基因诊断主题知识讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,基因诊断主题知识讲座,基因诊断主题知识讲座,第1页,2,本章内容提醒,基因诊疗概念,基因诊疗方法,直接诊疗（,Southern,）,间接诊疗（PCR-RFLP）,DNA,多态,基因诊疗 实例：,基因诊断主题知识讲座,第2页,3,第一节 基因诊疗技术,第二节 基因诊疗方法及实例,基因诊断主题知识讲座,第3页,4,基因诊疗：,利用分子生物学技术从,DNA,水平检测人类遗,传性疾病基因缺点，又称,DNA,分析法。,传统诊疗：表现型基因型,基 因 诊 断：基因型表现型,（逆向诊疗）,基因诊断主题知识讲座,第4页,5,基因诊疗特征：,1,不受材料起源影响,外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等,2,症状前诊疗,尤其对于一些延迟显性疾病如,Huntingtong,舞蹈病,3,产前诊疗,防止患儿出生，提升人口质量,基因诊断主题知识讲座,第5页,6,第一节 基 因 诊 断 技 术,Southern,印迹杂交,基因诊断主题知识讲座,第6页,7,基 因 诊 断 技 术,Northern,印迹杂交,基因诊断主题知识讲座,第7页,8,基 因 诊 断 技 术,斑 点 杂 交,点样,Probe-,32,P,检测,A,B,1 2 3 4,基因诊断主题知识讲座,第8页,9,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,基因诊断主题知识讲座,第9页,10,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,基因诊断主题知识讲座,第10页,11,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,基因诊断主题知识讲座,第11页,12,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,基因诊断主题知识讲座,第12页,13,基 因 诊 断 技 术,多重,PCR,在一个,PCR,体系中加入数对,PCR,引物，覆盖区域不重合,用于检测同一基因多个外显子缺失,E1 E2 E3,基因诊断主题知识讲座,第13页,14,基 因 诊 断 技 术,RT-PCR,以,mRNA,为模板，经逆转录酶合成,cDNA,用于研究基因表示,使微量,mRNA,快速扩增，提升,mRNA,检出灵敏度,基因诊断主题知识讲座,第14页,15,基 因 诊 断 技 术,PCR-SSCP,（Single Strand Conformation Polymorphism）,单链,DNA,因为碱基序列不一样可引发构象差异，这种差异将造成相同或相近长度单链,DNA,电泳迁移率不一样。据此，可用于,DNA,中单个碱基替换、微小缺失或插入检测。,基因诊断主题知识讲座,第15页,16,基 因 诊 断 技 术,-primer,-,32,P-dNTP,掺入,PCR,扩增,产物,变性,单链,DNA,中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,1 2 3 4 5,自显影,1,为正常,结果分析,2,、,4,、,5,为纯合患者,3,为杂合子,.,基因诊断主题知识讲座,第16页,17,基 因 诊 断 技 术,生 物 芯 片,基因诊断主题知识讲座,第17页,18,第二节 基 因 诊 断 方 法及实例,直接诊疗,直接,检测致病基因突变,基因突变类型,缺失、点突变、重复、插入等,间接诊疗,应用,DNA,多态为遗传标识进行连锁 分析，确定待测者是否得到带有致病染色体，从而,间接,地作出诊疗,DNA,多态,RFLP,、,VNTR,、,SNP,基因诊断主题知识讲座,第18页,19,一,DNA,多态,DNA,多态（,DNA Polymorphism,）：,群体中每个个体,DNA,区域中等位基因（或片段）存在,两种,或,两种以上,形式,，对,基因功效没有影响,，称,DNA,多态,。,它经过孟德尔方式遗传。常见做遗传分析中标识。,基因诊断主题知识讲座,第19页,20,DNA,分析中常见遗传性多态性标识有,3,类：,1,）,RFLP,：,称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标识；,2,）,重复序列多态性（,VNTR,）,：如短串联重复序列（,STR,），为第二代多态性标识；,3,）,单碱基多态性（,SNP,）,：,DNA,序列,单个,核苷酸差异，为第三代多态性标识。,基因诊断主题知识讲座,第20页,21,一,),限制性片段长度多态性,Restriction Fragment Length Polymorphism,，,RFLP,因为碱基变异可能造成限制酶切点,消失,或新酶切点,出现,，引发不一样个体,DNA,在用同一限制酶切割时，产生不一样长度,DNA,片段，称,RFLP,RFLP,按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用遗传标识。,基因诊断主题知识讲座,第21页,22,Allele II,产生了新酶切点,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLP,Southern,blot,检测结果,基因诊断主题知识讲座,第22页,23,AlleleII,酶切位点消失,基因诊断主题知识讲座,第23页,24,二,),数目变异串联重复，,variable number tandem repeats,VNTR,）,重复序列以各自,关键序列,（重复单元），首尾相连,屡次重复,，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即,VNTR,。,散在分布于染色体上。,重复单位,625bp,长，,称为小卫星,DNA,。,重复单位,26bp,长，如（,TA,）,n,(CGG)n,等，,称为微卫星,DNA,。,基因诊断主题知识讲座,第24页,25,VNTR,两侧酶切位点固定，但两酶切点之间串联重复拷贝数不一样，酶切后产生不一样长度片段。,DNA,多态能够经过,PCR,扩增后电泳来检出，称,扩增,片段长度多态,（,amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP,）,基因诊断主题知识讲座,第25页,26,VNTR,酶切，电泳后检测结果,大,小,基因诊断主题知识讲座,第26页,27,PCR-VNTR,检测,基因诊断主题知识讲座,第27页,28,PCR-VNTR,基因诊断主题知识讲座,第28页,29,基因诊断主题知识讲座,第29页,30,三,),单核苷酸多态性（,SNP,）,（,Single Nucleiotide Polymorphism,）,SNP,：发生在基因组中单个核苷酸替换,依据,SNP,在基因中位置，分为：,基因编码区,SNP,基因周围,SNP,基因间,SNP,在人类基因组中每,100300,个核苷酸就有一个,SNP,基因诊断主题知识讲座,第30页,31,二、基诊疗方法及实例,直接检测致病基因本身异常。通常使用基因,本身或邻近,DNA,序列,作为探针，进行,Southern,杂交,，或经过,PCR,扩增产物,，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适合用于已知基因异常疾病诊疗。,直接,基因诊疗及实例,基因诊断主题知识讲座,第31页,32,直接基因诊疗,突变型,遗传病,直接,基因诊疗,e.g.,镰形细胞贫血,Gene,诊疗,基因诊断主题知识讲座,第32页,33,1,）,Southern blot,珠蛋白链基因第,6,位密码子发生突变,G,A,GG,T,G,谷,Aa,缬,Aa,e.g.,镰形细胞贫血,Gene,诊疗,基因诊断主题知识讲座,第33页,34,已知限制酶,Mst 1,识别序列（,CCTNAGG,）,CCTG,A,GG,CCTG,T,GG,突变后不能识别，,酶切位点消失，限制酶切片段长度发生改变。,基因诊断主题知识讲座,第34页,35,2)ASO,探针诊疗,已知突变,Gene,部位和性质，合成寡核苷酸探针，,32,P,标识，进行斑点杂交。,Normal,Gene Probe,与正常,Probe ,杂交稳定,Mutation,S,Gene Probe,与异常,S,杂交 稳定,基因诊断主题知识讲座,第35页,36,等位基因特异性寡核苷酸探针（,ASO,）,（,Allele-specific-oligonucleotide,）,基因诊断主题知识讲座,第36页,37,斑点杂交结果：,/,/,S,S,/,S,正常探针,突变探针,突变,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第37页,38,突变,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第38页,39,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,1,）,地中海贫血基因诊疗,基因不一样程度缺失可引发不一样类型,地中海贫血。,直接基因诊疗,缺失,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第39页,40,Southern blot,检测结果：,/-/-/-/-,正常 缺,1,缺,2,缺,3,缺,4,14kb,10kb,缺失,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第40页,41,2,）,地贫,Gene,诊疗,珠蛋白基因两侧,有,pst,1,酶切位点，,pst,1,酶切正常可得到,4.4kb,片段,珠蛋白基因缺失,0.7kb,片段，,pst,1,酶切则得到,3.7 kb,片段为,0,缺失,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第41页,42,以,Gene,为探针，,Southern blot,方法检测,/,A,/,0,0,/,0,4.4kb,3.7kb,缺失,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第42页,43,3,）,DMD,基因诊疗,DMD,属,XR,DMD,基因是最大基因，有,79,个外显子,DMD,基因突变主要以,缺失,为主，可包括基因不一样部位,E1 E2 E3,缺失,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第43页,44,病例,外显子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm,3,43,50,13,6,47,60,52,bp,535,113,缺失,型,遗传病,直接,基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第44页,45,二）间接基因诊疗方法及实例,当,致病基因,即使已知，但其,异常性质未知,时，或疾病,Gene,本身还未知,时，主要经过,Gene,和,DNA,多态连锁分析,间接地,作出诊疗。,基因诊断主题知识讲座,第45页,46,连锁分析基于,遗传标识,与,Gene,在染色体上连锁，经过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代取得某种,遗传标识,与,疾病,关系，间接推断受检,子代是否取得带有致病基因染色体,，间接地判断并做出诊疗。,遗传标识是基因组中,DNA,多态,如：,RFLP,，,VNTR,等。,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第46页,47,遗传标识,相关基因,表型分析,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第47页,48,1,Southern blot,-RFLP,诊疗,(PKU),PAH,基因两侧有,Msp1,酶切位点,用该酶消化可产生,23kb,、,19kb,两种等位片段，以,PAHcDNA,为探针与,PKU,家系组员外周血,DNA,杂交。,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第48页,49,患者为,19kb,片段纯合子,说明患者缺点,PAH,基因与,19kb,片段连锁,其父、母亲缺点,PAH,基因与,19kb,片段连锁，其,23kb,片段与正常,PAH,基因连锁。,II2,为,23kb,和,19kb,片段杂合子，为表型正常致病基因携带者。,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第49页,50,2,成年型多囊肾病诊疗,例：成年型多囊肾病,APKD,，,AD,，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终造成肾功效衰竭和尿毒症。,APKD,Gene,定位,16p13,，但,致病基因,还未克隆,，,基因产物,生化性质和疾病发病机理也,还未说明,，但已证实,APKD Gene,与,珠蛋白基因,3,端附近一段,小卫星,DNA,序列,（,3HVR,）,紧密连锁,，所以，能够经过连锁分析进行诊疗。,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第50页,51,以,3HVR,为探针，与,PvuII,酶切后家系相关组员基因组,DNA,进行,Southern Blot,基因组,DNA,PvuII,酶切,DNA,片段,变性,转膜,探针,变性,杂交,结果分析,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第51页,52,1 2,1 2 3 4 5,5.7kb,3.4kb,2.3kb,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第52页,53,结果分析,患者（,I1,、,II1,和,II2,）有,3.4kb,片段，说明致病基因与,3.4kb,片段连锁，并按孟德尔方式遗传。,II5,不含,3.4kb,片段，产前诊疗正常。,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第53页,54,3,甲型血友病,诊疗（,PCRRFLP,）,甲型血友病,基因诊疗：已知甲型血友病,XR,，取得家系组员基因组,DNA,。,PCR 142 bp,BcLI,142bp 99 bp 43bp,电泳,结果分析,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I-,Bcl I+,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第54页,55,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第55页,56,142bp,99bp,1 2,1,2,3,III,1,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第56页,57,结果分析,1,）先症者,II 1,含有,99bp,片段而发病，该片段来自母亲。,2,）,II2,有,142bp/99bp,，为杂合子。,142bp,来自父亲，为正常片段，,99bp,片段是来自母亲而成为携带者。,3,）,1,为,99bp,片段,假如是 男性 为患者（,99bp,片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第57页,58,单体型分析,有时用一个酶和一个探针不能提供可供分析信息，需采取一个以上酶结合几个基因探针杂交分析,。,依据同一条染色体上限制性位点丢失或取得而出现,一组,多态位点所组成,不一样片段长度组合类型,进行分析，该分析方法称,单体型分析,（,Haplotyping),间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第58页,59,举例：,PKU,家系,Hind,酶切：,患儿,4.2/4.0kb,杂合体,父母,4.2/4.0kb,杂合体,均为杂合体，无法分析。,再用,sph,酶切：,患儿,纯合,7.0kb,父亲,纯合,7.0kb,母亲,9.7kb,和,7.0kb,杂合体,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第59页,60,结 果,1 2,1 2 3,4.2kb,4.0kb,11kb,9.7kb,7.0kb,I,II,Hind,Sph,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第60页,61,分析,：,患儿,1,从母亲和父亲各取得一个,7.0kb,突变型,从,Hind,酶切结果看出：,正常同胞,3,为纯合,4.0kb,，也是,sph 7.0kb,纯合体，故母亲,H 4.0kb S 7.0kb,组成单体型，母亲,7.0kb,为突变型，所以，,母亲,H 4.0kb S 7.0kb,为突变单体型。,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第61页,62,患儿,1,为,Hind 4.2/4.0kb,杂合体，,故,父亲,H 4.2kb S 7.0kb,为突变单体型,母亲,H 4.2kb S 9.7kb,和父亲,H 4.0kb S 7.0kb,为,正常,单体型。,2,两个单体型分别为,H 4.2kb S 9.7kb,（母）和,H 4.0kb S 7.0kb,（父）,正常个体,3,两个单体型分别为,H,4.0kb S 7.0kb,（,母）和,H 4.0kb S 7.0kb,（父）,携带者,间接基因诊疗,基因诊断主题知识讲座,第62页,