细胞周期及其调控(讲义)PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,医学分子细胞生物学,1,细胞周期及其调控,Cell Cycle&Cell Regulation,2,第一节,细胞周期各时项的动态变化,3,一、细胞周期概念,细胞周期,（,cell cycle）：,是指细胞从上一次分裂结束开始生长，到下一次细胞分裂结束所经历的过程，又称细胞增殖周期。,细胞周期时间,（,T,C,）,细胞周期经历的时间。,4,细胞周期,间期,分裂期,（,M,期）,DNA,合成前期（,G,1,期,G1 gap1,）,DNA,合成期（,S,期,Synthsis phase,）,DNA,合成后期（,G,2,期,G2 gap2,）,前期,中期,后期,末期,细胞周期,中的细胞,G,1,期,G,2,期,S,期,M,期,细胞周期分为：,G,1,期、,S,期、,G,2,期和,M,期,四个时期。,(,Mitosis,division）,5,终端分化细胞,G,0,周期性细胞,细胞类型（增殖特性）,周期性细胞,：,始终保持旺盛的增殖活性。,G,0,期细胞,：,一般不分裂，暂不增殖细胞。,终端分化细胞,（无增殖能力细胞）结构和功能高度特化。,周期性,细胞,终端分化细胞,6,研究方法：,流式细胞术 细胞同步化 生化方法等等,7,（一）,G,1,期（,DNA,合成前期）,G1,早期,：细胞体积增大、生物合成、,形成细胞器,触发蛋白、钙调蛋白增加。,体积、表面积、核质比,G1,晚期,：,H1,及多种蛋白的磷酸化，为,DNA,合成准备。,信号分子调控,G0 G1,晚,S,期,start point,（DNA,合成相关酶，细胞周期运行的蛋白）,8,（二）,S,期（,DNA,合成期）,1.,DNA,复制 多种酶的参与。,2.蛋白质合成：（组蛋白、非组蛋白）组装核小体。,3,.中心粒的复制，并发生分离，发挥微管的组织作用。,9,（三）,G,2,期,（有丝分裂准备期）,1.促有丝分裂因子(,MPF),合成,2.微管蛋白（,tubulin),合成,3.0.3%,DNA,复制,4,.结,构功能蛋白的合成,G,2,期,check point：,（,1,）是否完成,DNA,复制？,（2）是否有,DNA,错误复制？,10,有丝分裂的主要特征是：,姊妹染色单体分离；核膜、核仁破裂重建。,人为的划分为四个时期,：,前期,、,中期,、,后期,、,末期,。,（四）,M,期,（有丝分裂期）,11,细胞有丝分裂过程,12,1.,有丝分裂,间期,核 膜,核 仁,染色质,中心粒,13,1.前期,染色质凝缩，分裂极确立与纺锤体开始形成，,核仁解体，核膜消失。,前 期,14,星体微管：,由中心体向外放射，末端结合有分子马达，负责两极的分离,动粒微管：,由中心体发出，连接在染色体着丝点动粒上,着丝点上具有马达蛋白。,极体微管：,由中心体发出，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子,马达，负责将两极推开。,-,-,+,+,+,+,+,纺锤体有三种微管结构：,15,染色体的运动,16,Two centrosomes,and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the surface of an early prophase newt lung cell nucleus.,17,2.,中期,染色体排列到在细胞的赤道面上。,赤道板,中 期,18,3.,后期,姐妹染色体单体分离并移向细胞两极。,后 期,19,后期,阶段染色体的分离由微管,去聚合假说解释：,动粒微管不断解聚缩短,造成,的拉力将染色体拉向两极。,机理,：,微管正端插入,动粒,的外层,微管在此端去组装。,动粒中,的,ATP,水解,提供能量,驱动微管上的马达分子向极,部移动,拉动染色体向极移动。,20,4.,末期,从子染色体到达两极，至形成两个新细胞的时期。,两个出现：,核膜出现,、,核仁出现,两个消失：,染色体消失,、,纺锤丝消失,中间小体,21,从子染色体到达两极，至形成两个新细胞的时期。,主要标志是子核的形成和胞质分裂,。,中间小体,22,动物细胞的胞质分裂通过胞质收缩环的收缩实现，收缩环由大,量平行排列的肌动蛋白组成。,用细胞松弛素处理这一时期的细胞，会出现什么现象？,23,Dividing Muscle Myoblast(primative muscle cell),(SEM x8,000),24,第二节,细胞周期调控的动力因素,25,一、细胞周期调控蛋白,(cell cycle-regulating protein),CDK,类蛋白激酶,催化亚单位,细胞周期素（,Cyclin),调节,亚单位,CDK,抑制因子（,CKI）,抑制,CDK,激酶活性,M,期促发,因子,(MPF),MPF,的发现：一种在,G2,期形成，能促进,M,期启动的调控因子，即促细胞成熟因子或促细胞分裂因子（,MPF)。,（一）细胞周期调控研究过程的重要事件：,CDK,：,(cyclin-dependent protein kinases,）,26,（二）细胞周期调控蛋白的种类,1.,CDK,类蛋白激酶,（,cyclin-dependent kinase）,：,CDK,与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故称细胞周期素依赖性蛋白激酶(,cyclin-dependent kinase,CDK,),作用：,CDK,可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。,在动物中已知7种,CDK,，CDK1-7。,分为四类：,G1,、,G1/S、S,期,CDK,和,M,期,CDK,。,27,2.细胞周期素,（,cyclins),是一类随细胞周期的变化呈现周期性出现和消失的蛋白质。（,A,、,B,、C、,D,、,E,等几类，亚型，,20,多种）,表达时间不同，执行功能多种多样。,特点：在细胞周期中呈周期性变化。,作用：能与,CDK,结合，激活,CDK,，,间接调节细胞周期运行。,28,D E A B,已知30余种，在脊椎动物中为,cyclinA1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H,等。,分为4类：,G1,型、,G1/S,型、,S,型、,M,型。,G,1,、G,1,/S、G2,期,(Cyclin D、E,、,A),M,期,(Cyclin B),29,不同类型,CDK-Cyclin,复合物,*包括,D1-3，,各亚型,cyclin D,在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,30,3.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子,（,CDK inhibitor,CKI）,CDKI,是对,CDK,激酶起负性调控作用的蛋白质。,已发现多种,CDKI,INK4,家族:,p16,、,p15、p18、p19,CIP/KIP,家族:,P21、27、57,在,G,1,期抑制多种,CDK,。,31,CKI,对细胞周期起负调控作用，分为：,Ink4:P16,ink4a,P15,ink4b,P18,ink4c,P19,ink4d,。,特异性抑制,cdk4-cyclin D1,cdk6-cyclin D1。,Kip：P21,cip1,、P27,kip1,、P57,kip2,，,抑制大多数,CDK,的激酶活性。,P21,cip1,还能与,DNA,聚合酶,的辅助因子,PCNA,结合，直接抑制,DNA,的合成。,32,M,期,CDK,的激活起始于分裂期,cyclin,的积累。,结合,M,-,cyclin,的,CDK1,被,Wee1（,抑制因子）将,Thr14,和,Tyr15,磷酸化而不具有活性，使,CDK/cyclin,不断积累。,在,M,期，,Wee1,的活性下降，,CDC25,磷酸酶使,CDK,去磷,酸化，去除了,CDK,活化的障碍。,CDK,的激活需要,Thr161,的磷酸化，它是在,CDK,激酶,(,CAK),的作用下完成的。,（三）,M,期,CDK,的,激活,33,M,期调控：,1.,M-CDK,活化,（涉及,CyclinB、CAK、cdc25、Well1）,2.,CDK1,激发,M,期所有事件,CDK1,34,APC,APC,泛素蛋白连接酶复合体,M-Cylin,降解,泛素蛋白,多聚化,蛋白酶体,4.,3.促后期蛋白复合体,（,Anaphase Promoting Complex),APC,M,中,M,后,泛素蛋白（,Ubiquitin),cyclin,降解盒,4.,CDK1,活性下降 出,M,期,细胞核重建、染色体解螺旋、启动收缩机制。,35,进出,S,期调控：,M,期末,G1,CDKs,活性0,G1(,晚期,),增殖信号（激素、生长因子）,G1 cyclin,转录,cyclinD+cdk4/cdk6,G1/S,转换,“,Start”,S,期,DNA,合成启动，,cyclin+,CDK2（SCDK）,保证精确复制（,pre RC）,复制,前复合体,(prereplicationcomplex,，,Pre,-,RC,),36,CDK activating,活性位点,抑制位点,37,由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错，这些信号,可使细胞周期停留在某些点上，称为限制点。,4,个主要检验点：,G1/S,限制点：,DNA,是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称,start,点，在哺乳动物中称,R,点(,restriction point)。,S,期限制点：,DNA,复制是否完成？,G2/M,限制点：,DNA,是否损伤？细胞体积是否足够大？,中-后期限制点：,纺锤体组装限制点,。,二、细胞周期限制点（,check point）,38,Four,C,heckpoints,39,（,1,）限制点在细胞周期调控中的作用,细胞周期有敏感点，确保细胞周期事件有序进行，检,测，修复。,Checkpoint,：,1.,DNA,损伤检查点,2.DNA,复制检查点,3.,纺锤体组装检查点,40,G1-S,DNA,损伤、复制错误,不能进入,S,期。,G2M,DNA,复制错误，完整精确修复后可通过。,M,中期,-,M,后期,纺缍丝组装/动粒连接错误时，细胞不能进入 后期,控制失调时即可引起各种染色体畸变，基因扩增、突变等,癌发生,41,三、细胞周期中的信号系统调控,温度、,pH、,营养、药物、感染、射线；细胞因,子、激素、生长因子,（一）生长因子,是与细胞增殖有关的信号物质，已知多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（,mitogen）,。,PDGF、EGF、IL、TGF、FGF NGF,等，,对,G,0,细胞进入,S,期有调节,作用。,42,生长因子-受体,信号传递与转换,转录因子/调控蛋白,转录、基因的表达,细胞增殖,作用方式：旁分泌,43,细胞外信号,EGF,、,PDGF,等,具,TPK,活性的受体,GRB,2,P,SOS,P,Ras-GTP,P,Raf,调节其他蛋白活性,MAPKK,MAPK,P,P,P,细胞核,反式作用因子,调控基因表达,细胞膜,二聚化,跨膜受体型,TPK,44,信号通路：,ras,、,cAMP,、磷脂酰肌醇途径。,如通过,ras,途径，激活,MAPK,，,MAPK,进入细胞核,内，激活,c-myc,，,myc,作为转录因子促进,cyclin D,、,SCF,、,E2F,等,G1-S,有关的基因表达，细胞进入,G1,期。,生长因子的作用方式,45,Ras,蛋白：,介导的,MAPK,信号转导途径是具有酪氨酸激酶活性的大,多数生长因子及其受体传递信息的主要通路，是细胞,周期正常运行的信号指令系统之一、主要由,Ras,蛋白,Ras,转换因子,(,如,Raf,1),丝裂原活化蛋白激酶,(MAPK),等部分组成。与丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化有关。,46,（二）抑素（,chalone,),和细胞周期,具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。,是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起,抑制作用,的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。,作用于,G1,期的抑素可阻止细胞进入,S,期，称,S,因子,作用于,G2,期的抑素可阻止细胞进入,M,期，称,M,因子,47,p53,、,P21,及,Gadd45,在,G1,阻滞中的作用,P53,有多种下,游效应分子：如,MDM2,，,P21WAFl,，,Gadd45,，,Bax,IGFBP3,，,Fas,等。,MDM2,通过与,P53,蛋白氨基末端结合来阻止,P53,蛋白转录,激活，形成一个,“,负反馈环,”,。,MDM2,的正常功能是限制,GI,期阻滞的时间，使,DNA,损伤修,复后的细胞重新进入细胞周期。,48,Gadd45,和,P21WAFl,是参与辐射所致细胞,G1,期阻滞的重要,分子。,P53,P,21wAF1,通路是通过,CDK,周期蛋白活性抑制，,Rb,脱,磷酸化而发挥作用的。,Gadd,（,growth arrest and DNA damage,）是一些生长抑,制和,DNA,损伤诱导的基因，,Gadd45,是其中一员，也是野,生型,P53,诱导,G1,期阻滞的一条通路。,49,参与的相关蛋白及其作用：,(1)p21WAF1/CIP1,p21,基因定位于第六号染色体短臂上,(6p21.2,），,P21,蛋白定位于细胞核中，属,CKI,分子（,CDK,抑制分子），能广泛抑制各种周期蛋白,CDK,复合物。,野生型,P53,蛋白作为转录因子可诱导,p21WAF1/CIP1,基因的表达，抑制,CDK2,和,CDK4,对,pRB,蛋白的磷酸化失活，进而导致,G1,、,G1/S,和,S,期延迟，使,DNA,损伤有时间得以修复。,50,（,2,）,ATM,基因,AT,：毛细血管扩张性共济失调症,;,ATM,基因是,AT,唯一致病基因；,对,AT,纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导,P53,蛋白增加、,p21wAFl,和,Gadd45,转录和翻译水平增强的动态变化，表明,ATM,很可能是,DNA,损伤反应途径中,p53,的上游分子。,51,ATM,（,ataxia telangiectasia-mutated gene,）,最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有,1%,的人是,ATM,缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。,ATM,编码蛋白激酶，与损伤,DNA,结合，信号通路有两条,:,激活,Chk1,（,checkpoint kinase,）,使,cdc25,的,Ser216,磷酸化失去活性，抑制,M-CDK,的活性，中断细胞周期。,激活,Chk2,，使,P53,被磷酸化而激活，然后,P53,作为转录因子，导致,P21,的表达，,P21,抑制,G1-S,期,CDK,的活性，中断细胞周期。,52,53,(3),P16,INK4a,P16,INK4a,基因位于人类染色体,9p21,区，编码由,148,个氨基,酸组成的分子量为,16kD,蛋白质。,P16,INK4a,与周期蛋白,D1,竞争性结合,G1,期激酶,CDK4,CDK6,，抑制其对,pRB,的磷酸化作用，使游离的,E2F-1,与未磷酸化的,PRB,结,合，依赖于,E2F-1,转录的基因不能转录，,P16,INK4a,间接抑,制包括,DNA,合成在内的多种生化反应，使细胞周期正,常运行。,54,（,4,）,pRB,pRB,的去磷酸化在,M,及,s,期由蛋白磷酸酶,1,催化进行。,在周期蛋白,CDK,复合物与蛋白磷酸酶,1,的协同作用下，,pRB,的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着,G1,限制点的,“,开启和关闭,”,，从而保证细胞周期的有序运行,及细胞的正常增殖。,55,生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进,cyclin,基因表达；,cyclin,与相应的,CDK,结合为激酶复合物对,pRb,进行磷酸化；,磷酸化的,pRb,释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子,E2F,以,及具激酶活性的,CAB-1,蛋白等；游离的,E2F,进入核内,与多种具,特殊序列的基因启动子区结合,(,如,c-myc,、,b-myb,、,cdc2,、二氢,叶酸还原酶、,TK,及,E2F-1,基因等,),促进这些基因的表达；这些,基因的产物促进细胞通过,G1/S,调控点,.CKI,通过抑制,cyclin-CDK,激酶活性,使,pRb,不能磷酸化,pRb,仍与,E2F,结合,E2F,则不能进入,核内发挥转录作用,使细胞停滞于,G1,期,.,G1/S,调控点以,pRb,为中心构成一个复杂网络的共同模式,56,57,细胞周期长短测定,脉冲标记,DNA,复制和细胞分裂指数观察测定法,流式细胞仪测定法,(Flow Cytometry),缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分,裂间期和分裂期的准确时间。,58,细胞周期同步化,1,人工选择同步化,（,药物诱导法,）,条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：,将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移,到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。,59,人工选择同步化,2,有丝分裂选择法：,用于单层贴壁生长细胞。优点：细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。缺点：是 分离的细胞数量少。,密度梯度离心法：,根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点：方法 简单省时，效率高，成本低。缺点：对大多数种类的细胞并不适用。,60,药物诱导法（,DNA,合成阻断法）,G1/S-TdR,双阻断法：将细胞群阻断于,G1/S,交界处。优点：同步化效率高，适合所有体外培养细胞体系。缺点：是诱导过程可造成细胞非均衡生长。,分裂中期阻断法,通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。优点：是操作简便，效率高。缺点：是这些药物的毒性相对 较大。,61,第三节,DNA,受损阻止细胞,周期的分子学说,62,一、,DNA,损伤的后果,:,信号传导异常,长期效应,老化,肿瘤,疾病,DNA,修复机制,短期效应,异常增生和代谢,生理功能紊乱,细胞死亡,细胞增殖减少,基因表达异常,基因组不稳定,63,哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制,DNA,损伤,P21,Gadd 45,Bax,P53,CDK/cyclin,Gadd45 Gadd45-PCNA,Blocking cell cycle,Excision repairing,Cell apoptosis,64,65,66,二、细胞衰老的理论,（一）基因转录或翻译差错、代谢废物积累；,（二）,ROS,引发脂质、蛋白质和核酸分子氧化性损伤；,（三）端 粒 钟 学 说（,telomere clock theory),（四）衰老基因与抗衰老基因,1.,衰老基因,人类：载脂蛋白,E4,基因、,淀粉样蛋白基因,p16,p53 p21 RB,基因,2.,抗衰老基因,WRN bcl-2,67,CDK22,，,cyclinA,、,B,和,c-fos,表达下降,不能是,Rb,磷酸化,E2F,与,Rb,结合，从而不能发挥转录作用,细胞不能进入,S,期,细胞进入,S,期,生长因子,68,（二）细胞衰老的生化变化,DNA,复制、转录、修复能力,端粒长度,DNA,甲基化,DNA/chromosome,损伤,2.mRNA,与核糖体结合能力 蛋白质合成能力,3.,蛋白质分子损伤，功能,酶活性,69,第四节,细胞周期与疾病,70,一、癌与细胞周期,癌基因(,oncogene),:,能促使细胞无限增殖、癌变的,DNA,序列。,分若干基因家族（已发现近百种癌基因,）,抑癌基因（,suppression-oncogene),：,存在于正常细胞中、能抑制细胞恶性增殖的基因。,71,1,细胞周期驱动机制失控,Cyclins,的过表达（,Overexpression of cyclins,）,肿瘤的发生与,cyclin,（,D,、,E,）过量表达有关。,Cyclin D1,（,Bcl-1,）过表达原因（原癌基因）,乳腺癌、胃癌、食道癌存在,Cyclin D1,基因扩增过度。,基因突变,:,Cyclin D,1,T,286,突变,Cyclin D,1,泛素化受阻,Cyclin D,1,72,染色体倒位（,Chromosome inversion,）,Cyclin D,1,基因倒位于甲状旁腺启动子控制，,Cyclin D,1,蛋白合成,染色体易位（,Chromosome translocation),甲状旁腺腺癌,Bcl-1 t(11:14)(q13:q32),易位,Cyclin D,1,受,Ig,重链基因增强子影响,Cyclin D,1,表达,73,CDK,表达异常,主要见于,CDK,4,、,CDK,6,过表达。,CDK,4,+cyclin D,结合,CDK,4,/cyclin D CDKs,表达,pRb pRb,磷酸化 细胞增殖过度,E2F G,1,/S,过渡加速,【Cyclin D,过表达致肿瘤机制,】,Cyclin D,过表达,+,生长因子,CDKs,瀑布效应 细胞增殖过度,易发生细胞癌变,可能,74,CDI,表达不足和突变,肿瘤细胞中常出现,CDI,（肿瘤抑制基因）表达不足或突变。,p16,InK4,基因失活原因,突变或缺失、染色体易位、,p16,InK4,高度甲基化。,Mechanism,p16,InK4,基因表达,CDK,4,与,cyclin D,结合,细胞周期处在“易于”被启动状态,易发生细胞癌变,可能,75,【Mechanism】,p53,基因突变,P21,cip1,转录,DNA,受损细胞增殖,Kip/Cip,含量减少（,Deficient expression of Kip/Cip,）,P21,cipl,功能,cyclins/CDKs,活性 细胞周期速度,增殖细胞核抗原（,PCNA,）阻滞,DNA,复制,2.,细胞周期监控机制受损,(Impairment of checkpoint system),主要原因：,G,1,/S,、,G,2,/M,检查点异常,失察结果：探测,DNA,损伤功能降低,（如发现不了,DNA,损伤，会导致基因缺失、易位、染色体重排等）,76,P53,突变或丢失 易发生细胞癌变,致变剂,检测点检查功能 遗传不稳定性 复制忠实性,G,1,/S,交界处失察,P53,进入,S,期,DNA,损伤 修复成功,G,1,/S,检查 停顿,G,1,期 损伤,DNA,修复,修复失败,细胞凋亡 下调,bcl-2,表达、激活,bax,基因,P53,77,表,2,人类肿瘤,p53,基因突变热点和频率,肿瘤型 突变频率（,%,）突变热点 肿瘤型 突变频率（,%,）突变热点,肺癌,56 157,，,248,，,273,前列腺癌,30,不确定,结肠癌,50 175,，,245,，,248,，,273,肝细胞癌,45 249,食道癌,45,不确定 胶质癌,25 175,、,248,卵巢癌,44 273,乳腺癌,22 175,、,248,、,273,胰腺癌,44 273,子宫内膜癌,22 248,皮肤癌,44 248,、,278,甲状腺癌,13 248,、,273,胃癌,41,不确定 白血病,12 175,、,248,头颈鳞癌,37 248,宫颈癌,7 273,膀胱癌,34 280,软组织肉瘤,31,不确定,DNA,病毒,:SV,40,、,HPV,、腺病毒等,P53,蛋白,失活,78,GOOD BYE,79,