辽宁某规模化猪场猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析.pdf

收稿日期:作者简介:王洪奎()男 本科 高级兽医师 研究方向:商品猪饲养管理、疾病防治 :辽宁某规模化猪场猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析王洪奎(阜新蒙古族自治县现代农业发展服务中心 辽宁 阜新)中图分类号:文献标志码:文章编号:()摘 要:研究主要针对辽宁省某规模化猪场发病猪只采集病料样品 分离鉴定致病菌同时利用纸片法进行药敏试验 筛选敏感性药物 结果表明 分离菌株为多杀性巴氏杆菌 药敏试验结果表明菌株对氟苯尼考、卡那霉素等药物高度敏感 可作为猪场该类疾病防控的候选药物关键词:猪 巴氏杆菌 分离鉴定 药敏试验 猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的急性流行性或散发性和继发性传染病 又叫猪肺疫 猪巴氏杆菌病根据临床症状可分为急性型和慢性型 类 急性型多以出血性败血性病变、咽喉肿胀发炎和肺部充血、水肿、炎症等为主要临床表现 慢性病例多发病缓慢 主要表现为呼吸苦难 慢性肺炎 个别可见关节炎症状 且其常与猪瘟等混合感染 严重的可引起猪只死亡 对养猪业危害巨大近日 辽宁某规模化猪场部分猪发病 病猪体温升高 可达 精神沉郁 食欲减少或不食 干咳 部分猪鼻孔流出浆性或脓性分泌物 呼吸困难 张口呼吸 结膜发绀 皮肤表面有大小不一致且形状不规则的红色斑块 少数猪轻微腹泻 部分猪于发病 日内死亡 剖检死亡病猪后 可见咽喉部红肿发炎 黏膜充血、水肿 胸腔与肺脏黏连 胸腔积液 肺充血、水肿 部分坏死 脾脏表面有散在出血点 轻微肿大 综合临床症状、剖检变化及流行病学情况 疑似为巴氏杆菌引起为进一步确诊 现场采集病猪肺脏、淋巴结等组织样品 对致病菌进行分离鉴定 同时进行药物敏感性试验 以期对临床上该类疾病的防治提供理论依据 材料与方法 实验材料 主要试剂 普通营养肉汤琼脂培养基 培养基 革兰氏染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司 (含 )购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司 细菌基因组 提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司 甲醇、无水乙醇、三氯甲烷等试剂为国产分析纯 主要仪器电热恒温培养箱 购自于北京六一仪器有限公司 凝胶成像系统购自于江苏捷达科技有限公司 电泳仪 、电 泳 槽、仪 购自于美国伯乐有限公司 无菌工作台 购自于青岛海尔公司 病料及实验动物猪场发病死亡猪 头 剖检后无菌采集肺脏组织样品 养猪 ()保存待检 级昆明小鼠 只 雌雄各半购自于沈阳长生实验动物有限公司 实验方法 细菌分离培养将病料组织样品涂布于营养琼脂培养基和血平板培养基上 放入培养箱培养观察 用接种环取单菌落 进一步划线培养纯化 同时挑取单个菌落在 培养基中进行振荡培养 纯化培养后菌株进行革兰染色镜检 观察菌体染色特性及形态 生化鉴定 参考生化试验试剂说明书将分离菌培养物接种于各生化 反 应 管 中 培养 观察并记录结果 细菌 基因序列分析使用 通用引物进行普通 扩增 上下游引物分别为 和 引物由生工生物公司进行引物合成 扩增条件:预变性 变性 退火温度 退火时间 延伸 共 个循环 最后 延伸 保存然后取 产物进行琼脂糖凝胶电泳凝胶成像仪观察结果 同时将 产物送往上海生工生物公司进行测序 测序结果与 中已发表的基因序列进行同源性比对 致病性试验无菌条件下挑取普通琼脂培养基上培养的单个菌落接种于 液体培养基中 、/培养 取 只健康的 级小鼠 随机分为试验组和对照组 每 组 只 对 试 验 组 小 鼠 腹 腔 注 射 含有 个细菌的菌液 对照组小鼠注射等体积的 液体培养基 逐日观察小鼠发病死亡情况 并对死亡小鼠及未死亡小鼠分别进行剖检 观察记录小鼠各个组织病变情况 同时取病变脏器进一步分离病原菌 药敏试验采用纸片扩散法进行药敏试验 挑取琼脂平板培养基上的单菌落接种于 液体培养基 、/培养 取 菌液分点滴加在琼脂平板上 应用玻璃棒均匀涂布于培养基上 将常用抗菌药物药敏纸片贴在平板培养基上 培养 观察抑菌圈是否出现并测定其直径 结果 细菌分离培养分离菌在普通琼脂平板上生长出灰白色菌落 表面光滑且较为湿润、边缘整齐 血平皿上生长出灰白色菌落 表面光滑且较为湿润、边缘整齐且没有溶血现象(图)挑取单菌落至于载玻片上 进行革兰氏染色 染色后将载玻片置于油镜下观察 镜下可见本次分离菌株呈淡红色、两端钝圆的短杆状 为革兰阴性菌(图)注:普通琼脂平板:血平板图 分离菌平板培养基菌落形态 第 期 王洪奎.辽宁某规模化猪场猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析图 分离菌革兰氏染色结果()生化鉴定生化试验结果表明 本次分离菌株可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖 产酸不产气 对乳糖、鼠李糖、肌醇不发酵 可生成靛基质 甲基红和 试验阴性 不液化明胶(表)表 分离菌的生化鉴定结果生化试剂结果生化试剂结果葡萄糖肌醇果糖靛基质蔗糖甲基红甘露糖半乳糖明胶乳糖脲酶鼠李糖赖氨酸 注:阳性 :阴性 细菌 基因序列分析菌液 产物琼脂糖电泳结果显示 扩增出预期 的单一条带(图)将目标片段测序后 通过 工具将其结果进行在线比对 结果显示该序列与 中多杀性巴氏杆菌的核苷酸序列相似程度最高 同源性大于 注:产物图 分离菌 结果 动物试验分离菌菌液接种小鼠 后 试验组小鼠开始出现不同程度的临床表现 主要表现为运动迟缓、食欲不振、呼吸急促、体温升高等症状 后全部死亡 对照组小鼠全部正常无菌采集小鼠肺脏 均匀涂布于普通琼脂培养基 培养 镜检及菌液 鉴定表明 试验组小鼠肺脏中分离出的菌株为多杀性巴氏杆菌 药敏试验 由表 可知 本次分离的菌株对氟苯尼考、卡那霉素、氧氟沙星、庆大霉素、诺氟沙星、多西环素敏感 对环丙沙星中介 对头孢氨苄、克拉霉素、丁胺卡那、红霉素、头孢唑林耐药 可推荐养殖场选择使用氟苯尼考等药物进行临床治疗表 分离菌药敏试验结果药物抑菌环直径/耐药性药物抑菌环直径/耐药性氟苯尼考卡那霉素氧氟沙星克拉霉素环丙沙星庆大霉素诺氟沙星丁胺卡那多西环素红霉素头孢氨苄头孢唑林 注:敏感:中介:耐药 讨论多杀性巴氏杆菌是一种可引起多种畜禽疾病的革兰氏阴性致病菌 可导致牛出血性败血症、禽霍乱等 在猪可引起猪肺疫和猪萎缩性养猪 ()鼻炎等 结合本次细菌分离培养、生化实验和 鉴定结果 初步确诊该猪场发病为猪巴氏杆菌病 通过对临床分离菌进行药敏试验 表明氟苯尼考、氧氟沙星等药物对临床分离菌株敏感 推荐养殖场采用上述药物进行防治 后猪群整体发病率得到了控制 发病猪只临床症状也得到了控制 后猪场疾病得到了控制 取得了不错的效果巴氏杆菌拥有荚膜、脂多糖、菌毛和黏附素等多种毒力因子 根据荚膜类型可将其分为荚膜 型、荚膜 型、荚膜 型、荚膜 型和荚膜 型等 种血清型 猪巴氏杆菌肺炎(猪肺疫)主要由荚膜 型引起 临床症状根据病程的不同可分为多种病型 主要表现为呼吸困难、气喘等 病情重时剖检可见胸膜与病肺黏连 胸腔及心包积液 我国是畜牧业大国 生猪存栏量居世界前列 猪巴氏杆菌病在猪群中常年存在 对养猪业危害巨大 李敏研究表明 猪巴氏杆菌病在成都市发病率约为 而李永刚的研究证实猪巴氏杆菌病发病率为 病死率高达 临床上针对该病的防控重点是疫苗免疫 国内部分规模化猪场采用猪肺疫弱毒苗进行免疫 收到了不错的预防效果 近期韦存莉尝试推广应用猪瘟、猪丹毒、猪巴氏杆菌病三联疫苗对猪只进行免疫 起到了很好地预防效果 三联苗不仅有效地降低猪巴氏杆菌病的发病率 同时也对猪瘟、猪丹毒起到了很好地预防作用 同时在猪场实行自繁自养、坚持标准化生产流程 采用免疫为主、综合防控为辅的原则 对上述疾病防控取得了显著效果 年 月 农业农村部第 号公告对原 一、二、三类动物疫病病种名录 进行修订 将巴氏杆菌病由之前的二类疫病修改为三类疫病 但这并不代表巴氏杆菌病对畜禽养殖业的危害在逐年减小 反而应该更加引起畜牧兽医工作者对该类疾病防控的重视 近年来随着分子生物学、细胞生物学技术的不断发展 巴氏杆菌病的临床诊断技术也在不断发展 多种敏感性高、特异性强的诊断技术不断涌现 可以实现快速、精准的诊断 从而提升了对该类疾病的防控水平 李伟杰等也在 年修订了猪巴氏杆菌病诊断技术 行业标准 该标准的修订也将为猪巴氏杆菌病诊断技术的提升起到积极的促进作用参考文献:王生梅.猪巴氏杆菌病病原的分离与鉴定.养殖与饲料.():.王新宇.猪巴氏杆菌病的流行病学、症状、鉴别诊断与防控.现代畜牧科技.():.李敏 周潇潇 黄云川 等.年成都市病死猪巴氏杆菌病感染情况分析.():.李永刚.宁夏隆德县规模猪场猪巴氏杆菌病流行病学调查及防治 .贵州畜牧兽医 ():.韦存莉.猪瘟、猪丹毒、猪巴氏杆菌病三联苗推广与应用.中国畜禽种业 :.李伟杰 张媛 李建 等.猪巴氏杆菌病诊断技术行业标准修订 .中国兽医杂志 ():.(编辑:赛林童)第 期 王洪奎.辽宁某规模化猪场猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析