Wters液相色谱实用技术——色谱柱的使用及保养_64页.pdf

液相色谱实用技术色谱柱的使用及保养良好的色谱实验习惯?拿到一根新色谱柱时，先测柱效?保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件?定期检测柱效?定期检测仪器的谱带展宽色谱柱的使用及操作?流动相的转换?特别是GPC柱?流速(压力)的变化幅度?温度的变化幅度?专用色谱柱样品及溶剂的要求记住拿到一根从未用过的色谱柱时 一定要先看其使用说明！色谱柱的保养（一）?样品方面?除去微粒及杂质?了解样品在流动相中的溶解度?如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出?了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养（二）?流动相方面?除去微粒?纯度的要求?超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低?缓冲液的pH值，在填料的允许范围内?缓冲液（盐）的浓度?溶剂：色谱纯，并与填料相匹配?溶剂中的杂质含量?流动相对样品的溶解度?有机溶剂或水的比例在线的保护装置?给色谱柱提供物理的保护?除去样品及流动相中的颗粒?给色谱柱提供化学的保护?防止分析柱被化学污染?装置?在线过滤器?自装填料保护柱?预装保护柱在线过滤器?In-Line Filter，部件号 WAT084560?防止颗粒在色谱柱头累积?优点：基本不影响柱效?在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）?可更换的消耗品?更换滤芯，部件号 WAT005139(5/pkgs)?更换垫圈，部件号 WAT084567(10/pkgs)保护柱?可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时?保护柱的种类?普通自装填料的保护柱?Waters的部件号，WAT084550，用户自装填料?影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大?Guard-Pak预装保护柱?Waters的部件号，WAT088141?有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低可换芯式保护柱新型的保护柱 Sentry Guard?适应的用户类型?非常脏,非常复杂的样品本底?生化样品,溶液?环境样品?食品?不想作太多的固相萃取?不想降低柱效新型的保护柱 Sentry GuardSentry Guard 的特点?特点?高质量,高效填料-不损失柱效?增加分析柱效-增加适应范围?20mm柱长-脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命?手可拧紧接头，安装时不需要工具?通用柱套-适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径)?整体式（对Waters柱）-使用方便，容易?各种不同填料配合Waters柱Sentry Guard 的规格?产品描述?3.920mm柱长?适应任何色谱柱，不需工具即可安装及更换?可换柱芯式设计，提供各种填料:?BondaPak:C18,phenyl,CN,NH2,Silica?Nova-Pak:C18,C8,phenyl,CN,Silica?Resolve:C18,C8,Silica?Delta-Pak:C18,C4?Symmetry:C18,C8色谱柱的清洗?对所做的样品要有充分的了解?用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗?硅胶柱的一般方法?先用甲醇洗去极性杂质?用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化?键合相柱(烷基)的一般方法?20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗记住每种色谱柱可能有特定的方法 一定要先看其使用说明！色谱柱的存放?存放前的处理?除去杂质、盐?合适的存放溶剂?避免色谱柱床的干枯?避免机械震动?防止细菌生长?注意存放的温度色谱柱常见毛病?柱压过高?多少才算高?不同色谱柱有差异?不同系统有差异?不同溶剂有差异?柱效低?重复性差?不出峰，回收率低柱压过高?为什么柱压会过高?微粒堵塞?样品?流动相?密封垫?柱床膨胀?不可逆吸附?细菌生长柱效低?为什么柱效低?色谱柱被污染?过滤片部分堵塞?样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞?色谱柱内的死体积?流动相pH值及组成不合适造成固定相流失?流速急剧变化造成固定相物理损坏?机械震动造成固定相产生裂缝?柱床收缩或干枯重复性差、回收率低?实验的重复性差?色谱柱被污染?流动相pH值及组成不合适造成键合相流失?样品溶剂不同或样品本身不稳定?回收率低，不出峰?“不可逆”吸附?固定相过强或流动相过弱?非特异性吸附色谱柱以外的因素（一）?“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！?仪器问题：连接不好造成死体积?进样器?检测器?管路，连接口?保护柱?在线过滤器堵塞?流动相问题：色谱柱未平衡好?进样量太大色谱柱与仪器的联接?除HP外，不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：?色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏?解决办法：?自制相应的转换接头?使用“通用”型接头（锥箍及螺母）?这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。Waters色谱柱的联接?Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为：“stop-depth”?Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸?Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公司其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其 stop-depth 为0.090英寸不同的Stop-Depth长度色谱柱以外的因素（二）?柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！?系统反压问题?阻尼器堵塞?进样器堵塞?管路或连接口堵塞?在线过滤器不干净?保护柱?压力传感器不准确?流速是否错误?色谱柱以外的因素（三）?实验的重复性差?梯度实验时平衡时间不足?温度波动?流动相组成改变?样品溶剂不同?样品稳定性不好?方法的开发不好?缓冲液的pH值不合适?缓冲液的缓冲能力不足简单的判别方法?高的柱反压是否伴随着?保留时间变化?峰形变坏?分辨率变坏?测量色谱系统的谱带展宽?典型的分析系统应远小于 100 微升?如大于此数应检查仪器系统测量色谱系统的谱带展宽?卸下色谱柱，用UNION代替之?按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约25微升?用5 sigma方法测4.4%峰高处的峰宽：W?仪器参数?流速1.0 ml/min?纸速20 cm/min(用记录仪时，接检测器10mV档)?检测器灵敏度0.5-1.0AUFS(用记录仪时)?检测器时间常数小于0.2?谱带展宽（ml）=1000W（cm）/20（记录仪）=1000W（min）（工作站）判断故障与故障排除的原则?规则一确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实存在。?规则二一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联。?规则三恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题之所在，完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则，换下的组件将来很难再利用，会造成浪费。?规则四尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故障排除经验来改善您目前的预防保养工作，使现有问题再发率降至最低。?规则五养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行故障排除的关键。流动相及样品的预处理液相色谱实用技术（二）液相色谱对流动相的要求?除色谱柱对流动相对的要求外，还有?与检测器匹配?脱气?避免卤素离子（不锈钢系统）?溶剂的粘度?细菌的生长流动相的脱气?流动相脱气的目的?使色谱泵的输液准确?输液均匀准确，并且脉动减小?保留时间及色谱峰面积的重现性提高?提高检测的性能?防止气泡引起的尖峰?基线稳定，信噪比增加?溶剂的紫外吸收本底降低?保护色谱柱?减少死体积?防止填料的氧化流动相脱气的方法?加热?简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化?抽真空?同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果?超声波?简单，但效果不理想。?通惰性气体（一般用氦气）?可保持连续脱气，多用于低压梯度?脱气机?可保持连续脱气，多用于低压梯度样品的预处理?样品预处理的目的?除去微粒?减少干扰杂质?浓缩微量的组份?提高检测的灵敏度及选择性?改善分离的效果?有利于色谱柱及仪器的保护样品的预处理重要性?占样品分析时间的比例?样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间?占分析的消耗总成本最大?消耗大量的溶剂及其他化学品?实验的重复性及准确性最差的环节?影响实验结果好坏的最重要因素?是决定性的步骤样品预处理常用的方法?高速离心?过滤、超滤?选择性沉淀?衍生反应?液-固萃取/液-液萃取?Sep-Pak样品处理小柱?其他样品预处理的过程第一步第二步 按样品的物理 性质差异，从基质 中分离出要分析的 组份去除微粒?过滤?过滤膜/过滤装置?有机(0.5m)/无机(0.45m)?膜片可更换?一次性使用的膜“Cartridge”?使用方便简单，交叉污染小?有更小内径，可用于微量样品的处理?高速离心?大于：10,000g超滤?机理?超滤是一种基于分子量分离的技术?目的?根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份?除去小分子样品中的大分子蛋白?脱盐选择性沉淀?常用于生化样品中除蛋白?有机溶剂?乙腈，甲醇?强酸?三氯乙酸，过氯酸?盐?50%硫酸铵?10%TCA样品衍生?提高检测的灵敏度?增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度?增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器?改变分离的选择性?改变组份的基团，如：?变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离?典型的例子?氨基酸分析样品衍生氨基酸分析P I C O-T A G 方法NCSNH2CHCOO-RNH CSNH CH COO-R氨基酸异硫氢酸苯酯AccQ-Tag 衍生法NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN+A Q C 衍生试剂及氨基酸衍生后的氨基酸CO26-氨基鄝啉N-羟基琥珀酰亚胺N-羟基琥珀酰亚胺半衰期1 秒半衰期约1 5 秒浓缩样品?浓缩样品的方法?萃取/吹干?沉淀/再溶解?色谱法?液固抽提/Sep-Pak小柱?Oasis小柱?Sep-Pak小柱固相萃取（SPE）技术?固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份?固相萃取技术（SPE）的重要性?实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上?加速样品的制备时间?降低样品前处理的成本?提高分析的准确性及回收率?更容易自动化?减少样品处理步骤?降低对不稳定样品的影响?提高安全性新一代固相提取小柱 OasisHLB亲水-亲脂平衡共聚物“亲水”?使填料具有水可浸润性质?降低与水的接触角“亲脂”?提供对被分析物质的反相保留能力NO亲水性单体N-乙烯基吡咯烷酮亲脂性单体二乙烯基苯特征一，水湿性?优势?即使小柱在固相提取过程中干枯，也能吸附被分析物质?益处1 即使小柱在固相提取过程中干枯，也能获得高回收率(85%)2 提取板及小柱可获得一致的回收率(RSD s5%)3 容易使用Oasis HLB 固相提取小柱C18与Oasis HLB 吸附剂浸润能力的比较H L HLHLHLHLHLLLLLLLLL LLLLHLBH=亲水单元L=亲脂单元C18特征二，通用型吸附剂?优势:?在很宽极性范围内保留酸性、碱性及中性化合物?样品不会穿透小柱?益处:?对极性化合物可获得较高回收率?使用同一方法，提取药物及其极性代谢产物可获得高而重现性好的回收率?一种吸附剂适用于大多数SPE提取过程Oasis HLB固相提取小柱结果:通用型吸附剂020406080100AcidsNeutralsBases%回收率Ibuprofen(2.5?g)Naproxen(2?g)Salicylic Acid(5?g)Sulfadiazine(10?g)Sulfamerazine(10?g)Acetaminophen(0.5?g)Theobromine(0.5?g)Paraxanthine(0.5?g)Theophylline(0.5?g)Caffeine(0.5?g)Procainamide(0.5?g)Ranitidine(0.5?g)Oxycodone(1?g)Propranolol(4?g)Naltrexone(1?g)Salbutamol(2?g)Doxepin(4?g)Spiked Serum on 1 cc 30 mg Oasis HLB Cartridges特征三，非常容易预测的保留行为?优势:?可任意调节处理过程中的pH值?充分利用反相保留特性?益处:?便于优化提取方法Oasis HLB固相提取小柱Oasis HLB：优化的提取方法Oasis HLB 固相提取小柱特征四，重现性Oasis HLB吸附剂填料在Waters ISO 9002-认可的工厂中生产 确保重现性.?优势?每批吸附剂进行严格的质量控制，建立SPE填料重现性的新标准?益处:?每盒产品附带合格证书?不同批次具有重现的回收率Oasis 不同批次间重现性Batch ABatch BBatch C0.96%1.21%2.02%3.66%2.40%3.06%3.67%RSD020406080100%RecoveryProcainamideRanitidineAcetaminophenPropranololDP-phthalateDoxepin-Methasone Valerate新型Oasis HLB MCX 吸附剂?填料组成MCX-Mixed-mode Cation eXchanger?Oasis HLB 填料上键合阳离子交换基团(HSO3)?Oasis MCX的保留机理:?HLB 提供反相保留能力?磺酸基提供阳离子交换能力?Oasis MCX的优势?方法简单-无需活化与平衡?对碱性化合物具有高选择性?适于分别提取不同性质的化合物Oasis HLB-应用?各种药物提取，尤其是生理体液中的药物，如血浆、尿液中的药物等?天然产物提取?农业化学应用，如提取除草剂、杀虫剂等?环境化学应用，如提取多环芳烃等Waters的Sep-Pak小柱?Waters专门开发了固相萃取技术（SPE）?Sep-Pak小柱的应用领域?除去杂质及干扰组份?把样品分成不同极性的组分析?富集微量的组份?Sep-Pak小柱的主要种类?反相?正相?离子交换Sep-Pak的种类?根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开?让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用?让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上?让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱反 相正 相离子交换固定相非极性极性带电荷溶 剂从极性到非极性从非极性到极性p H 或离子强度(低到高)各种Sep-Pek小柱（一）?正相?包括Silica/Florisil/NH2/Diol/CN/Alumina?可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液）平衡?加入样品?用非极性溶剂洗脱不想要的组份?用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份?用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份?在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如NH2/CN?确认回收率各种Sep-Pek小柱（二）?反相?包括C18/tC18/C8/tC2/Diol/NH2/CN?可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍?柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了?样品溶解在强一些极性的溶剂中?加入样品?用强极性溶剂洗脱不想要的组份?用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份?用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份?确认回收率各种Sep-Pek小柱(三)?离子交换?包括Accell Plus CM/Accell Plus QMA/NH2?可先用6到10倍柱体积的去离子水或弱缓冲液平衡，?样品溶解在去离子水或弱缓冲液中?加入样品?用弱缓冲液洗脱不想要的组份?用强一些缓冲液（改变pH或离子强度）洗脱第一组感兴趣的组份?用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份?确认回收率Sep-Pak小柱的方法开发?SPE方法开发的几个关键因素?文献查阅?Waters有专门Sep-Pak应用资料的数据库（P/N=88286）?查阅Waters的网页（）?流速控制?同色谱理论：以10ml/min润湿小柱，15ml/min加载样品?离子交换填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加载样品?以15ml/min流速洗脱样品?注意样品本底的不同?注意载荷量及加样方式用Sep-Pak C18除去杂质?使极性的杂质先流出?中等极性样品流出，保留并分析?小柱及其非极性杂质丢弃?举例：多肽混合物脱盐?小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。?把样品载入小柱?盐等极性物先流出。?用更强(极性更弱)的流动相洗出极性较弱的多肽多肽杂质的去除洗脱次序活化脱盐多肽用Sep-Pak C18分组分析?样品是一种叫作“Kool-Aid”葡萄饮料的混合物?步骤?小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。?把样品载入小柱?糖、有机酸等极性物质先流出。?用乙醇/水混合物洗出中等极性的红色染料?蓝色染料仍留在柱子内?最后用100%乙醇洗出极性最弱的蓝色染料K o o l-A i d(一种饮料)的分析糖蓝色染料红色染料葡萄K o o l-A i d溶剂A水溶剂B乙醇洗脱次序123用Sep-Pak C18富集?在分析前浓缩产物到ppm或ppb级?步骤?小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。?把大量(几百毫升)样品载入小柱?溶剂流出?被分析的组份仍保留在柱子内?最后用少量(几毫升)非极性溶剂洗出极性较弱的要分析的组份富集/浓缩活化/平衡浓缩样品溶剂流出大量样品样品保留在柱头上强溶剂1.甲醇2.水