美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生化指标、抗病力及代谢组学的影响.pdf

DOI:10.12131/20220208文章编号：2095 0780（2023）04 0086 12美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生化指标、抗病力及代谢组学的影响陈 荔a，徐嘉欣a，李榴佳a，赵成法b，龙晓文a大理大学 a.农学与生物科学学院，b.东喜马拉雅研究院，云南 大理 671003摘要：美洲大蠊(Periplaneta americana)是一种富含蛋白质、脂肪和生物活性成分的昆虫蛋白来源，具有成为鱼粉替代源的潜力。选取初始体质量约3 g的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)幼鱼为研究对象，采用美洲大蠊粉分别替代0%、50%鱼粉配制的2种等氮等能饲料，持续投喂18周，探究了美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生长、生化指标、抗病力及代谢组学的影响。养殖实验结束后，采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对剩余虹鳟幼鱼进行攻毒实验。结果表明：实验组幼鱼生长性能及攻毒后成活率均显著高于对照组(P0.05)；实验组幼鱼血清中免疫球蛋白(IgM)、总抗氧化能力(T-AOC)、肝脏中溶菌酶(LZM)和头肾中过氧化氢酶(CAT)活性均显著高于对照组(P0.05)；代谢组学分析结果显示，两组血清中的差异代谢物主要参与甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等8条生化代谢途径，其中参与甘油磷脂代谢的溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)和磷脂酰胆碱(PC)含量均在实验组显著上调。综上，采用美洲大蠊粉替代饲料中50%的鱼粉可显著提高虹鳟幼鱼的生长性能、抗氧化能力、免疫力以及对嗜水气单胞菌的抵抗力。关键词：虹鳟；美洲大蠊粉；生化指标；抗病力；代谢组学中图分类号：S 963.7文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effects of dietary fishmeal replacement by Periplaneta americana meal onbiochemical indexes,disease resistance and metabolomics of juvenileOncorhynchus mykissCHEN Lia,XU Jiaxina,LI Liujiaa,ZHAO Chengfab,LONG Xiaowenaa.College of Agriculture and Biological Science,b.Institute of Eastern-Himalaya Biodiversity Research,Dali University,Dali 671003,ChinaAbstract:Periplaneta americana is an insect protein source,rich in protein,fat and bioactive components,which may becomea potential alternative source of fishmeal for development and application.In order to study the effects of dietary fishmeal re-placement by P.americana meal on the growth,biochemical indexes,disease resistance and metabolomics of juvenile Onco-rhynchus mykiss,we formulated two isonitrogen and equal energy diets to replace 0%and 50%of the dietary fishmeal withP.americana meal,and had fed the juveniles with an initial body mass of 3 g for 18 weeks.At the end of feeding trial,we chal-lenged the juveniles with Aeromonas hydrophila.The results showed that:1)The growth performance and survival rate after thechallenge in the experimental group were significantly higher than those in the control group(P0.05).2)The levels of serumimmunoglobulin(IgM),total antioxidant capacity(T-AOC),lysozyme(LZM)in liver and catalase(CAT)in head kidney in the第 19 卷第 4 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.42023 年 8 月South China Fisheries ScienceAug.，2023收稿日期：2022-08-01；修回日期：2022-11-12基金项目：大理大学博士科研启动费项目(KYBS2021064)；云南省基础研究计划项目面上项目(202101AT070028)作者简介：陈荔(1996)，女，硕士研究生，研究方向为水生动物生态学。E-mail:通信作者：龙晓文(1985)，男，副教授，博士，研究方向为水生动物营养生理学。E-mail:experimental group were significantly higher than those in the control group(P5.0 mgL1，pH 7.08.5，氨氮质量浓度0.5mgL1，亚硝酸盐质量浓度0.15 mgL1，光照为自然光源，每日于 9:00 和 18:00 进行人工饱食投喂，投饲料量为体质量的 3%5%，每天统计实验鱼饲料投喂量、死亡数量和水温，养殖实验共进行 18 周。1.3 样品采集养殖实验结束后，禁食 24 h，对每组存活鱼的数量进行统计后从每个水族箱随机取 5 尾鱼，用30 mgL1丁香酚麻醉后测量体长与体质量，并进行尾静脉采血，血样于 4 冰箱静置 4 h 后，在4 000 rmin1条件下离心 10 min，取血清一式两份，分别于20、80 冰箱中保存用于血清生化指标和小分子代谢物的检测；解剖取其头肾和肝脏组织于20 冰箱中保存，用于后续生化指标的分析。1.4 攻毒实验养殖实验结束后，对剩余虹鳟幼鱼进行攻毒实验，攻毒感染实验所用菌株为嗜水气单胞菌，菌株来源于上海保藏生物技术中心。嗜水气单胞菌经活化培育、离心、牛肉膏蛋白胨培养、血球计数板计数后根据实验末虹鳟幼鱼的平均体质量，参考Deng 等22的方法，按照 5 259 CFUg1的嗜水气单胞菌剂量对虹鳟幼鱼背部肌肉进行注射后继续养殖 12 d，期间正常投喂换水，观察并记录实验鱼的死亡情况。攻毒期间，对濒临死亡状态(病鱼停止游动，胸鳍微动或不动，失去平衡，腹部朝上，鳃盖微动，鱼体僵直)虹鳟立刻进行抽血解剖，取其血清、头肾和肝脏于20 冰箱中冷冻保存。攻毒 12 d 后，将存活的虹鳟抽血并解剖，取其血清、头肾和肝脏于20 冰箱中保存备用。表1 实验饲料配方21Table 1 Formulation of experimental diets%原料Ingredient对照组Control group实验组Experimental group鱼粉Fish meal30.0015.00美洲大蠊粉P.americana meal10.0025.00面粉Wheat flour16.0016.00豆粕Soybean meal15.0015.00菜籽粕Rapeseed meal5.005.00棉籽粕Cottonseed meal5.005.50玉米蛋白粉Corn gluten meal4.505.50大豆卵磷脂Soy lecithin1.001.00鱼油Fish oil4.504.00豆油Soybean oil5.504.50维生素预混料Vitamin premix1.001.00矿物质预混料Mineral premix1.001.00磷酸二氢钙Ca(H2PO4)21.151.15维生素CVitamin C(30%)0.020.02乙氧基喹啉Ethoxyquinoline0.030.03氯化胆碱Choline chloride(50%)0.300.30注：维生素预混料(每千克饲料)：维生素 A，62500 IU；维生素 D3，15000 IU；维生素 E，1.75 g；维生素 K3，35.4 mg；维生素 B1，100 mg；维生素 B2，150 mg；维生素 B6，150 mg；维生素 B12，0.2 mg；生物素，4 mg；D-泛酸钙，250 mg；叶酸，25 mg；烟酰胺，300 mg；维生素 C，700 mg。矿物质预混料(每千克饲料)：一水硫酸亚铁，200 mg；五水硫酸铜，96 mg；一水硫酸锌，360 mg；一水硫酸锰，120 mg；一水硫酸镁，240 mg；磷酸二氢钾，4.2 g；磷酸二氢钠，0.5 g；碘化钾，5.4 mg；六水氯化钴，2.1 mg；亚硒酸钠，3 mg。Note:Vitamin premix(Per kg diet):Vitamin A,62 500 IU;VitaminD3,15 000 IU;Vitamin E,1.75 g;Vitamin K3,35.4 mg;VitaminB1,100 mg;Vitamin B2,150 mg;Vitamin B6,150 mg;VitaminB12,0.2 mg;biotin,4 mg;D-Calcium pantothenate,250 mg;folicacid,25 mg;niacinamide,300 mg;Vitamin C,700 mg.Miner-al premix(Per kg diet):FeSO4H2O,200 mg;CuSO45H2O,96mg;ZnSO4H2O,360 mg;MnSO4H2O,120 mg;MgSO4H2O,240mg;KH2PO4,4.2 g;NaH2PO4,0.5 g;KI,5.4 mg;CoCl26H2O,2.1mg;Na2SeO3,3 mg.表2 实验饲料的营养成分Table 2 Nutritional composition of experimental diets项目Item鱼粉Fishmeal美洲大蠊粉P.americanameal对照组Controlgroup实验组Experimentalgroup水分质量分数Moisture/%6.375.797.847.26粗蛋白质量分数Crude protein/%66.8769.1141.6841.94总脂质量分数Total lipid/%8.3016.5616.9216.45灰分质量分数Ash/%12.804.507.986.90总能Gross energy/(kJg1)21.2824.7122.2322.2088南 方 水 产 科 学第 19 卷 1.5 饲料常规营养成分测定采用凯氏定氮法(GB/T 64322018)测定实验饲料中粗蛋白质质量分数，105 恒温烘干法(GB/T 64352014)测定饲料水分质量分数；马弗炉高温 550 灼烧法(GB/T 64382007)测定饲料粗灰分质量分数；采用冷冻干燥法将饲料冻干至恒质量后，参考 Folch 等23的方法，采用氯仿-甲醇(VV=21)抽提饲料中的总脂并测定其质量分数。1.6 生化指标测定每个水族箱分别选取 3 尾攻毒前、攻毒后濒临死亡、攻毒后成活虹鳟幼鱼的血清、肝脏和头肾样品进行混合，因此每个实验组分别有 3 个血清、肝脏和头肾样品。称取 0.2 g 左右的肝脏或头肾组织混合样品于 2 mL 离心管中，加入 1 mL 预冷的生理盐水后，用微型匀浆器匀浆 30 s 后，在 4、12 000 rmin1条件下离心 10 min，取上清液用于抗氧化及免疫指标的测定。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，参考其说明书，采用紫外可见光分光光度计或酶标仪测定虹鳟血清、肝脏和头肾中的抗氧化及免疫相关指标。1.7 血清小分子代谢物分析取出80 保存的血清样本，置于 4 条件下解冻，取 200 L 血清加入 1.5 mL离心管中，加入 10 L 内标(0.3 mgmL1的 L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液)后涡旋震荡 10 s，再加入300 L 甲醇-乙腈(VV=21)，涡旋震荡1 min，在冰水浴中超声提取 10 min 后于20 冰箱中静置 30 min，然后在13 000 rmin1、4 的条件下离心 10 min，取 300L 上清液装入 LC-MS 进样小瓶中，进行真空干燥。加入 300 L 甲醇-水(VV=14)复溶涡旋 30 s，进行超声处理3 min 后于20 下静置 2 h。在 13 000rmin1、4 条件下离心 10 min，用注射器吸取上清液 150 L，经 0.22 m 有机相针孔过滤器过滤后，用于小分子代谢物的检测。采用 Dionex U3000 UHPLC 超高效液相串联QE 高分辨质谱仪组成的液质联用系统检测虹鳟幼鱼血清中的代谢物。质谱条件：离子源为 ESI，质谱信号采集为正负离子扫描模式。色谱条件：色谱柱为 ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm2.1 mm,1.8 m)；柱温 40，流动相为 A-水(含体积分数 0.1%的甲酸)，B-乙腈(含体积分数 0.1%的甲酸)，进样体积 5 L；梯度洗脱的条件：正离子模式 01 min，A：95%(体积分数，下同)；1.02.5 min，A：70%；2.56.0 min，A：50%；6.07.0 min，A：30%；7.010.0 min，A：20%；10.012.0 min；A：0%；12.014.0 min，A：0%；14.014.2 min，A：95%；14.216 min，A：95%。负离子模式01 min，B：5%(体积分数，下同)；1.02.5min，B：30%；2.56.0 min，B：50%；6.07.0min，B：70%；7.010.0 min，B：80%；10.012.0min，B：100%；12.014.0 min，B：100%；14.014.2 min，B：95%；14.216 min，B：95%。1.8 数据统计分析计算成活率(Survival rate,RS,%)、体质量增长率(Weight gain rate,RWG,%)、饲料系数(Feed con-version ratio,RFC)和特定生长率(Specific growthrate,RSG,%d1)，公式如下：RS=Nt/N0100%(1)RWG=(Wt W0)/W0100%(2)RFC=FI/(WF WI)(3)RSG=(lnWt lnW0)/t100%(4)式中：Nt为实验末活鱼数量；N0为实验初活鱼数量；Wt为鱼的终末均质量；W0为鱼的初始均质量；t 为实验时间(d)；FI 为摄食量；WF为鱼的终末体质量；WI为鱼的初始体质量。xsx使用 SPSS 17.0 软件对数据进行独立样本 t 检验，P1.0 和 P0.05作为标准筛选差异代谢物。基于 KEGG 数据库对两组虹鳟幼鱼血清中的差异代谢物进行代谢通路富集分析。2 结果 2.1 生长性能分析虹鳟幼鱼的生长性能如表 3 所示。与对照组相比，实验组虹鳟幼鱼的实验末成活率、终末体质量、体质量增长率和特定生长率均显著高于对照组(P0.05)，而实验组的饲料系数显著低于对照组(P第 4 期陈 荔等:美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生化指标、抗病力及代谢组学的影响890.05)。在攻毒后的第 24、第 48、第 72 和第 96 小时，实验组幼鱼的累计死亡率均显著低于对照组(P0.05)，而头肾中的过氧化氢酶(CAT)活性在实验组较高(P0.05)。攻毒后存活虹鳟幼鱼血清中 T-AOC 在实验组较高(P0.05)。虹鳟幼鱼的免疫指标如表 5 所示。在攻毒前、攻毒后濒临死亡及攻毒后成活的虹鳟幼鱼中，实验组血清中的免疫球蛋白(IgM)质量浓度均显著高于对照组(P0.05)；在攻毒前，实验组肝脏中的溶菌酶(LZM)活性显著高于对照组(P0.05)；在攻毒后濒临死亡的虹鳟幼鱼中，实验组头肾中的碱性磷酸酶(AKP)活性显著高于对照组(P0.05)。攻毒前后虹鳟幼鱼血清、肝脏和头肾的抗氧化及免疫指标变化幅度如图 2 所示。对抗氧化指标而言，对照组攻毒实验后血清中 T-AOC 和 T-SOD 的降幅高于实验组，MDA 的降幅低于实验组，而CAT 的升幅高于实验组(图 2-a)；对照组肝脏中T-AOC 和 CAT 的降幅均高于实验组，而 MDA 和T-SOD 的升幅低于实验组(图 2-b)；对照组头肾中 T-AOC 和 T-SOD 的降幅高于实验组，MDA 的降幅低于实验组，对照组的 CAT 上升，而实验组下降(图 2-c)。对免疫指标而言，攻毒实验后，对照组血清 LZM 和补体 3 均呈上升趋势，且升幅高于实验组(图 2-d)；对照组血清 IgM 和 ACP 呈上升趋势，而实验组呈下降趋势；攻毒后两处理组肝脏 LZM、AKP 均上升，对照组的升幅较大，而两处理组 ACP 均降低，实验组的降幅较大(图 2-e)；两组头肾 LZM 均呈上升趋势，对照组的升幅低于实验组，AKP 和 ACP 均呈降低趋势(图 2-f)。2.3 血清代谢组学分析2.3.1血清代谢物的多元统计分析主成分分析(PCA)是一种非监督分析，可反映数据的原始情况，PCA 得分图显示对照组与实验组在 PCA 分析模式下未完全分开(图 3-a)，说明在 PCA 分析模式下两个处理组虹鳟幼鱼血清代谢物水平未发生显著变化。为了获取更加理想的两处理组组间差异代谢物的识别，采用有监督的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型对血清代谢物数据进行深入分析，结果显示两处理组虹鳟幼鱼血清代谢物在PLS-DA 分析模式下完全分开(图 3-b)，表示模型解释能力的参数 R2和 Q2分别为 0.943 和 0.471，可见该模型有效。为更好地获取两个处理组虹鳟幼鱼表3 美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生长性能的影响Table 3 Effect of dietary fishmeal replacement by P.ameri-cana meal on growth performance of juvenile O.mykiss项目Item对照组Control group实验组Experimental group实验末成活率Survival rate at endof experiment/%67.352.6487.521.67*初始体质量Initial body mass/g3.150.023.130.01终末体质量Final body mass/g97.383.44116.242.72*体质量增长率Weight gain rate/%2991.43109.243613.7486.90*饲料系数Feed conversion ratio1.250.03*1.100.02特定生长率Specific growthrate/(%d1)2.720.032.870.02*注：*表示两个处理组之间差异显著(P0.05)。后表同此。Note:*.Significant differences between two diet groups(P0.05).Thesame case in following tables.*01428425670124 487296累计死亡率 Mortality rate/%攻毒后时间对照组 Control group实验组 Experimental group图1 嗜水气单胞菌攻毒后实验鱼的累计死亡率注：*.表示攻毒后，在同一时间点，两个实验组之间累计死亡率存在显著性差异(P0.05)。Fig.1 Mortality of O.mykiss after A.hydrophila challengeNote:*.There is a significant difference in the mortality between thetwo experimental groups at the same time after the challenge(P1 表明该代谢物在实验组显著上调，比值1 表明该代谢物在实验组显著下调。Note:The values in brackets represent the ratio of the content of metabolites in the serum of the experimental group to the content of the same meta-bolite in the serum of the control group.When the ratio is greater than 1,the metabolite content was significantly up-regulated in the experi-mental group.When the ratio is smaller than 1,the reverse applies.第 4 期陈 荔等:美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生化指标、抗病力及代谢组学的影响95的差异代谢物主要涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成和分解代谢以及氨酰-tRNA 生物合成代谢等代谢路径。磷脂酰胆碱(PC)甘油磷脂是生物膜的主要脂质成分，在保证膜结合蛋白、离子通道和受体的正常运作过程中发挥重要作用44。PC 是脂蛋白的基本元素，其分子由不同长度和饱和度的脂肪酸组合而成，在维持膜结构和细胞信号传导过程中扮演关键角色45。本研究中，参与甘油磷脂代谢、含有多个双键结构的溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)和磷脂酰胆碱(PC)含量均在 50%鱼粉替代组显著上调，造成磷脂的不饱和度上升，这有助于细胞膜中受体的正常运作，进而维持细胞的正常功能。这可能是由于美洲大蠊的脂质中含有较多磷脂酰胆碱，替代鱼粉时引入了较多的磷脂酰胆碱46。鞘磷脂是真核生物中一种主要的脂类，具有维持细胞膜结构及信号转导的作用，鞘氨醇(Sphinganine)是鞘磷脂的代谢产物之一，是细胞增殖的负调节剂，其作用是抑制细胞生长并促进细胞凋亡47。有研究发现，鞘磷脂及其代谢产物在肌肉的发生中有重要作用，会影响炎症的发生和免疫过程48。本研究中，参与鞘脂代谢以及坏死性凋亡的鞘磷脂和参与鞘脂代谢的鞘氨醇均在 50%鱼粉替代组显著下调，表明采用美洲大蠊粉替代鱼粉有助于虹鳟体内鞘脂合成途径，进而对机体起到保护作用。4 结论本实验结果表明，采用美洲大蠊粉替代饲料中 50%的鱼粉，可显著提高虹鳟幼鱼的成活率、生长性能、抗氧化能力、免疫力及对嗜水气单胞菌的抵抗力。代谢组学分析结果表明，美洲大蠊粉替代鱼粉主要影响了虹鳟幼鱼体内的磷脂和氨基酸代谢。参考文献：农业农村部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站,中国水产学会.2022 中国渔业统计年鉴 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