淬灭活性随即中止。此时定量性随即中止。此时定量PCR仪可以自动检测到仪可以自动检测到R基团所发基团所发出的荧光信号，该信号的强度即可反应模板出的荧光信号，该信号的强度即可反应模板DNA(cDNA)的量，因而可以对基因进行定量。的量，因而可以对基因进行定量。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 其它其它PCR技术技术:1.聚合酶链式反应单链构象多态性分析（聚合酶链式反应单链构象多态性分析（single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products,PCR-SSCP)2.重组重组PCR（recombinant PCR,RPCR）3.固着固着PCR（Sanchorde PCR,SAPCR）4.不对称不对称PCR（asymmetric PCR）5.锚定锚定PCR（anchored PCR）6.反向反向PCR（inverse PCR）7.着色互补着色互补PCR（color complementation PCR）8.多重多重PCR（multiplex PCR）Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 1基因克隆 基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生物学基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生物学研究中不可少的手段。研究中不可少的手段。运用运用PCR技术于基因克隆和亚克隆比传统的方技术于基因克隆和亚克隆比传统的方法具有更大的优点。法具有更大的优点。由于由于1次次PCR可以对单拷贝的基因放大上百万可以对单拷贝的基因放大上百万倍，产生微克（倍，产生微克（g）级的特异）级的特异DNA片段，从片段，从而可省略从基因组而可省略从基因组DNA中克隆某一特定基因片中克隆某一特定基因片段所必须经过的像段所必须经过的像DNA的酶切、连接到载体的酶切、连接到载体DNA上、转化、建立上、转化、建立DNA文库及基因的筛选、文库及基因的筛选、鉴定、亚克隆等繁锁的实验步骤。鉴定、亚克隆等繁锁的实验步骤。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 只要知道目的基因的两侧序列，通过一对和模板只要知道目的基因的两侧序列，通过一对和模板DNA互补的引物，可以十分有效地从基因组互补的引物，可以十分有效地从基因组DNA中或从中或从mRNA序列中，或从已克隆到某一载体上序列中，或从已克隆到某一载体上的基因片段中扩增出所需的的基因片段中扩增出所需的DNA片段。片段。为了克隆操作的方便或保证克隆后基因的方向正为了克隆操作的方便或保证克隆后基因的方向正确性，可以在设计引物时在其确性，可以在设计引物时在其5端作一些修改，或端作一些修改，或加上一段不完全与模板互补的序列。加上一段不完全与模板互补的序列。这个添加的序列可以是带限制性内切酶切点的连这个添加的序列可以是带限制性内切酶切点的连接子，或某种启动子序列或起始或终止密码。经接子，或某种启动子序列或起始或终止密码。经过过PCR扩增后，添加的序列最终可整合到新合成扩增后，添加的序列最终可整合到新合成的产物中，便于下一步的重组克隆和基因的表达的产物中，便于下一步的重组克隆和基因的表达和调控研究。和调控研究。如果引入的序列是包含限制性内切酶位点的连接如果引入的序列是包含限制性内切酶位点的连接子，子，PCR产物经相应的内切酶消化后，即可进行产物经相应的内切酶消化后，即可进行定向克隆。定向克隆。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 2基因的体外突变(重组与融合)在分子生物学研究中常常需要将两个不同的基因在分子生物学研究中常常需要将两个不同的基因融合在一起，通过融合在一起，通过PCR反应可以比较容易地实现反应可以比较容易地实现这一目的。这一目的。在两个在两个PCR扩增体系中，两对引物分别由其中之扩增体系中，两对引物分别由其中之一在其一在其5末端和末端和3末端引物带上一段互补的序列。末端引物带上一段互补的序列。混合两种混合两种PCR扩增产物，经变性和复性，两组扩增产物，经变性和复性，两组PCR产物通过互补序列发生粘连，其中产物通过互补序列发生粘连，其中1条重组条重组杂合链能在杂合链能在PCR条件下发生延伸反应，产生条件下发生延伸反应，产生1个个包含两个不同基因的杂合基因。包含两个不同基因的杂合基因。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 3基因定量 应用应用PCR技术可以定量检测标本中靶基因的拷贝数。技术可以定量检测标本中靶基因的拷贝数。这在研究基因的扩增等方面具有重要意义。这种方法这在研究基因的扩增等方面具有重要意义。这种方法称为差示称为差示PCR（differential PCR）。）。它是将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于同它是将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于同1个个试管中进行试管中进行PCR扩增。扩增。电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物引物5端标记上放射性核素，通过检测两条区带放射端标记上放射性核素，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数，利用差示性强度即可测出目的基因的拷贝数，利用差示PCR还还可以对模板可以对模板DNA（或（或RNA）的含量进行测定，在一系）的含量进行测定，在一系列列PCR反应中，分别加入待测模板反应中，分别加入待测模板DNA和参照和参照DNA片片段。段。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 参照参照DNA片段基本上按待测片段基本上按待测DNA的方式进行构建，只的方式进行构建，只是在其基因上增加了一小段内部连接顺序，这样使得是在其基因上增加了一小段内部连接顺序，这样使得两种两种DNA片段的片段的PCR产物可在凝胶电泳上分开。产物可在凝胶电泳上分开。由于这两种不同的由于这两种不同的DNA片段可以在同一种寡核苷酸引片段可以在同一种寡核苷酸引物作用下同步扩增，因此可以避免因使用不同的引物物作用下同步扩增，因此可以避免因使用不同的引物所引起的可能误差。所引起的可能误差。这两种扩增产物的相对量就反应了在起始反应混合物这两种扩增产物的相对量就反应了在起始反应混合物中的目的中的目的DNA和参照和参照DNA的相对浓度。利用差别的相对浓度。利用差别PCR同样也可以作同样也可以作mRNA定量。定量。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 4DNA序列测定序列测定 PCR技术使技术使DNA测序大为测序大为简化。因此，现在几乎都采用简化。因此，现在几乎都采用PCR法进行序列测法进行序列测定。测定时，定。测定时，PCR产物即可以克隆到测序载体中，产物即可以克隆到测序载体中，也可以不经克隆而直接测序。由于直接测序既方也可以不经克隆而直接测序。由于直接测序既方便又可靠，且可标准化与自动化，因此直接测序便又可靠，且可标准化与自动化，因此直接测序就更为普遍。就更为普遍。现在已有现在已有20多种自动化测序的仪器，大都是多种自动化测序的仪器，大都是使用荧光或放射性标记的核苷酸掺入，进行电泳使用荧光或放射性标记的核苷酸掺入，进行电泳与自动记录结果。用与自动记录结果。用PCR测序的方法包括双链直测序的方法包括双链直接测序，双链克隆后测序，基因扩增转录测序及接测序，双链克隆后测序，基因扩增转录测序及不对称不对称PCR产生单链测序。产生单链测序。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 5分析突变分析突变 DNA分子的碱基突变可引起肿瘤、遗分子的碱基突变可引起肿瘤、遗传病、免疫性疾患等，因此，检测传病、免疫性疾患等，因此，检测DNA突变分子对突变分子对临床诊断与研究有重大意义。突变分子的检测有多种临床诊断与研究有重大意义。突变分子的检测有多种方法，例如寡核苷酸探针（方法，例如寡核苷酸探针（ASO）、限制性内切酶）、限制性内切酶片段长度多态性（片段长度多态性（RFLP）、变性凝胶电泳（）、变性凝胶电泳（DGGE）及其他等等，而聚合酶链反应单链构像多态性及其他等等，而聚合酶链反应单链构像多态性（PCR-SSCP）分析技术提供了简便、快速、经济）分析技术提供了简便、快速、经济的检测手段。的检测手段。由于由于PCRSSCP是检测单链是检测单链DNA，可使用不对，可使用不对称称PCR，将，将PCR反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，此时双链此时双链DNA走得最快，其次是正常的单链走得最快，其次是正常的单链DNA分分子，最后是突变分子。子，最后是突变分子。Dr.Qiang Fu.Dept.of Biochemistry&Molecular Biology,Preclinical Medicine School,SCU,2014.12 临床医学领域临床医学领域 的应用的应用:1病原体诊断病原体诊断 2遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 3免疫学及器官移植免疫学及器官移植 4肿瘤诊断肿瘤诊断 5法医学鉴定法医学鉴定