非特异性过氧合酶发酵优化及在H2O2检测中的应用.pdf

非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO）能够利用过氧化氢（H2O2）催化多种氧化反应，在工业中具有很大的应用潜力。针对 AaeUPO 在毕赤酵母中表达量低以及发酵工艺不清的问题，通过摇瓶发酵优化以及正交试验确定发酵培养基条件，并进一步通过 5 L 发酵罐进行放大。结果表明，毕赤酵母摇瓶水平高效表达 AaeUPO 的基本发酵条件：甲醇浓度 1.00%、培养基初始 pH5.5、蛋白胨浓度 1.5%、酵母粉浓度 1.5%，最优发酵条件下粗酶液酶活达到18.2 U/mL。在摇瓶水平发酵试验的基础上进行 5 L 发酵罐放大试验，优化后以接种量 10%、诱导温度 30 益、流加甲醇作为最终工艺条件。最终得到的细胞湿重 244 g/L，最高酶活为 25.1 U/mL，相较于初期未优化酶活提升了 91.6%。将AaeUPO 用于 H2O2检测，AaeUPO 对于 H2O2具有较好的检测性能，检测限达到 5 滋mol/L，抗干扰性能强。关键词：非特异性过氧合酶；毕赤酵母；发酵优化；放大生产；H2O2检测Optimization of Unspecific Peroxygenase Fermentation and Its Application in the Detection of H2O2GUO Chengyue1，DENG Xuewu2，ZHAO Yongming3，CAO Cuiyao2*（1.Tianjin Vocational Institute，Tianjin 300400，China；2.College of Chemical Engineering，Hebei Universityof Technology，Tianjin 300400，China；3.Tianjin UBasio Biotechnology Group，Tianjin 300450，China）粤遭泽贼则葬糟贼：Unspecific peroxygenase（UPO）was capable of catalyzing various oxidation reactions using hydrogenperoxide（H2O2）and had great potential for industrial applications.In order to address the low expression level ofAaeUPO in Pichia pastoris and the unclear fermentation process，the fermentation conditions were optimizedthrough shake flask fermentation and orthogonal tests，and further scaled up using a 5 L fermenter.The resultsshowed that the basic fermentation conditions for high-efficiency expression of AaeUPO in P.pastoris shake flaskfermentation were as follows：methanol concentration of 1.00%，initial pH value of 5.5，peptone concentration of1.5%，and yeast powder concentration of 1.5%.Under the optimal fermentation conditions，the crude enzymeactivity reached 18.2 U/mL.Based on the shake flask fermentation experiment，a 5 L fermenter was used for scaleup，and the final process conditions were optimized with an inoculation volume of 10%，inductiontemperature of 30 益，andmethanolfed-batchaddition.The resulting cell wet weightwas244 g/L，and the highestenzyme activity reached 25.1 U/mL，which was a 91.6%improvement compared with the non-optimized initialstage.AaeUPO was used for H2O2detection and demonstrated good detection performance with a detection limit of5滋mol/Landstrong anti-interference capability.运藻赠 憎燥则凿泽：unspecific peroxygenase；Pichia pastoris；fermentation optimization；scale up production；H2O2detection引文格式：郭成月，邓雪武，赵永明，等.非特异性过氧合酶发酵优化及在 H2O2检测中的应用J.食品研究与开发，2023，44（17）：182-187，209.GUOChengyue，DENGXuewu，ZHAOYongming，etal.Optimization of Unspecific Peroxygenase Fermentation and Its Applic-ationintheDetectionofH2O2J.Food Research and Development，2023，44（17）：182-187，209.生物工程182食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期过氧化氢（H2O2）是一种绿色且不含氯的杀菌和漂白剂。目前，H2O2已经被广泛应用于食品行业，如奶制品、啤酒、水果蔬菜、水产保鲜等1-2。据粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会报道，人体肠道细胞中的酶会快速分解少量的 H2O2，而不产生毒理学影响。然而，摄入含有过量 H2O2的食物可能会引起细胞内 H2O2代谢水平异常，甚至导致炎症、心脑血管疾病和糖尿病等健康问题3-4。因此食品中 H2O2的残留检测受到研究者们广泛关注。目前已经开发出许多方法用于检测 H2O2，如电化学法5-6、荧光法7-8和比色法9-10。Song 等11在氧化铟锡电极上负载了纳米氧化锡，并通过聚硫氨酸改性制备了一种光电化学传感器，在 0.038 mmol/L 范围内呈良好的线性关系，检出限为 0.003 mmol/L。Tang 等12利用苯丙噻唑与 H2O2荧光发光的特性制备了一种化学传感器用于检测 H2O2。在 060 滋mol/L（R2=0.994）表现出良好的线性关系，检测限为 1.0伊10-6mol/L。这些传统方法虽然可以提供高的灵敏度和广泛的应用范围，但仍存在一些不足，如检测仪器比较昂贵、需要专业的操作技能、样品预处理复杂、材料合成工艺不成熟等。随着生物学研究的发展，生物酶也常被用于 H2O2的检测13。酶法检测 H2O2具有能够定性定量检测、快速、操作简单、选择性高的特点。Tian 等14利用 H2O2会抑制抗坏血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase，AAO）氧化抗坏血酸的特点，开发出一种利用个人血糖仪定量分析 H2O2的方法。该方法可以在 2.55伊103滋mol/L 的线性范围内实现对 H2O2的检测，检测限为 2.5 滋mol/L。非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO）是一种来自于真菌的血红素氧化酶15，其能够利用H2O2将 2，2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS快速氧化为 ABTS+。而 ABTS+具有可定量、易于检测的特点。2004 年来源于茶树菇（Agrocybe aegerita）的AaeUPO 首次被 Ullrich 等16发现并报道。目前，在基因组测序的真菌中已经发现数千个 UPO 序列，但只有少数野生型酶和少数重组表达的 UPO 已被表征并用于实验室规模的研究17-18。而重组发酵获得的 UPO 存在表达量低，无法大规模制备的困境。针对上述问题，本文对已经成功表达 AaeUPO 的毕赤酵母 GS115 进行发酵工艺优化，提高毕赤酵母中AaeUPO 的重组表达量。通过摇瓶水平单因素试验和正交试验确定最佳培养基成分，利用 5 L 发酵罐发酵优化工艺条件并实现初步的放大生产。然后将 AaeUPO应用于对 H2O2的高效检测，以期为食品中 H2O2的检测提供新的方法。1材料与方法1.1材料与试剂AaeUPO 菌株：由河北工业大学生物催化与转化实验室构建的基因工程菌 P.pastoris/pPIC9k/PaDa-I；甲醇、ABTS、甘油：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾：天津市风船化学试剂科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、生物素、无氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）：北京奥博星生物技术有限责任公司。BMGY 培养基：酵母粉 10 g/L、蛋白胨 20 g/L、YNB13.4g/L、生物素 4伊10-4g/L、甘油 10 g/L，使用 100mmol/L磷酸钾缓冲溶液配制。BMMY 培养基：酵母粉 10 g/L、蛋白胨 20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素 4伊10-4g/L、甲醇10 g/L，使用 100 mmol/L 磷酸钾缓冲溶液配制。其中，YNB、生物素和甲醇在培养基灭菌（121 益下灭菌锅灭菌）后使用 0.22 滋m 水系滤膜除菌后加入。1.2仪器与设备台式高速离心机（TG18G）：盐城市凯特实验仪器有限公司；5 L 玻璃发酵罐（GS-F2005AG）：上海顾信生物科技有限公司；智能恒温摇床（HNY-202T）：天津欧诺仪器股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（GI54T）：致微（厦门）仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-1100）：上海美普达仪器有限公司。1.3方法1.3.1酶活测定方法将 AaeUPO 粗 酶液 200 滋L 与 柠 檬 酸 缓 冲 液（100 mmol/L，pH4.4）1 560 滋L 混合并加入 40 滋L H2O2（2 mmol/L）反应 30 s，于 420 nm 处测量混合液吸光度，将结果与 ABTS 溶液标准曲线对照。每分钟催化形成1 滋mol ABTS+的 AaeUPO 的量定义为 1 U。粗酶液酶活（A，U/mL）的计算公式如下。A=BV式中：B 为绝对酶活，U；V 为粗酶液体积，mL。1.3.2AaeUPO 摇瓶培养方法将甘油菌（1%接种量）接种至 BMGY 培养基中，在恒温摇床中在 30 益、220 r/min 条件下培养 1618 h，当培养基菌液在 600 nm 处的吸光度大于 2.0 后对菌液离心（25 益，7 000 r/min）。用 BMMY 培养基对毕赤酵母重悬，在 30 益、220 r/min 条件下进行诱导表达，随后每隔 24 h 添加 1 次甲醇，持续 5 d。诱导结束后离心（25 益，8 000 r/min）发酵液，收集上清液对 AaeUPO 活性进行检测。1.3.3AaeUPO 发酵罐培养方法在 5 L 发酵罐中配制一定体积的 BMGY 培养基并灭菌，将摇瓶培养的种子液按照一定体积分数接入到生物工程183食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期5L 发酵罐中。固定转速为 400 r/min，通气量为 6L/min，罐内温度设置为 30 益。培养 24 h 待甘油耗尽后饥饿处理 1 h，加入甲醇继续培养 5 d，之后每隔 12 h 检测1 次相关指标，每隔 24 h 添加甲醇。1.3.4H2O2标准曲线测定将 200 滋L AaeUPO 粗酶液溶于 1 560 滋L pH4.4 的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，加入200 滋L ABTS 溶液，再依次加入 40 滋L 一系列不同浓度的 H2O2溶液，混合后反应 3 min，于 420 nm 处测定吸光度。1.3.5摇瓶水平单因素试验以 BMGY 培养基扩大培养，BMMY 培养基诱导表达。对培养基中的主要成分进行优化，以 AaeUPO 酶活作为评价标准。选取培养基初始 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、甲醇浓度（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%）、酵母粉浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和蛋白胨浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）4 个因素，进行单因素优化试验。1.3.6摇瓶水平正交试验选取影响较大的因素设计四因素三水平正交试验，正交试验因素与水平见表 1。1.3.75 L 发酵罐水平试验的优化利用优化后的培养基条件，进行 5 L 发酵罐放大试验，依次从接种量（8%、10%、12%）、诱导温度（28、30、32 益）、甲醇添加方式（分批加入、流加）对发酵过程进行优化。1.4干扰试验及加标回收试验干扰试验方法：在 0.25 mmol/L 的 Fe2（SO4）3、K2SO4、（NH4）2SO4和 0.5 mmol/L 的 ZnSO3、Na2CO3溶液中分别加入 H2O2使其终浓度为 50 滋mol/L，检测混合后溶液中的 H2O2浓度。加标回收试验方法：在蒸馏水、矿泉水、啤酒中分别加入终浓度 0、10、20、30 滋mol/L 的 H2O2标准溶液，混匀后对样品进行测定。回收率（P，%）计算公式如下。P=M-M0Q伊100式中：M 为加标试样测定值，滋mol/L；M0为试样测定值，滋mol/L；Q 为加标量，滋mol/L。1.5数据处理采用 Origin 2021 对数据进行处理并作图。2结果与分析2.1AaeUPO 的蛋白电泳结果聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）结果如图 1所示。由图 1 可知，在大约 46kDa 处有明显的目的条带，这与 AaeUPO 的理论大小相符。表明 AaeUPO 在毕赤酵母中成功重组表达，接下来对其发酵条件进行优化。2.2培养基优化结果2.2.1甲醇浓度对 AaeUPO 表达的影响甲醇浓度对 AaeUPO 表达的影响见图 2。由图 2 可知，当甲醇浓度为 1.00%时，毕赤酵母对AaeUPO 表达情况最好，粗酶液酶活达到了 13.1 U/mL。诱导表达阶段，毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源。甲醇浓度低，诱导效果差，得不到足够的碳源，菌株生长缓慢。当甲醇浓度过高时，甲醇作为一种有机小分子又会对毕赤酵母产生毒害作用19。此外，甲醇代谢产生的甲醛、甲酸等小分子也会对生物体的正常代谢产生影响。因此，后续选用 1.00%甲醇浓度作为最佳培养条件。2.2.2培养基初始 pH 值对 AaeUPO 表达的影响培养基初始 pH 值对 AaeUPO 表达的影响见图 3。表 1正交试验因素与水平Table 1Factors and levels of orthogonal tests水平A 甲醇浓度/%B 培养基初始 pH 值C 蛋白胨浓度/%10.755.01.521.005.52.031.256.02.5M.Marker；1.AaeUPO 酶液。图 1AaeUPO 的蛋白电泳图Fig.1Electrophoretic diagram of AaeUPO protein15 kDa25 kDa35 kDa45 kDa60 kDa1M1510500.501.002.00甲醇浓度/%1.50图 2甲醇浓度对 AaeUPO 表达的影响Fig.2Effect of methanol concentration on expression of AaeUPO生物工程184食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期由图 3 可知，随着培养基初始 pH 值的增加，粗酶液酶活呈先升高后降低的趋势。pH5.5 时粗酶液酶活最高，达到 14.3 U/mL。毕赤酵母的生长 pH 值范围为2.07.5，最适生长 pH 值为 4.85.2。pH 值过高不利于毕赤酵母的生长。此外，当 pH 值较高时培养基中蛋白水解酶的活性较高，会导致 AaeUPO 的分解20。而过低的 pH 值对目标基因的表达不利，影响培养基中粗酶液的活性。因此，选取 pH5.5 作为最佳培养基初始 pH值。2.2.3营养物质对 AaeUPO 表达的影响营养物质对 AaeUPO 表达的影响见图 4。由图 4 可知，随着酵母粉浓度和蛋白胨浓度的增加，粗酶液中 AaeUPO 的活性呈现先上升后下降的趋势，但酵母粉浓度的影响不明显。当蛋白胨浓度为2.0%时，粗酶液酶活最高。随后对酵母粉浓度进行优化，酵母粉浓度为 1.5%时，粗酶液酶活达到最高值，为15.6 U/mL。当酵母粉和蛋白胨浓度较低时，毕赤酵母生长缓慢，酶活性较低；浓度较高时，培养基中会存在大量的氨基酸，对目标基因的表达产生不利的影响。综上，最佳的蛋白胨浓度为 2.0%、最佳的酵母粉浓度为1.5%。2.2.4正交优化试验结果分析正交试验设计与结果见表 2。由表 2 可知，影响发酵过程的主次顺序为培养基初始 pH 值蛋白胨浓度甲醇浓度。通过比较 k 值可以得到最佳组合为 A2B2C1，即甲醇浓度 1.00%、培养基初始 pH5.5、蛋白胨浓度 1.5%。2.2.5验证试验对 A2B2C1与 A2B2C3进行验证，组合 A2B2C1粗酶液酶活为 18.2 U/mL，高于组合 A2B2C3，因此为最优组合。2.35 L 发酵罐发酵条件优化2.3.1接种量对 AaeUPO 表达的影响接种量对 AaeUPO 表达的影响见图 5。由图 5 可知，接种量会影响菌体的生长曲线。接种量越高，相同时间内发酵罐中的菌体浓度就越大。但通过酶活的测定结果可以看出，并不是接种量越高，最终发酵完成的酶活力就越高。接种量会对毕赤酵母的对数成长阶段产生影响。接种量过低，发酵培养时间过长，发酵过程中动力的消耗会增加，并且有染杂菌图 3培养基初始 pH 值对 AaeUPO 表达的影响Fig.3Effect of pH of medium on AaeUPO expression1510504.05.07.0培养基初始 pH 值6.020151050.51.03.0蛋白胨浓度/%1.5（a）2.02.520151050.51.03.0酵母粉浓度/%1.5（b）2.02.5（a）蛋白胨浓度；（b）酵母粉浓度。图 4营养物质对 AaeUPO 表达的影响Fig.4Effect of nutrients on AaeUPO expression表 2正交试验设计与结果Table 2Design and results of orthogonal tests试验号因素粗酶液酶活/（U/mL）A 甲醇浓度B 培养基初始 pH 值C 蛋白胨浓度D 空列1111110.6432122213.819313339.732421239.6585223117.3146231214.9117313210.1068321313.9979332115.387k111.39810.13514.44813.184k213.96115.04312.94512.955k313.16313.34311.12912.384R2.5634.9083.3190.080生物工程185食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期图 7甲醇添加方式对 AaeUPO 表达的影响Fig.7Effect of methanol adding method on expression of AaeUPO的风险。接种量过高会导致发酵前期菌体生长过于旺盛，代谢产物增多，造成菌体的早衰。此外，接种量过高也会消耗大量的营养物质，从而影响对目的蛋白的合成。综上，以 10%作为最适接种量。2.3.2诱导温度对 AaeUPO 表达的影响诱导温度对 AaeUPO 表达的影响见图 6。由图 6 可知，当发酵培养 168 h、诱导温度为 30 益时 AaeUPO 的表达量最高。毕赤酵母最适生长温度为30 益，当温度为 28 益和 32 益时菌体生长缓慢。发酵过程中的菌体生长、目的蛋白合成以及发酵液的理化性质均会受诱导温度的影响。诱导温度过高或过低都不利于菌体的正常生长和目标基因的表达，最终选择30 益作为最佳诱导温度。2.3.3甲醇添加方式对 AaeUPO 表达的影响甲醇添加方式对 AaeUPO 表达的影响见图 7。由图 7 可知，甲醇添加方式也会对毕赤酵母的表达有很大的影响。将分批加入甲醇（即每隔 24 h 添加1 次）的方式优化为流加甲醇的方式，获得的粗酶液最终酶活由 20.8 U/mL 提升至 25.1 U/mL。毕赤酵母表达阶段以甲醇作为唯一碳源，但当甲醇浓度过高时会对毕赤酵母活性造成损伤，进而影响酶活。通过流加甲醇可以实现甲醇长时间低浓度供应，既保证了碳源的供给，又能减少高浓度甲醇对菌株的损伤。2.4优化前后粗酶液酶活的对比优化前后粗酶液酶活的对比结果见图 8。由图 8 可知，优化前粗酶液酶活仅有 13.1 U/mL。经过在摇瓶水平对培养基成分进行优化，最高酶活为18.2 U/mL。在最佳培养基的条件下，进行 5 L 发酵罐放大试验，并对发酵条件及工艺进行优化。最优的发酵条件为甲醇浓度 1.00%、培养基初始 pH5.5、蛋白胨浓度1.5%、酵母粉浓度 1.5%、接种量 10%、诱导温度 30 益、流加甲醇。优化后得到的最高酶活为 25.1 U/mL，细胞湿重 244 g/L。相较于未优化单位粗酶液酶活提升了91.6%，对中试具有一定的指导意义。2.5AaeUPO 在 H2O2检测中的应用2.5.1H2O2标准曲线的绘制H2O2标准曲线见图 9。由图 9 可知，采用 AaeUPO 检测 H2O2，在 H2O2浓度 580 滋mol/L 范围内呈良好的线性关系，回归方程为 y=0.028 37x+0.006 71，相关系数 R2=0.994 62。按照试验方法平行 20 次测定空白试剂，标准偏差为 0.04，并由此计算出 H2O2最低检测限为 5 滋mol/L。6050403020100020180发酵培养时间/h40 60605040302010080 100 120 140 16012%10%8%12%10%8%图 5接种量对 AaeUPO 表达的影响Fig.5Effect of inoculation amount on AaeUPO expression图 6诱导温度对 AaeUPO 表达的影响Fig.6Effect of induction temperature on AaeUPO expression6050403020100020180发酵培养时间/h40 60605040302010080 100 120 140 16032 益30 益28 益32 益30 益28 益6050403020100020180发酵培养时间/h40 60605040302010080 100 120 140 160流加分批加入流加分批加入302520151050发酵罐优化摇床优化优化前图 8优化前后的粗酶液酶活Fig.8Comparison of activities of crude enzyme before and afteroptimization生物工程OD600酶活OD600酶活OD600酶活186食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期图 9H2O2标准曲线Fig.9Working curve of H2O22.5.2干扰试验当 H2O2浓度为 50 滋mol/L 时，设定相对误差不大于 5%。添加 10 倍浓度的 Fe3+、Zn2+、K+、Na+、NH4+、CO32-、SO42-、SO32-均不会影响测定结果。2.5.3加标回收试验对 3 个试剂样品进行相同程序的加标回收试验，分析结果见表 3。由表 3 可知，在蒸馏水和矿泉水中未检测到H2O2，在啤酒中检测到 H2O2浓度为 6.4 滋mol/L。此外，3 种不同浓度的 H2O2加标回收试验的回收率为 85.1%96.1%，表明使用 AaeUPO 检测 H2O2具有很好的适用性，可用于实际样品的检测。3结论本试验通过摇瓶水平发酵优化了甲醇浓度、培养基初始 pH 值、酵母粉浓度和蛋白胨浓度，通过正交试验确定了毕赤酵母摇瓶水平高效表达 AaeUPO 的基本发酵条件：甲醇浓度 1.00%、培养基初始 pH5.5、蛋白胨浓度 1.5%、酵母粉浓度 1.5%。根据验证试验，得出最优发酵条件下粗酶液酶活达到 18.2 U/mL。在摇瓶水平发酵试验的基础上进行 5 L 发酵罐放大试验，优化后以接种量 10%、诱导温度 30 益、流加甲醇作为最终工艺条件。最终得到的细胞湿重 244 g/L，最高酶活为25.1 U/mL，相较于初期未优化酶活提升了 91.6%。将AaeUPO用于实际样品的 H2O2检测，结果表明，AaeUPO对于 H2O2具有较好的检测性能，检测限达到 5 滋mol/L，抗干扰性能强。参考文献：1DUONG H D,RHEE J I.Development of ratiometric fluorescencesensors based on CdSe/ZnS quantum dots for the detection of hydro原gen peroxideJ.Sensors,2019,19(22):4977.2LIU T,ZHANG S X,LIU W,et al.Smartphone based platform for ra原tiometric fluorometric and colorimetric determination H2O2and glu原coseJ.Sensors and Actuators B:Chemical,2020,305:127524.3LU C F,WANG Y,XU B Y,et al.A colorimetric and fluorescencedual-signal determination for iron(II)and H2O2in food based on sul原fur quantum dotsJ.Food Chemistry,2022,366:130613.4LUO S,KAN X W.Specifically triggered dissociation based ratio原metric electrochemical sensor for H2O2measurement in food sam原plesJ.Food Chemistry,2022,387:132922.5DANG W J,SUN Y M,JIAO H,et al.AuNPs-NH2/Cu-MOF modi原fied glassy carbon electrode as enzyme-free electrochemical sensordetecting H2O2J.Journal of Electroanalytical Chemistry,2020,856:113592.6DING X,WANG F X,HU H,et al.Tea-polyphenol green fabricatingcatkin-like CuAg for electrochemical H2O2detectionJ.Colloids andSurfaces B:Biointerfaces,2022,219:112827.7ZENG X D,JIANG C,ZHANG Q,et al.A novel simple fluorescentprobe for the 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