枯草芽孢杆菌抑菌成分研究进展.pdf

35 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 专题论述枯草芽孢杆菌抑菌成分研究进展姜北辰1,2，贺凯茹1,2，杨姗姗1,2，李欣霏1,3，包雨飞1,3，杨 慧1,2,3,*，武俊瑞1,2,3,*（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室，辽宁 沈阳 110866；3.辽宁省食品发酵技术工程研究中心，辽宁 沈阳 110161）摘 要：枯草芽孢杆菌因其分布广泛和对环境无公害，在农业、工业、医药卫生等行业有着广泛的应用。近年来，国内外对枯草芽孢杆菌进行了探索，其菌体在新型抑菌生物制剂中有所应用，但以其分泌的抑菌成分作为原材料的抑菌制剂目前还处在理论阶段。本文主要从四方面对枯草芽孢杆菌抑菌成分进行综述，分别为抑菌成分的分类、抑菌机制、未来可能的应用和提取方法的优化。同时，为了使枯草芽孢杆菌抑菌成分能广泛应用于食品防腐技术、食品杀菌技术等多个方面，生产大剂量、高纯度的抑菌成分成为亟待解决的问题，这需要进一步提高抑菌成分的纯度与产量的相关研究。最后，为枯草芽孢杆菌抑菌成分的未来探索提供了可行的方向。关键词：枯草芽孢杆菌；抑菌成分；抑菌机制；肽类；挥发性物质Advances in the Study of Bacteriostatic Substances from Bacillus subtilisJIANG Beichen1,2,HE Kairu1,2,YANG Shanshan1,2,LI Xinfei1,3,BAO Yufei1,3,YANG Hui1,2,3,*,WU Junrui1,2,3,*(1.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China;2.Shenyang Key Laboratory of Microbial Fermentation Technology Innovation,Shenyang 110866,China;3.Liaoning Engineering Research Center of Food Fermentation Technology,Shenyang 110161,China)Abstract:Bacillus subtilis has a wide range of applications in the agriculture,industry,medicine and healthcare sectors due to its wide distribution and harmlessness to the environment.In recent years,Bacillus subtilis has been explored worldwide and applied as a new biological bacteriostatic agent,but the application of antibacterial substances secreted by it is still at a theoretical stage.This paper reviews the classification,mechanism of action,possible future applications and extraction optimization of antibacterial substances from Bacillus subtilis.The production of high-dose and high-purity bacteriostatic substances from Bacillus subtilis is an urgent problem to solved before the wide application of them in food preservation and sterilization technologies.This makes it necessary to find ways to improve the purity and yield of bacteriostatic substances.The review concludes with possible directions for future exploration of bacteriostatic substances.Keywords:Bacillus subtilis;bacteriostatic substances;antibacterial mechanism;peptides;volatile substancesDOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20230119-003中图分类号：S476 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2023）02-0035-07引文格式：姜北辰,贺凯茹,杨姗姗,等.枯草芽孢杆菌抑菌成分研究进展J.乳业科学与技术,2023,46(2):35-41.DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20230119-003.http:/JIANG Beichen,HE Kairu,YANG Shanshan,et al.Advances in the study of bacteriostatic substances from Bacillus subtilisJ.Journal of Dairy Science and Technology,2023,46(2):35-41.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20230119-003.http:/收稿日期：2023-01-19基金项目：国家自然科学基金面上项目（32172279）；宁夏自治区重点研发计划农业农村领域项目（2022BBF03021）；沈阳市科技创新平台项目（21-103-0-14；21-104-0-28）第一作者简介：姜北辰（1996）（ORCID:0000-0003-4543-1325），女，硕士研究生，研究方向为益生菌。E-mail:*通信作者简介：杨慧（1986）（ORCID:0000-0003-3419-0108），女，讲师，博士，研究方向为食品发酵。E-mail:武俊瑞（1977）（ORCID:0000-0003-3419-0108），男，教授，博士，研究方向为益生菌。E-mail:专题论述 Journal of Dairy Science and Technology 2023,Vol.46 No.2 36 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）属芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，是一种革兰氏阳性细菌，可以形成芽孢，具有对抗生素无耐药性且对动物无毒性的特点1。枯草芽孢杆菌是一种重要的益生菌，对环境无污染，是我国农业部法定允许使用的、能在饲料添加剂中使用的2 种芽孢杆菌之一2。枯草芽孢杆菌还具有遗传操作较为简单、生理生化特征清晰、培养发酵较为方便等优点，可作为微生物细胞工厂，用于生产维生素、药物前体、工业酶等目标产物3。枯草芽孢杆菌还可在肠道中生长，消耗氧气以维持厌氧环境，用于预防或治疗胃肠道疾病，可用于改善脂质代谢和氧化应激状态，改善肥胖4。在生长代谢过程中，枯草芽孢杆菌可以产生枯草杆菌素、多黏菌素、制霉菌素、葛莱霉素等活性物质，上述代谢产物都可明确限制病原体或内源性条件致病菌的生长5。枯草芽孢杆菌在生长过程中可产生能够抑制菌体活性的成分，通过研究发现它可作为抗生素的理想替代物。由于具有性能稳定、耐贮藏且有效活菌数高等优点，为枯草芽孢杆菌替代抗生素使用奠定了理论基础6。枯草芽孢杆菌在自然环境中普遍分布，其芽孢具有较强耐受能力，在环境不佳时可保持休眠状态，等适宜时再发挥其功能。枯草芽孢杆菌属于纯天然益生菌且对周围环境安全无公害，在国内外农业、工业、医药卫生、水产养殖等行业中已被大规模使用2,7。枯草芽孢杆菌因其对恶劣环境的更高抗性，即使在90 高温环境下放置10 min也能有80%的存活率，因而获得研究人员的青睐4,8。本文对枯草芽孢杆菌抑菌成分的分类、抑菌机制、提取方法和未来可能的应用进行综述，旨在为枯草芽孢杆菌的抑菌成分在未来研究中的应用提供一定的理论参考。1 枯草芽孢杆菌抑菌成分的分类目前常用的保藏手段是使用化学防腐剂、抗生素等来抑制或影响病原菌的生长繁殖活动，但是化学防腐剂有较大的弊端，此外抗生素的滥用也易使病原菌产生耐药性。在农业生产中，过多使用化学农药易造成农药残留，污染环境9。此外，食品极易受到细菌、霉菌等污染而腐败，经研究发现，食品保藏过程中长期使用化学防腐剂会对人体健康造成一定的伤害，导致消化道菌群失调。因此，安全、无公害的新型抑菌物质成为国内外研究的热点。研究表明，微生物在生长代谢过程中能够产生一些物质，且能有效抑制病原菌生长活性10。这些生物抑菌成分具有无毒害、来源广等优点，从而引起广泛关注11。作为常见的益生菌，枯草芽孢杆菌能产生的抑菌物质有肽类物质和非肽类化合物，目前发现的非肽类化合物种类较少，如异构香豆素、多烯类、酚类等；肽类物质按照合成途径可分为核糖体合成和非核糖体合成，在实验室中通常采用平板倒扣法和二分皿法测定抑菌效果12-13。按照合成途径的不同，枯草芽孢杆菌产生的抑菌成分又可分为两大类，一类为核糖体合成的蛋白质类物质等，另一类为非核糖体合成的脂肽类化合物等14。戚家明等15分别通过对全基因组中16S rRNA及gyrA基因序列的系统发育分析及基因组分析确定芽孢杆菌BS-6为枯草芽孢杆菌，并据此确定出其自身分解产生释放出的活性抗菌肽主要有：常见的羊毛硫细菌素Subtilin；稀有的羊毛硫细菌素Subtilosin A等；此外，通过非核糖体途径合成的抗菌物质主要有：表面活性素、抗菌枯草菌素、抗生素合成基因簇和Bacillibactin等。枯草芽孢杆菌所释放的代谢产物可被归类为次级代谢物，按照其物理化学性质也可分类为非挥发性物质和挥发性化合物。枯草芽孢杆菌的非挥发性物质包括脂肽（表面活性素、伊枯草菌素和丰原素类）、多酮肽和非核糖体肽16。枯草芽孢杆菌抑菌成分分类如表1所示。表 1 枯草芽孢杆菌抑菌成分的分类Table 1 Classification of bacteriostatic substances from Bacillus subtilis按分类方式不同划分细分参考文献按结构不同肽类物质脂肽类物质、环脂肽类化合物等12-13,16-18非肽类化合物异构香豆素、多烯类、酚类等12-13,15按物理化学性质不同挥发性物质碳氢化合物、胺类、醇类、烯类、酚类、酯类、吡嗪类、醛类、酮类及其他类等33 种挥发性物质15,19非挥发性化合物脂肽（表面活性素、伊枯草菌素和丰原素类）、多酮肽和非核糖体肽15按合成途径不同核糖体合成蛋白质类物质等12-14非核糖体合成脂肽类化合物、表面活性素、抗菌枯草菌素、抗生素合成基因簇和Bacillibactin等12-151.1 肽类脂肽类物质、环脂肽类化合物等是枯草芽孢杆菌生长繁殖过程中分泌的重要抑菌成分。杨军17对小鼠灌胃枯草芽孢杆菌代谢产物正丁醇部位提取物进行了进一步分离纯化，其中含量最多的主要成分经过鉴定后为抗霉枯草菌素，这是一种环脂肽类化合物，之后的研究中发现该物质可以降低小鼠的体质量和控制附睾脂肪的堆积。陆晓岑等18对19 株能抑制无乳链球菌的菌株进行筛选后获得一株枯草芽孢杆菌，经过进一步研究发现其所分泌的抑菌成分为脂肽类物质，其中含有伊枯菌素、杆菌霉素、表面活性素和芬荠素等。隋晓日19使用LB液态发酵方法获得枯草芽孢杆菌的发酵产物，通过甲醇溶解并离心分离纯化，经过质谱分析初步推断发酵液中的抑菌成分是脂肽类化合物。1.2 挥发性物质研究发现，枯草芽孢杆菌所产生的抑菌成分部分具有挥发性。梁艳琼等20探究枯草芽孢杆菌产生的挥发性物质对病原菌的抑制能力，发现其所产生的挥发性物质37 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 专题论述能明显抑制7 种橡胶树病原真菌的直接侵染性生长，可使部分真菌菌丝产生畸形；对挥发性物质组分进一步分析，共分离鉴定获得包括碳氢化合物、胺类、醇类、烯类、酚类、酯类、吡嗪类、醛类、酮类及其他类等33 种挥发性物质。吉亚泰21研究发现，枯草芽孢杆菌在代谢过程中产生的挥发性气体能够抑制灰霉病菌，通过固相微萃取-气相色谱-质谱分析对枯草芽孢杆菌的产物进行测定，发现能抑制植物病害的挥发性有机化合物有25 种，主要成分为乙偶姻。1.3 蛋白质研究人员发现部分从枯草芽孢杆菌中提取的抑菌成分在高温、过酸、过碱等环境下会失活，因此合理推测枯草芽孢杆菌产生的抑菌成分包括蛋白质类物质22。吴越等22研究发现，枯草芽孢杆菌能抑制罗非鱼无乳链球菌，后期实验发现枯草芽孢杆菌分泌的具有抑菌活性的物质是一种大分子蛋白质，并不是小分子抗菌肽，该研究结果为未来大规模应用与生物安全防治体系提供了可能性。冯艳琴等23为获得能抑制可引起急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌的拮抗菌，从自然海域中分离筛选，经过形态和分子生物学鉴定确定一种拮抗菌为枯草芽孢杆菌，通过硫酸铵沉淀法从该菌的发酵液中获得抑菌活性物质的粗提物，经过蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理后抑菌物质活性消失，确定该物质为蛋白类物质。Hong等24从枯草芽孢杆菌中提取纯化细菌素并对单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽孢杆菌进行抗菌实验，发现该细菌素被蛋白水解酶（如蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶E）处理后活性完全被抑制，表明是一种蛋白质物质。1.4 氨基糖苷类化合物枯草芽孢杆菌产生的抑菌物质的成分中还有较为少见的氨基糖苷类化合物。从海参的体表获得数种细菌后，李文卓等25将枯草芽孢杆菌分离筛选出来并进行培养，为达到抑制致病性灿烂弧菌的目的而获取枯草芽孢杆菌的胞外产物，研究这些代谢产物的抑菌机制，经过正丁醇提取、硅胶G薄层层析、官能团显色反应及红外光谱分析，确定能抑制致病性灿烂弧菌的抑菌成分是一类氨基糖苷类化合物。2 抑菌机制枯草芽孢杆菌产生的抑菌成分能对病原菌造成影响的原因主要是改变了病原菌细胞膜的通透性，造成胞体的原生质泄露、内部离子释放、菌丝畸形以及抑制孢子萌发等，最终达到抑制病原菌生长的目的。2.1 破坏细胞膜结构枯草芽孢杆菌所产生的抑菌成分可改变病原菌细胞膜的通透性，或直接破坏细胞膜造成原生质外泄。王芳等26研究枯草芽孢杆菌抗菌成分粗提物及其对番茄叶霉病菌的抗菌机制时发现，抗菌成分浓度达到 10.6102 g/mL时，其有效抑制孢子萌发的效率高达86.56%，说明该抗菌成分抑制霉病菌是通过破坏细胞膜结构实现的。丁飞鸿等27从中国传统香肠中获取一株可产生抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌，经研究发现该抗菌脂肽可穿孔大肠杆菌的细胞壁，破坏细胞膜的完整性、增大细胞膜的通透性，从而达到杀灭大肠杆菌的目的，该结果可为研发新型天然防腐剂提供理论基础。林志伟等28发现，枯草芽孢杆菌代谢产物可抑制镰孢菌菌丝的生长和孢子的萌发，当代谢产物的体积分数达90%时抑制孢子萌发的效率达99%；同时显微镜观察到孢子畸形等现象且病原菌的细胞膜通透性也发生了改变。付云等29研究从枯草芽孢杆菌的发酵液中分离出的抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌机理，发现抑菌肽能使金黄色葡萄球菌细胞膜通透性增加，使得胞体基质中钾离子的释放量、蛋白质的泄漏量及细胞膜疏水性均提高，当增加抗菌肽的质量浓度后可与溴化乙锭竞争性结合DNA，这使得金黄色葡萄球菌的DNA条带变暗，影响蛋白质的表达。2.2 抑制孢子的萌发或造成菌体畸形抑制孢子的萌发或使病原菌发育畸形也是抑菌物质抑制病原菌生长的重要方法。林福兴30将枯草芽孢杆菌中抑制匍枝根霉的成分分离，其中具有较长脂肪酸链的物质杆菌霉素D可有效抑制匍枝根霉孢子的萌发和菌丝的生长，使菌丝畸形。赵长龙等31研究发现，枯草芽孢杆菌的次生代谢产物可以有效抑制引起菜豆根腐病的腐皮镰孢菌的菌丝生长与孢子的产生和萌发，且枯草芽孢杆菌的菌液不会对种子的萌芽有影响甚至可促进根系发育。李永刚等32对枯草芽孢杆菌的菌液成分和胞外蛋白的抑菌机制进行初步研究，发现菌液成分和胞外蛋白均能较好地抑制灰霉病菌的产孢、萌发和菌丝生长。ZhangDai等33研究枯草芽孢杆菌释放的挥发性抑菌成分6-甲基-2-庚酮对马铃薯茄链格孢菌的拮抗机制，结果表明，该物质对孢子萌发有抑制作用，还可破坏分生孢子的内部结构。2.3 抑制病原菌产生其他物质抑制病原菌产生致病物质也是枯草芽孢杆菌抑制病原菌的方式之一。代玉立34研究发现，枯草芽孢杆菌的菌悬液能有效抑制油菜菌核病菌所产生的草酸，经过枯草芽孢杆菌菌悬液处理后的油菜菌核病菌草酸的增加速率大大降低，接种12 h后油菜菌核病菌产生的草酸为8.41 mg/g，96 h后只增长到9.43 mg/g。Erega等35在研究枯草芽孢杆菌抑制空肠弯曲杆菌生物膜的过程中发现，枯草芽孢杆菌的天然分离物是空肠梭菌的强拮抗剂，可阻止空肠衣原体黏附在非生物表面和生物膜的形成。专题论述 Journal of Dairy Science and Technology 2023,Vol.46 No.2 38 3 抑菌成分的提取方法用微生物来生产抑菌成分有多种优点，如易于培养、能大规模生产、遗传操作容易等。但菌体发酵液的成分复杂多样，且一个菌种能产生多种抑菌成分，所以如何将需要的抑菌成分从发酵液中分离纯化是关键步骤。从微生物发酵液体系中获得活性成分的工艺方法一般有溶媒萃取法、沉淀和结晶法、吸附法及色谱法。多数情况下蛋白质类抑菌成分会采用盐析法和硫酸铵盐析法。也有通过酸沉淀和甲醇萃取相结合的方式来提取抑菌成分的方法。除此之外还有电泳法、凝胶分子筛层析法等36-37。硫酸铵沉淀法是在发酵上清液中加入硫酸铵，固体硫酸铵最佳，静置在4 环境下，经过一夜沉淀后进行离心，弃上清液，将磷酸缓冲液加入沉淀中重悬，再将混合物进行透析，之后用聚乙二醇包埋法进行浓缩，离心后所获得的上清液即为抑菌成分粗提物38。盐酸沉淀法主要是用盐酸将经过离心的发酵液上清液pH值调至2.0，并在4 环境下静置过夜，再将离心后获得的沉淀用甲醇浸提，进行旋转蒸发浓缩，最后获得粗提物39。3.1 硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法多数用于提取蛋白类抑菌成分。孙薇等40通过改变pH值以有效除去枯草芽孢杆菌抑菌物质中的杂蛋白，再分别经过饱和度80%硫酸铵沉淀、Sephadex G-75层析提取后，经过纯度及相对分子质量检测，结果为单一条带，其相对分子质量约为63 500。在高温、强酸和强碱环境下该抑菌成分失活，且该物质对常规的有机溶剂都具有良好的稳定性，最终确定该物质为一种蛋白质，这种天然蛋白被开发加工成的生物制剂也具有显著防止天然木材老化、变色、降解的潜力。邓阳等41用硫酸铵盐析、透析、水浴处理等方法，将大肠杆菌作为指示菌，考察上述方法对枯草芽孢杆菌胞外产抑菌成分活性的影响，结果表明，80%饱和度的硫酸铵可盐析菌株所产生的抑菌成分，其分子质量在8.0 ku以上，因其分子结构中有被蛋白酶水解的肽键，推测该菌产生的抑菌成分应为一种抗菌蛋白类物质。吴越等42用80%的硫酸铵盐溶液将枯草芽孢杆菌发酵上清液中的抑菌成分析出，研究发现，抑菌成分不耐高温且对蛋白酶K敏感，在非中性环境条件下该物质失去抑菌活性，并且该物质能短时间耐受紫外线照射，但时间不能超过180 s，最终确定枯草芽孢杆菌所分泌的抑菌成分为大分子蛋白质。孙向丽等43从牦牛、绵羊等食草动物的粪便和霉变饲料中筛选出一株枯草芽孢杆菌菌株，通过对该菌发酵液经离心后的上清液用硫酸铵沉淀法获得沉淀蛋白，并以此降解黄曲霉毒素，结果发现，经过蛋白质降解后黄曲霉毒素毒性显著降低。3.2 盐酸沉淀法盐酸沉淀法多数用于提取脂肽类抑菌成分。张慧等44 对枯草芽孢杆菌的发酵液经过盐酸沉淀和甲醇抽取获得粗提物，通过稳定性实验结果发现，该提取物在pH 2.011.0时较稳定，且对温度、紫外辐射和有机溶剂的耐受力均较好。通过薄层层析显色分析后初步鉴别，判定该类物质可能为酚类物质。贾媛等39使用盐酸沉淀法和甲醇萃取结合的方式，获得枯草芽孢杆菌的抑菌成分，经过检测推断该提取物中有脂肽类成分。该提取物处理根肿菌孢子2 d可有效抑制50%孢子活性。该提取物同时还被证明对三七根腐病菌、水稻纹枯病菌、禾谷镰刀菌、魔芋基腐菌和烟草赤星菌均表现出很好的抑制效果。牛焕杰等45通过盐酸沉淀法和甲醇浸提从枯草芽孢杆菌发酵液中提取粗提物，经过分离纯化获得抗菌蛋白EP-1，研究发现，这种抗菌蛋白可有效抑制苹果树腐烂病菌的生长并破坏其细胞结构。LinRongrong等46在提取枯草芽孢杆菌的抑菌物质时，用盐酸（HCl）沉淀以浓缩化合物；同时为了消除颜料和核酸的干扰，使用体积分数80%丙酮来提取沉淀。肖小露47研究生物防治辣椒疫霉菌的过程中将具有生物防治作用的枯草芽孢杆菌作为原材料，发现枯草芽孢杆菌的无菌滤液也能抑制辣椒疫霉菌的生长和孢子的萌发，用盐酸沉淀法从菌液中获得粗提物，从中确定了3 类具有抗菌作用的脂肽类物质。蛋白类抑菌成分和脂肽类抑菌成分在提取方法和稳定性等方面的研究进展如表2所示。表 2 蛋白类与脂肽类抑菌成分提取方法和稳定性研究Table 2 Progress in the extraction and stability of bacteriostatic proteins and lipopeptides提取、萃取方法与稳定性研究蛋白类抑菌成分提取萃取试剂与特点脂肽类抑菌成分提取萃取试剂与特点参考文献沉淀溶剂饱和度80%硫酸铵盐酸40,44萃取透析甲醇萃取40,44热稳定性高温环境下失活对温度耐受力均较好38,44酸碱稳定性强酸强碱环境下失去抑菌活性pH 2.011.0时较稳定38,44紫外稳定性能短时间耐受紫外线照射，但时间不能超过180 s 对紫外线耐受力均较好41,44其他对蛋白酶K敏感对有机溶剂耐受力均较好 41,444 抑菌成分的实际应用4.1 枯草芽孢杆菌生物制剂根据作用性质的不同，生物防腐剂大致可分为 2 种，一种是具有杀菌作用的杀菌剂，另一种是具有抑制作用的抑菌剂。用枯草芽孢杆菌来抑制病原菌的研究有很多：LiYonggang等48利用枯草芽孢杆菌对大豆根腐病尖孢镰刀菌的拮抗机制来防治尖孢镰刀病；LingLijun等49研究枯草芽孢杆菌产生的挥发性有机物对黄曲霉的抑制作用，该挥发性有机物中的主要活性成分为2,3-丁二酮；Peng Di等50采用枯草芽孢杆菌NJ-18和杀菌剂联合防治小麦尖锐眼斑；Kim等51研究枯草芽孢杆菌抑制苹果采摘后病原菌的生物防治。孙尹双等52从奶牛瘤胃液中39 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 专题论述分离筛选出具有产多种酶和广谱抑菌能力的枯草芽孢杆菌，该菌株可用于奶牛微生态制剂的生产。此外，目前国内外市场中有大量芽孢杆菌生物制剂投入生产。枯草芽孢杆菌被广泛应用于生产各种常规生物制剂，但以枯草芽孢杆菌代谢产物为原料直接制成的生物制剂少之又少，因此仍需科研人员加强相关研究。4.2 抑菌成分混合其他挥发性物质梁艳琼等53将高浓度的枯草芽孢杆菌产生的挥发性物质和苯甲醛等活性组分混合，研究混合物对蛋白质合成的影响，研究发现，该混合物能抑制橡胶灵芝菌并使其内容物泄露，造成糖类、蛋白质物质减少，影响菌体细胞稳定性，同时可抑制橡胶灵芝菌中和能量代谢有关的酶活性，影响其能量代谢过程。这种挥发混合活性物质的抑菌机理可能是通过破坏细胞膜结构、扰乱代谢活动来实现抑菌作用。4.3 食品应用的探索尽管枯草芽孢杆菌作为生物防腐剂的原材料已有正规、广泛的应用，但将其直接用于食品的防腐仍有风险。芽孢杆菌是乳制品加工中常见的耐热菌，其中包括枯草芽孢杆菌，这些耐热菌的残留会使乳制品在货架期内发生变质54。可见直接使用菌体可能会造成食品的变质，但使用菌体产生的抑菌成分可能就不会造成这种现象。因此将枯草芽孢杆菌代谢过程中产生的抑菌成分用于食品的防腐技术会更加安全有效。高娟娟等55从山西老陈醋的新鲜醋醅中筛选枯草芽孢杆菌并用酸沉淀法获得抑菌蛋白，结果发现，抑菌蛋白能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，最小抑菌质量浓度为1.25 mg/mL，抑菌蛋白对指示菌的生长曲线、细胞形态结构、细胞膜渗透性、细胞膜通透性、细胞膜和细胞壁完整性、细胞中蛋白质的合成都有影响，且浓度越大影响也越大。综上所述，抑菌蛋白通过破坏菌的细胞壁和细胞膜的通透性和完整性，使菌体的内容物外泄，从而影响细胞的生长和代谢，且该物质对胰蛋白酶和胃蛋白酶等有敏感性。该研究结果为对环境无污染、对人体无伤害的天然、绿色生物防腐剂的开发提供了理论参考。隋晓日19研究不同冷藏条件下虾肉的变化，以枯草芽孢杆菌的抗菌成分作为研究对象，发现经过枯草芽孢杆菌所产抗菌成分处理过的虾肉冷藏货架期能有效延长23 d，并且该成分还能抑制腐败细菌的生命活动，还可分解含氮物质，在水产保鲜中发挥一定功效。苏博等56 将枯草芽孢杆菌在内的3 种芽孢杆菌混合发酵获取上清液，之后将上清液以丙酮沉淀法和旋转蒸发浓缩结合获得粗提的抑菌物质抗菌肽，并对其稳定性进行测试，之后在实验中以牛乳、苹果和猪肉为原料测试抗菌肽的抑菌防腐效果，结果表明，枯草芽孢杆菌中提取出的抗菌物质有良好的热稳定性、抑菌活性和防腐效果。该实验的结论可用于开发食品防腐剂和保鲜剂，例如可用于牛乳、水果和肉类的保鲜防腐，但抑菌物质是否对人体有毒害作用仍需进一步验证。目前科研人员对枯草芽孢杆菌抑菌成分在食品保藏应用中的探索进行了广泛的研究，在提取抑菌成分的过程中已经有很多理论依据证明这些抑菌成分可以抑制病原菌的生长，但如何将理论应用于工业生产、延长食品货架期、牲畜病害防治等领域仍需要继续探索。5 优化抑菌成分产量的发酵方法虽然枯草芽孢杆菌能在短时间内大量繁殖，但需要生物防腐剂的领域非常广泛，且抑菌成分在大规模工业生产时，如果生产率低下会消耗大量的原材料，最终造成生产成本变高、产生不必要的浪费等问题。因此，未来的研究重点应该放在进一步优化生产工艺，提高抑菌成分的产量和产率，降低成本，这将是未来工业化生产中的核心问题。Sidorova等57为了能达到最佳数量的菌落形成单位和得到高水平的抗真菌代谢物，在多种pH值和温度条件下对枯草芽孢杆菌进行定期培养，发现其中一株枯草芽孢杆菌BZR336g在2025 的培养温度下获得最大滴度且对尖孢镰刀菌的抑制活性最高，pH 8.0时滴度较高；另一株枯草芽孢杆菌BZR517的最佳培养温度为30，滴度为8.9108 CFU/mL，在pH 6.08.0时测出较高的滴度。丰磊等58在研究中确定了枯草芽孢杆菌产抑菌成分的最佳培养条件为初始pH值8.25、转速169 r/min、温度30.24、装液量37.9%、接种量1.46%，此时金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径预测值为30.04 mm，实验测定的抑菌圈直径为29.83 mm，结果与预测值相符，发酵培养基的最佳成分为葡萄糖11.4 g/L、酵母粉5.0 g/L、ZnSO4 0.000 56 g/L、CaCl2 0.059 5 g/L，此时抑菌圈直径预测值为27.83 mm，实验测定的抑菌圈直径为27.22 mm，结果与预测值相符。该实验结果为生产羊毛硫细菌素提供了理论依据。更进一步地，王宏浩等59对枯草芽孢杆菌的培养条件进行优化，最优初始pH值为7.0、接种量为4%，发酵012 h时，37、210 r/min条件下培养，菌体可快速繁殖；发酵12 h后，切换为31、240 r/min，强化抑菌物质合成；相较于优化前的单一培养模式有明显提高。这些研究结果可为后续抑菌物质进一步的分离纯化和抗菌蛋白的鉴定研究提供理论基础，并为其他枯草芽孢杆菌抑菌性能及其抑菌物质的研究提供借鉴。专题论述 Journal of Dairy Science and Technology 2023,Vol.46 No.2 40 6 结 语目前对以枯草芽孢杆菌及芽孢为原料的抑菌剂的研究已经取得了相当大的进展，枯草芽孢杆菌在不同领域中已经被广泛应用，如在农业中已经有多种商品制剂开发和投入生产中用来防治植物病害。但以枯草芽孢杆菌的代谢产物为原料制成的生物制剂产品则少之又少，多数停留在理论基础阶段。在未来，枯草芽孢杆菌抑菌成分的研究应该集中在以下几方面：1）研究新型提取纯化抑菌活性物质的方法，提高抑菌物质的提取率和纯化率，尽管目前已经有多种方法能够提取出抑菌成分，但很少能将单一成分充分、高效地分离出来；2）探究改良枯草芽孢杆菌的培养条件，加大抑菌成分的生产量，目前缺乏大规模生产抑菌成分的生产方式，利用廉价的原材料或工厂废料作为枯草芽孢杆菌生产抑菌成分的原材料和提取剂或可成为未来探索方向之一；3）抑菌成分在使用过程中保持其活性，以蛋白质类物质为例，蛋白质在高温环境的影响下会变性而失去活性，如何在极端环境下使其依旧保持活性是未来发展方向之一，在蛋白类抑菌物质中添加无毒且具有良好惰性的物质作为保护或可成为一种可探索的方式，但如何降低成本也是需要考虑的问题。参考文献：1 白延琴,辛小玲,来有志,等.枯草芽孢杆菌的分离筛选J.畜牧兽医杂志,2013,32(2):24-31.DOI:10.3969/j.issn.1004-6704.2013.2 王晓云.高产蛋白酶枯草牙孢杆菌的筛选与诱变选育研究D.泰安:山东农业大学,2015:1-5.3 康倩,向梦洁,张大伟.枯草芽孢杆菌在系统与合成生物技术中研究进展及工业应用J.生物工程学报,2021,37(3):923-938.DOI:10.13345/j.cjb.200638.4 LEI K,LI Y,WANG Y,et al.Effect of dietary supplementation of Bacillus subtilis B10 on biochemical and molecular parameters in the serum and liver of high-fat diet-induced obese miceJ.Journal of Zhejiang University-Science B,2015,16(6):487-495.DOI:10.1631/jzus.B1400342.5 JI Muxiang,YAO Kebing,LI Guoping,et al.Control effects of Bacillus subtilis DJ-6 and pyraclostrobin alone and in combination against Fusarium oxysporumJ.Agricultural Science and Technology,2014,15(11):2020-2025.DOI:10.16175/ki.1009-4229.2014.11.042.6 李情敏.液、固态发酵法制备双益生菌菌剂的研究D.南昌:江西农业大学,2016:7.7 苏艳莉,孙盛明,朱健,等.枯草芽孢杆菌在水产养殖中的研究进展J.中国渔业质量与标准,2016,6(6):32-39.DOI:10.3969/j.issn.2095-1833.2016.06.006.8 班博,戴维,田科雄.枯草芽孢杆菌的生理功能及其在动物生产中的应用J.湖南饲料,2020(2):42-45.DOI:10.3969/j.issn.1673-7539.2020.02.011.9 XUE Chunmei,WANG Xue,YANG Jiali,et al.Inhibitory effects of Bacillus subtilis on plant pathogens of conservatory in high latitudesC/Proceedings of 2nd international workshop on advances in energy science and environment engineering(AESEE 2018).Zhuhai,China,International Conference on Humanities and Social Science Research,2018:462-466.10 钟涛,王智荣,杜木英.微生物源挥发性物质防治采后果蔬病害的研究进展J.微生物学报,2021,61(7):1771-1785.DOI:10.13343/ki.wsxb.20200420.11 姜明,王立凤,律凤霞.生物抑菌物质研究进展J.农学学报,2013,3(9):53-55.DOI:10.3969/j.issn.1007-7774.2013.09.012.12 常利草.枯草杆菌产抑菌物质的分离提取与性质研究D.新乡:河南师范大学,2019:1-3.13 黄伟,张丽娟,王宁,等.芽孢杆菌属挥发性物质及其在植物病害防治中的应用研究进展J.中国植保导刊,2021,41(9):30-36.DOI:10.3969/j.issn.1672-6820.2021.09.004.14 彭孝坤,吕江漫,邓敦.枯草芽孢杆菌的生物学特性及其在猪生产上的应用进展J.饲料研究,2020,43(11):154-158.DOI:10.13557/ki.issn1002-2813.2020.11.039.15 戚家明,孙杉杉,张东旭,等.芽孢杆菌BS-6基于全基因组数据的分类鉴定及拮抗能力分析J.生物技术通报,2019,35(10):111-118.DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2019-0394.16 KAI M.Diversity and distribution of volatile secondary metabolites throughout Bacillus subtilis isolatesJ.Frontiers in Microbiology,2020,11:559.DOI:10.3389/fmicb.2020.00559.17 杨军.枯草芽孢杆菌J-15及其代谢产物调控小鼠体重增长的作用D.乌鲁木齐:新疆师范大学,2022:8-42.18 陆晓岑,杜明洋,周维佳,等.枯草芽孢杆菌BA015对无乳链球菌的拮抗作用及其物质分析J.大连海洋大学学报,2021,36(1):103-109.DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2019-317.19 隋晓日.枯草芽孢杆菌抗菌物质的制备及其在水产保鲜上的应用D.烟台:烟台大学,2021:11-18;45-50.20 梁艳琼,唐文,董文敏,等.枯草芽孢杆菌菌株Czk1挥发性物质的抑菌活性及其组分分析J.南方农业学报,2019,50(11):2465-2474.DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2019.11.12.21 吉亚泰.枯草芽孢杆菌N-18防治番茄颈腐根腐病作用机理初步解析D.泰安:山东农业大学,2022:17-38.22 吴越,王世锋,陈鑫,等.枯草芽孢杆菌HAINUP40的培养条件及其抑菌物质分析J.基因组学与应用生物学,2020,39(6):2638-2645.DOI:10.13417/j.gab.039.002638.23 冯艳琴,沈辉,王兴强,等.VPAHPND拮抗菌筛选鉴定及其活性物质的初步研究J.水产学杂志,2022,35(2):35-41.DOI:10.3969/j.issn.1005-3832.2022.02.006.24 HONG S W,KIM J H,CHA H A,et al.Identification and characterization of a bacteriocin from the newly isolated Bacillus subtilis HD15 with inhibitory effects against Bacillus cereusJ.Journal of Microbiology and