酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,酶联免疫吸附试验检测伤寒,O,抗体方法的建立,小组成员：王哲鉴、钟 鑫,陈 阳、刘一宁,指导教师：綦 霞,所在院系：检验医学院,Company Logo,目录,摘 要,1,实验方法,2,结果讨论,3,4,致 谢,Company Logo,摘要,目的：检测伤寒,O,抗体一般采用肥达实验（直接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。能否建立一个用酶联免疫吸附法检测血清中抗伤寒“,O,”抗体的实验体系，提高临床诊断效果是本实验要解决的关键问题。,原理：以伤寒,O,抗原免疫动物，制备出抗伤寒,O,抗体，将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以伤寒,O,抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶联免疫实验。,摘要,摘要,结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤寒,O,抗体的实验体系,结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒“,O,”抗体,实验方法,实验材料：,实验动物,：,家兔（,1.,性格温顺，一般不咬人，但其爪锐利，挣扎时易抓伤操作人员,2.,与伤寒沙门菌种属差异大，可保证产生抗体,3.,体重大，血量多，得到的血清可保证实验顺利进行）,实验试剂：饱和硫酸铵溶液,PBS,透析液 辣根过氧化物酶,(HRP)NaIO4,溶液,2.5%,乙二醇溶液 硼氢化钠溶液 包被稀释液 酶标抗体 待测抗体 稀释液 洗涤液 底物液,实验器材：兔笼 透析膜 离心机 加样器 酶标板,Company Logo,Company Logo,实验步骤,1,2,3,4,制备伤寒,O,抗体,纯化,抗体,酶与抗体的连接,ELISA,竞争检测,伤寒,O,抗,体（预实验,和正式实验）,制备伤寒,O,抗体,颗粒性抗原伤寒杆菌,备注,第一周,第一天,耳缘静脉注射,0.1ml,之前取血,0.7-1ml,，分离血清，待用,第二天,耳缘静脉注射,0.2ml,第三天,耳缘静脉注射,0.2ml,第四天,耳缘静脉注射,0.5ml,第二周,加强免疫：皮下注射,1.0ml,（两侧各,0.5ml,）,第三周,耳中央动脉采血，分离血清,纯化抗体,1,份血清（,5ml,）,+1,份生理盐水,+2,份饱和硫酸铵,置试管中,2000,转离心,20min,弃上清,1.52ml NS,溶解沉淀,透析,24h,收集、标记、冰冻,5,管,缓缓摇动,室温,2h,（,1.5h,）,盐析法,酶与抗体的连接,实验原理：,NaIO4,是强氧化剂，能将,HRP,的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下：,实验方法：,标记过程：,1,.,将,HRP 5mg,溶于,0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc,缓冲液中（老师做）。,2.,滴入,NaIO4 0.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。,4,作用,30min,。,酶与抗体的连接,3.,加入,2.5%,乙二醇溶液,0.5ml,（稳定剂）终止反应，室温,30min,。,4.,加入待标,Ab1.52.0ml,用,pH9.5,碳酸盐缓冲液调整反应液的,pH,至,9.0,左右，,4,过夜。,5.,加入,0.1ml,硼氢化钠，,42,小时。,6.pH7.4 PBS,液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存,酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体,（一）,.,酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体预实验,1.,包被,Ag,：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入,100l,，置,37,作用,4h,或,4,作用,24h,。,2.,洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤,3,次，每次,1min,，于吸水纸上充分拍干。,3.,加入样品：每孔加入酶标,Ab,及,Ab,各,100l,，放入,37,恒温箱中孵育,30min,。（如图,1,）,4.,洗涤：同上,5.,加入底物液：每孔加入底物液,A1,滴、,B1,滴，避光放置约,5-15min,，密切观察。,6.,终止反应,酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体,待测,酶标,原液,1,：,5,1,：,25,1,：,125,阴性,对照,1,：,25,1,：,50,1,：,100,1,：,200,（图,1,）,选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度,酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体,稀释方法：,1.,酶标抗体,1:251200ul(,牛奶）,+50ul,（酶标）,=1250ul,1:50600ul(,牛奶）,+600=1200ul,1:100 600ul(,牛奶）,+600=1200ul,1:200600ul(,牛奶）,+600=1200ul,酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体,2.,待测抗体,1:5600ul(,牛奶,)+150ul(,待测,)=750ul,1:25600ul(,牛奶,)+150ul=750ul,1:125600ul(,牛奶,)+150ul=750ul,酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体,（二）酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体正式实验,选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：,1.,包被,2.,洗涤,3.,加样,(,如图,2),4.,洗涤,5.,显色,6.,判断检出率,酶联免疫竞争法检测伤寒,O,抗体,自己的待测,Ab100ul+,酶标,Ab100ul,别组的待测,Ab100ul+,酶标,Ab100ul,稀释液,100ul+,酶标,Ab100ul,阳性,对照,待测,1,待测,2,待测,3,待测,4,阴性,对照,图,(2),经洗涤显色后,根据颜色深浅判断检出率,若待测组颜色更接近于阳性对照,则记为,“,+,”,，反之则记为,“,-,”,。,结果讨论,（一）实验结果,阴 阳,结果讨论,以酶标抗体,1,：,100,稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，得到以下结果，待测,1,“,+,”,待测,2,“,+,”,待测,3,“,+,”,待测,4,“,+,”,;4,组待测抗体均被成功检出，检出率,100%,。,结果讨论,（二）实验讨论,伤寒，由伤寒杆菌引起，检测伤寒,O,抗体在伤寒杆菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达实验可对抗体进行半定量检测。但近年来发现，随着轻型和亚型病人的增多，伤寒杆菌变异株增多，或发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌或应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂抑制抗体的形成，肥达实验阳性率有下降的趋势，难以满足临床要求。,ELISA,法检测伤寒杆菌抗原或抗体，灵敏度好、特异性强、二者均达到,70%,结果讨论,以上，反应时间短，操作简便，结果易于判断。对伤寒早起诊断，有较高的临床价值，因此，早起诊断以,ELISA,法检测血液中伤寒特异性或抗体为依据,。,Thank You!,