猕猴桃致腐菌的筛选鉴定及保鲜剂对其抑制效果研究.pdf

收稿日期:2023-01-06;修订日期:2023-05-09作者简介:章帅文(1995),男,硕士,研究实习员,研究方向为微生物学。基金项目:江西省重点研发计划项目(20192BBFL60032);江西省重点研发计划项目(20202BBF63014)。通信作者:黄国昌(1981),男,硕士,副研究员,研究方向为微生物学。E-mail:hgc163 。第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月江 西 科 学JIANGXI SCIENCEVol.41 No.4Aug.2023 doi:10.13990/j.issn1001-3679.2023.04.010猕猴桃致腐菌的筛选鉴定及保鲜剂对其抑制效果研究章帅文1,许志斌2,熊大维1,顾斌涛1,黄国昌1(1.江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;2.江西省南昌市第二中学,330031,南昌)摘要:为开发一种新型猕猴桃保鲜剂,以腐烂猕猴桃中筛选出的致腐菌为指示菌,探究了苯乳酸、苯乙醇和低聚乳酸 3 种保鲜剂对指示菌的抑制效果,确定最佳保鲜剂配比。结果表明,从猕猴桃烂果中分离到 7 株具有致病力的菌株,经测序鉴定为 3 株致腐菌:腐皮镰刀菌、棘孢曲霉和桔青霉菌。经抑菌实验发现,苯乳酸的最低抑菌浓度为 3.0 g/L,苯乙醇的最低抑菌浓度为 2.0 g/L,低聚乳酸的抑菌性能较差,复配剂最低杀菌浓度比例为苯乳酸 2.5 g/L 和苯乙醇 1.5 g/L,并确定为保鲜剂的最终使用浓度。关键词:猕猴桃;致腐菌;保鲜剂;苯乳酸;苯乙醇;低聚乳酸中图分类号:S663.4 文献标识码:A 文章编号:1001-3679(2023)04-672-06Study on Screening and Identification of Kiwifruit Pathogenic Bacteria and Inhibition Effect of PreservativesZHANG Shuaiwen1,XU Zhibin2,XIONG Dawei1,GU Bintao1,HUANG Guochang1(1.Institute of Microbiology,Jiangxi Academy of Sciences,330096,Nanchang,PRC;2.Nanchang No.2 Middle School,330031,Nanchang,PRC)Abstract:In order to develop a new type of kiwifruit preservative,the pathogenic fungi isolated from rotten kiwifruit were used as marker microbes,and the inhibitory effect of three preservatives inclu-ding phenyllactic acid,phenylethanol and lactic acid oligomer on the marker microbes were investi-gated,and the optimal preservative ratio was determined.The results showed that seven pathogenic fungi were isolated from rotten kiwifruit and identified as three pathogens by sequencing,namely Fusarium oxysporum,Aspergillus aculeatus and Penicillium citrinum.The antifungal experiment showed that the minimum inhibitory concentration of phenyllactic acid was 3.0 g/L,and the mini-mum inhibitory concentration of phenylethanol was 2.0 g/L.The antifungal property of lactic acid oligomer was not obvious.The minimum concentration ratio of the antifungal agent was 2.5 g/L phe-nyllactic acid and 1.5 g/L phenylethyl alcohol,which was determined to be the final use concentra-tion of the preservative.Key words:kiwifruit;pathogenic bacteria;preservatives;phenyllactic acid;phenylethanol;lactic acid oligomer0 引言猕猴桃(Actinidia chinensis)又名阳桃,为猕猴桃科猕猴桃属木质藤本,素有“水果之王”之称1-2。据统计,我国猕猴桃种植面积占全世界总面积的 71.40%,产量占全世界猕猴桃产量的44.50%,均居全球第一3。猕猴桃果实皮薄汁多,作为一种典型的浆果,在采后贮藏过程中,果肉容易发生软化和腐烂变质现象4-5。我国每年猕猴桃因腐烂、霉烂等原因,损失率高达 25%35%,给果农造成了巨大的经济损失6。可见,加强猕猴桃果实采后贮藏保鲜技术的研究,有利于实现猕猴桃经济效益的更大化,对猕猴桃产业的可持续性发展具有促进作用。为延长猕猴桃的贮藏时期,增强其耐贮性,可以从抑制或延缓猕猴桃果实的呼吸强度、削弱或延缓果实的乙烯生成、抑制或杀灭果实中病原微生物的生成等方面考虑7-8。当前,主流是采用低温冷藏9、气调贮藏10等物理方法和 1-甲基环丙烯11、二氧化氯12、草酸13等化学方法及壳聚糖14等生物方法相结合的保鲜技术,对猕猴桃果实采后贮藏保鲜。随着人民生活水平的不断提高,食品安全意识也在显著加强,相较于具有一定毒性的化学保鲜剂,苯乳酸、苯乙醇等天然、无毒性的保鲜剂逐渐成为热点话题15-16。本研究从腐烂猕猴桃中筛选出主要的致腐菌,并使用尚未在猕猴桃保鲜中报道过的生物保鲜剂(苯乳酸、苯乙醇和低聚乳酸)抑制致病菌,探究最佳的保鲜剂组成成分配比,为猕猴桃贮藏保鲜提供了新的方向。1 实验1.1 材料红阳和金魁猕猴桃来自于奉新县猕猴桃基地当年采摘的鲜果。苯乳酸及苯乙醇由本实验室自备。PDA 培养基,购置于上海生工生物。1.2 致病菌的分离和纯化将自然发病果实按不同病症分组,采用组织分离法。采集奉新县猕猴桃基地当年库存的病果,使用酒精将果实健康部位和外表皮消毒后,用无菌针从果实病健接合部位挑开,取病变组织接入 PDA 培养基中,26 培养 3 d,等菌落长到约2 cm 时,用接种针挑取菌丝,接入新的 PDA 培养基中,反复 35 次,纯化后,置-4 冰箱中保存备用。1.3 病原菌致病力测定将纯化后的病菌按照柯赫氏法则进行回接验证。将适龄 PDA 平板病菌用打孔器打成直径5 mm 的菌饼,将菌饼的菌丝面紧贴在表面消毒过的果面上,分刺伤和不刺伤 2 种方式进行接种,并以接种同样大小的无菌 PDA 培养基块作为对照。接种后在菌饼和无菌培养基块背面放一块用无菌水湿润的灭菌脱脂棉保湿,26 黑暗条件保湿培养 24 h 后去掉,并开始观察发病情况。以后每隔1 d 调查记载刺伤接种病斑扩展情况;同时,接种果实发病后,从发病部位重新分离病原菌,与最初分离且接种发病的菌株作对比,确认分离物的一致性。1.4 致病菌的分子生物学鉴定将保存菌株送至上海生工生物进行基因测序,结果在 NCBI 基因库里进行比对,下载相似度较高的序列以及用于构建发育树所用的参考序列,用 Clustal X(1.7)软件剪齐序列,然后用 ME-GAS 软件以 1 000 次重复计算构建系统发育树。1.5 保鲜剂各组分对指示菌的抑制作用研究将指示菌孢子液涂布于含有不同浓度保鲜剂组分的 PDA 培养基平板上,以不添加的作为对照,定期(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d)观察有无菌生长,若有菌落生长,表明无抑制作用,若无菌落生长,表明存在抑制作用。培养 2 d 后没有菌生长的最低抑菌浓度即是最低抑菌浓度(MIC)。1.6 保鲜剂最佳复配比例的确定将苯乳酸和苯乙醇按照不同比例进行复配,分别加入到灭菌后的 PDA 培养基中,倒入平板凝固后,用打孔器取出培养了 4 d 的指示菌菌饼置于固体培养基上,以不添加的作为对照,定期(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d)观察有无菌生长。若有菌落生长,表明无抑制作用,若无菌落生长,表明存在抑制作用。培养 2 d 后没有菌生长的最低抑菌浓度即是最低抑菌浓度(MIC),再将所有完全没有菌生长的菌饼接至空白 PDA 培养上,培养 4 d仍未 长 菌 的 保 鲜 剂 浓 度 则 为 最 低 杀 菌 浓 度(MBC)。2 结果与讨论2.1 致病菌的分离和纯化当年贮藏的腐烂果实情况如图 1 所示。用消毒器具由病健结合部取下小块病变组织,接种至376第 4 期 章帅文等:猕猴桃致腐菌的筛选鉴定及保鲜剂对其抑制效果研究PDA 平板中(如图 2),置于 26 培养箱中培养3 d,通过多次纯化后,得到 24 株真菌,取分生孢子接至试管斜面后保存备用。图 1 当年采后贮藏的猕猴桃腐烂果实图 2 病变组织接种至 PDA 平板培养2.2 病原菌致病力测定通过有伤接种的方法,将以上分离得到的菌块接种到健康的猕猴桃果实种,过程如图 3 所示。放于 26 环境中保湿培养 5 7 d 后,对发病果实再分离,完成柯赫法则致病性检测,结果见表1。发现分离后的 24 株菌株中,对健康猕猴桃果实具有致病力的菌株有 7 株,对这 7 株菌株进行纯化保存。图 3 病原菌致病力测定过程情况2.3 致病菌的分子生物学鉴定测序结果在 NCBI 基因库比对后,经 MEGAS软件进行系统发育树的构建,结果见图4。其中1#、5#、7#号菌株为腐皮镰刀菌(Fusarium solani);6#号菌株为桔青霉菌(Penicillium citrinum);2#、3#和 4#号 菌 株 为 棘 孢 曲 霉(Aspergillus aculeatus)。2.4 保鲜剂各组分对指示菌的抑制作用各组分对指示菌生长抑制情况如图 5。苯乳酸对 3 种致腐菌的抑制情况见表 2。可以看出,表 1 柯赫法则致病性检测结果菌株号第 1 天第 2 天第 3 天第 4 天第 5 天1-+2-+3-+4-+5-+6-+-7-+8-[phone]-17-18-19-20-21-22-23-24-注:-表示无生长,-表示几乎无生长,+表示生长较弱,+表示生长较好,下同。Penicillium janthinellum KM268705.1Penicillium janthinellum MZ310442.1Penicillium oxalicum OP358456.1Penicillium pinetorum MH865747.1Penicillium corylophilum KC692220.1Penicillium mallochii MN944416.1Aspergillus fumigatus KU296266.16#Penicillium citrinum MT186193.1Penicillium citrinum MT597829.1Aspergillus flavus MK788223.1Aspergillus flavipes MH865970.12#3#4#Aspergillus aculeatus MN856346.1T#5#1#Fusarium solani MN922526.19196456821643067100591001000.02图 4 基于 16S rDNA 序列的系统发育树当苯乳酸浓度为 1.0 g/L 时,所有指示菌基本都能正常生长;当苯乳酸浓度为 2.0 g/L 时,腐皮镰刀菌和桔青霉菌在第 1 天、第 2 天都无生长;当苯乳酸浓度在3.0 g/L 以上时,所有菌在2 d 内都无生长。因此,初步认为苯乳酸的最低抑菌浓度476江 西 科 学2023 年第 41 卷(MIC)为 3.0 g/L。苯乙醇对 3 种致腐菌的抑制情况见表 3,可以看出,当苯乙醇浓度为 1.0 g/L时,棘孢曲霉和桔青霉菌在第 1 天、第 2 天都无生长;当苯乙醇浓度在 2.0 g/L 以上时,所有菌在 2 d内都无生长。因此,初步认为苯乙醇的最低抑菌浓度(MIC)为 2.0 g/L。低聚乳酸作为一种在猕猴桃表面形成防水膜的物质,抑菌性能较差(见表 4)。图 5 不同组分对腐皮镰刀菌和棘孢曲霉指示菌抑菌情况(d3)表 2 苯乳酸对 3 株致腐菌的抑制情况苯乳酸浓度/gL-1指示菌第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天第 5 天1.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum+2.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+3.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+4.0Fusarium solan-Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+表 3 苯乙醇对 3 株致腐菌的抑制情况苯乳酸浓度/gL-1指示菌第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天第 5 天1.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+2.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+3.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+4.0Fusarium solan-Aspergillus aculeatus-Penicillium citrinum-表 4 低聚乳酸对 3 株致腐菌的抑制情况苯乳酸浓度/gL-1指示菌第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天第 5 天1.0Fusarium solan+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum+2.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum+3.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum-+4.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+2.5 保鲜剂最佳复配比例的确定根据各组分对指示菌的抑菌结果,主要考虑苯乳酸和苯乙醇的复配比例,低聚乳酸作为猕猴桃表面成膜防水的物质,以 2.0 g/L 为基本浓度,添加到配置的保鲜剂中。不同比例组分复配后的保鲜剂对各指示菌的抑菌情况如表 5 所示。可以看出,当苯乳酸浓度大于 2.5 g/L 或苯乙醇浓度大于 1.5 g/L 时,所有指示菌饼在 2 d 内 PDA 平板中都无生长,且当复配比例为苯乳酸 2.5 g/L、苯乙醇 1.0 g/L 时,所有指示菌饼在 2 d 内 PDA平板中都无生长。因此,认为该复配比例为保鲜剂对致腐菌的最低抑菌(MIC)复配浓度比例。当复配比例为苯乳酸 2.5 g/L、苯乙醇 1.5 g/L 时,所有指示菌在 5 d 内都无生长,经将此菌饼接至空白 PDA 培养上培养 4 d 后仍未有菌丝生长情况。因此,可以认为此复配比例为保鲜剂对致腐菌的最低杀菌(MBC)复配浓度比例,并作为配制保鲜剂最终的复配比例。3 讨论与结论从当年采摘的猕猴桃烂果中,挑选了 5 种类型的病果,分离纯化得到 24 株真菌。通过有伤接种的方法,完成柯赫法则致病性检测后,筛选到 3株致腐菌:腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、棘孢曲 霉(Aspergillus aculeatus)及 桔 青 霉 菌(Penicillium citrinum)。以此 3 株致腐菌为指示菌,考察了保鲜剂 3种组分的抑菌情况,初步确定了苯乳酸的最低抑菌浓度(MIC)为 3.0 g/L,苯乙醇的最低抑菌浓度(MIC)为 2.0 g/L;低聚乳酸作为一种在猕猴桃表576第 4 期 章帅文等:猕猴桃致腐菌的筛选鉴定及保鲜剂对其抑制效果研究表 5 不同复配比例保鲜剂对 3 株致腐菌的抑制情况苯乳酸浓度/gL-1苯乙醇/gL-1指示菌第 1 天第 2 天第 3 天第 4 天第 5 天2.01.0Fusarium solan+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum+2.01.5Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum+2.02.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum-+2.51.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+2.51.5Fusarium solan-Aspergillus aculeatus-Penicillium citrinum-2.52.0Fusarium solan-Aspergillus aculeatus-Penicillium citrinum-3.01.0Fusarium solan-+Aspergillus aculeatus-+Penicillium citrinum-+3.01.5Fusarium solan-Aspergillus aculeatus-Penicillium citrinum-3.02.0Fusarium solan-Aspergillus aculeatus-Penicillium citrinum-00Fusarium solan+Aspergillus aculeatus+Penicillium citrinum+面形成防水膜的物质,抑菌性能较差。最后,通过考察各组分不同浓度配比对指示菌的抑菌情况,确定了保鲜剂的最低抑菌浓度(MIC)配比为苯乳酸 2.5 g/L 和苯乙醇 1.0 g/L,最低杀菌浓度(MBC)配比为苯乳酸 2.5 g/L 和苯乙醇 1.5 g/L,并以此最低杀菌浓度配比作为保鲜剂配制的最终复配比例。参考文献:1 苏文文,任春光,潘丽珊,等.红阳猕猴桃褐斑病病原菌鉴定与室内药剂筛选J.中国南方果树,2022,51(4):119-124.2RICHARDSON D P,ANSELL J,DRUMMOND L N.The nutritional and health attributes of kiwifruit:a re-view J.European Journal of Nutrition,2018,57(8):2659-2676.3石浩,卜范文,丁仁惠,等.猕猴桃果实防腐保鲜技术研究进展J.保鲜与加工,2022,22(4):108-115.4白俊青,李锐,罗安伟,等.猕猴桃贮藏保鲜技术研究进展J.食品研究与开发,2018,39(17):219-224.5毕金峰,陈芹芹,刘璇,等.国内外果蔬粉加工技术与产业现状及展望J.中国食品学报,2013,13(3):8-14.6魏玲.柠檬醛对猕猴桃采后软腐病的防治机理及保鲜效果研究D.南昌:江西农业大学,2021.7JHALEGAR M J,SHARMA R R,PAL R K,et al.Effect of postharvest treatments with polyamines on 676江 西 科 学2023 年第 41 卷physiological and biochemical attributes of kiwifruit(Actinidia deliciosa)cv.Allison J.Fruits,2011,67(1):13-22.8HE J L,WU D T,ZHANG Q,et al.Efficacy and mechanism of cinnamon essential oil on inhibition of Colletotrichum acutatum isolated from“Hongyang”kiwifruit J.Frontiers in Microbiology,2018,9:1288-1231.9ZOLFAGHARI M,SAHARI M A,BARZEGAR M,et al.Physicochemical and enzymatic properties of five kiwifruit cultivars during cold storage J.Food&Bioprocess Technology,2010,3(2):239-246.10 LI H,ZHU Y,LUO F,et al.Use of controlled atmos-pheres to maintain postharvest quality and improve storage stability of a novel red-fleshed kiwifruit J.Journal of Food Processing&Preservation,2015,39(6):907-914.11 DENG L,JIANG C Z,MU W L,et al.Influence of 1-MCP treatments on eating quality and consumer pref-erences of“Qinmei”kiwifruit during shelf life J.Journal of Food Science and Technology,2015,52(1):335-342.12 龙明秀,谭书明.固载二氧化氯猕猴桃保鲜剂的研制与应用J.贵州农业科学,2013,41(4):130-133.13 梁春强,吕茳,靳蜜静,等.草酸处理对采后猕猴桃冷害、抗氧化能力及能荷的影响J.园艺学报,2017,44(2):279-287.14 ZHENG F L,ZHENG W W,LI L M,et al.Chitosan controls postharvest decay and elicits defense response in kiwifruit J.Food and Bioprocess Technology,2017,10(11):1937-1945.15 李波,郑凯茜,皇甫露露,等.苯乳酸在食品保鲜中的应用研究进展J.包装工程,2022,43(15):129-136.16 卞一凡,刘姝晗,张贝萌,等.微生物合成 2-苯乙醇研究进展J.中国生物工程杂志,2022,42(8):128-136.(上接第 633 页)利用辅助变量信息,改进估计形式可以提高比插补的精度。构造 2 种比插补估计模型,计算估计量的一阶近似均方误差,通过理论比较与数值模拟,验证了估计量的有效性。参考文献:1LEE H,RANCOURT E,SARNDAL C E.Experi-ments with variance estimation from survey data with imputed values J.Journal of Official Statistics,1994,10(3):231-243.2SINGH S,HORN S.Compromised imputation in sur-vey samplingJ.Metrika,2000,51,266-276.3TOUTENBURG H,SRIVASTAVA V K.Amputation versus imputation of missing values through ratio meth-od in sample surveysJ.Statistical Papers,2008,49:237-247.4SINGH S.A new method of imputation in survey sam-plingJ.Statistics,2009,43(5):499-511.5田兵,常秋胜,闫在在.新的比型插补与比插补效率的比较J.统计与决策,2019,35(13):37-39.6完颜华.随机化调整中缺失数据统计分析D.呼和浩特:内蒙古工业大学,2007.7金勇进,邵军.缺失数据的统计处理M.北京:中国统计出版社,2009.8YAN Z Z,WANG J Y,LAI J F,et al.Ratio imputation method for handling item-nonresponse in Eichhorn modelJ.Model Assist Stat App,2008,3(2):89-98.9EICHHORN B H,HAYRE L S.Scrambled randomized response methods for obtaining sensitive quantitative dataJ.Journal of Statistical Planning and Inference,1983,7(4):307-316.10SINGH G N,PRIYANKA K,KIM J M,et al.Estima-tion of population mean using imputation techniques in sample surveysJ.Journal of the Korean Statistical Society,2010,39(1):67-74.11冯士雍,施锡铨.抽样调查理论、方法与实践M.上海:上海科学技术出版社,1996.776第 4 期 章帅文等:猕猴桃致腐菌的筛选鉴定及保鲜剂对其抑制效果研究