枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化及应用的研究.pdf

理 论 探 讨第 40 卷第 4 期皮革与化工Vol.40No.42023 年 8 月LEATHER AND CHEMICALSAug.2023收稿日期：2023-08-02基金项目：河北省省级省校科技合作开发项目（2020031513-2）；河北省科学院高层次人才培养与资助项目（2022G15）作者简介：吴芳彤（1988-），女，河北保定人，助理研究员，硕士，从事工业酶制剂研究，。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化及应用的研究吴芳彤，王力源，秦梦，赵露，郑翔，刘春卯，曹倩荣（河北省微生物研究所有限公司，河北 保定 071052）摘要:目前酶法脱毛用酶稳定性差，易受到外界环境影响。为改善酶的稳定性和提高酶法脱毛效率，以脱毛用中性蛋白酶为研究对象，以纳米 SiO2、海藻酸钠和壳聚糖为固定化材料，采用共价结合法对枯草芽孢杆菌来源的重组中性蛋白酶的固定化进行了探索和研究。以固定化中性蛋白酶的酶活回收率为指标，通过单因素结合响应面法优化了中性蛋白酶固定化三种材料的配比，纳米 SiO21.02%、壳聚糖 1.32%和海藻酸钠 1.57%，在此条件下固定化中性蛋白酶的回收率可达 67.28%4.21%。将固定化中性蛋白酶应用于黄牛皮循环脱毛工艺中，可循环脱毛 4 次，液体酶仅可开展 3 次，与液体酶相比其稳定性显著提高。经组织学评价脱毛后的黄牛皮粒面和毛孔结构清晰，网状层联系紧密，无缝隙；胶原纤维束内部略松散，胶原纤维束之间略松散。因此，固定化中性蛋白酶可用于皮革业脱毛环节，推动酶制剂在制革业的应用。关键词：纳米 SiO2-壳聚糖-海藻酸钠微球；中性蛋白酶；固定化；响应面法；循环脱毛中图分类号：TS529.1文献标识码：A文章编号：1674-0939（2023）04-0008-07Immobilization of Neutral Protease fromand Its ApplicationWU Fangtong,WANG Liyuan,QIN Meng,ZHAO Lu,ZHENG Xiang,LIU Chunmao,CAO Qianrong（Hebei Research Institute of Microbiology CO.,LTD.,Baoding 071052,China）Abstract:At present,the enzyme is unstable in enzymatic depilation and is easily inactivated by theexternal environment.In order to improve the stability of the enzyme and improve the efficiency ofenzymatic depilation,the immobilization of recombinant protease from Bacillus subtilis was studied bycovalent binding method with nano-SiO2,sodium alginate and chitosan as immobilized materials.Theratio of protease immobilization materials were optimized by single factor combined with responsesurface method with the recovery rate of immobilized protease activity as the index.The optimalformula was 1.02%nano-SiO2,1.32%chitosan and 1.57%sodium alginate.Under this condition,therecovery rate of immobilized protease could reach 67.28%4.21%.The immobilized protease couldbe used in the recycling depilation process of cattle hide for 4 times,while the liquid protease couldonly be used for 3 times,and its stability was significantly improved compared with the liquid protease.The histological evaluation showed that the grain surface and pores structure of cattle hide afterdepilation was clear,and the mesh layer was closely connected and seamless,the collagen fiber bundlewas slightly loose inside and slightly loose between the collagen fiber bundles.Therefore,immobilizedprotease can be used in the depilation process of leather industry to promote the application of enzymepreparation in leather industry.Key words:nano-SiO2-chitosan-sodium alginate microspheres;neutral protease;immobilization;response surface method;recycling depilation制革工业是我国的传统产业之一，具有悠久的历史，但也是轻工行业的污染大户。其中脱毛排放的污染物可占整个制革过程排污量的 80%90%，其原因在于目前皮革企业普遍采用灰碱法脱毛，由于硫化物和石灰的使用，使排放的废水含有大量 S2-、有机物、固体悬浮物、碱性污泥等1-3。随着我国环保要求不断提高，寻求绿色环保的替代方法成为企业迫切的需求。酶制剂作为绿色环保的催化剂，在工业生产中使用既能满足法规要求，又能满足客户对清洁技术和清洁、可持续生产方法的需求，从而降低对环境的影响4-6。在 20 世纪 60 年代，我国就筛选出 AS1.398 中性蛋白酶和 3942 碱性蛋白酶用于皮革脱毛。但由于酶对温度和 pH 敏感，易受外界环境影响而失活，对设备和操作要求相对严格，并且脱毛时使用的粗酶液中还含有胶原蛋白酶，易产生松面、烂面等现象，影响皮革品质7，限制了其大规模的推广。近年来有大量文献报道了从不同微生物中获取的菌株采用不同策略以获得性质更稳定、价格更低廉的蛋白酶。Zhang 等8从耐盐普氏菌 Planococcushalotolerans SCU63(T)中克隆得到碱性金属蛋白酶基因 1067，并在枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis SCK6中异源表达，将其应用于山羊皮脱毛，结果表明酶法脱毛的皮革质地优于化学法脱毛的皮革。Nishu 等9以碱性蛋白酶(Akp)为原料，制备了一种新型生物纳米银酶共轭物，并将其应用于牛皮脱毛，皮组织切片观察表明，脱毛效果与粗酶液相当且用酶量更少。蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中10，是全球市场上开发最多的酶类。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，是芽孢杆菌属细菌所分泌的胞外中性蛋白酶，由于其催化速率高、作用条件温和，被广泛应用在皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶、洗涤剂、饲料、酿酒酿造、医药、化工、食品、废弃物处理等领域11。目前已报道发现的中性蛋白酶类有 3 000 多种，但实现大规模工业化生产的只有 60 多种12。其原因在于中性蛋白酶热稳定差、易自溶，是微生物蛋白酶中最不稳定的酶13。固定化技术可有效改善酶热稳定性和 pH 耐受性，且与传统游离酶相比易分离，可反复利用实现连续生产14。酶固定化技术的关键在于固定化所用材料的性能和固定化方法。目前已报道的固定化材料可分为天然高分子材料（如壳聚糖、明胶、海藻酸钠等）、合成高分子材料树脂、纳米磁性材料等。壳聚糖是一种天然的、可再生的、可生物降解的、低成本的几丁质有机聚合物。由于其表面存在氨基（NH2）和羟基（OH）两个官能团，可以很容易地被修饰与酶分子形成共价键15-17。纳米二氧化硅是一种低毒、低成本、生物相容性好、化学惰性和热稳定性优良的化学载体，被广泛应用于生物医药、酶制剂等领域18。纳米二氧化硅的结构表面含有大量的羟基，易于和蛋白质形成稳定的共价连接，同时因其具有较大的比表面积和孔容，可为酶的固定化提供良好条件，且稳定性好不会产生环境问题，因此纳米二氧化硅可以作为优良的固定化酶载体材料19。本 实验室以枯草 芽 孢杆 菌 Bacillus subtilisWB800N 为底盘细胞，克隆了中性蛋白酶基因 npr，构建了枯草芽孢杆菌工程菌 WB800N/pHT43-npr，本文以其发酵产物中性蛋白酶为研究对象20，以纳米 SiO2、壳聚糖、海藻酸钠为固定化载体，戊二醛为交联剂，优化中性蛋白酶固定化条件并将其应用于皮革脱毛中，以期为酶法脱毛提供更稳定、更低廉的蛋白酶，实现皮革脱毛的连续化和自动化，推动酶制剂在制革业的应用。1材料与方法1.1材料与试剂枯草芽孢杆菌工程菌 Bacillus subtilis（WB800N/pHT43-npr），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC No.11625。工程菌 WB800N/pHT43-npr 的发酵液经 7000 r/min 离心 15 min 取上清，300目硅藻土抽滤即为中性蛋白酶粗酶液。福林试剂、碳酸钠、三氯乙酸、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酪蛋白、乙酸、戊二醛、乙醇、丙酮、第 4 期9吴芳彤，等：枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化及应用的研究甲醛等均为国药化学纯；纳米 SiO2、150 kDa 壳聚糖、氯化钙、海藻酸钠均为化学纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；苏木素-伊红（HE）染色液为化学纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；300 目硅藻土为化学纯，购自玛雅试剂有限公司。1.2仪器与设备DZKW-4 电热恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；ZXRD-A7230 恒温鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司；PHS-25 pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；TD10002G 电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；JA2003A 电子精密天平，天津天马衡基仪器有限公司；H3018DR 高速冷冻离心机，上海知信实验仪器技术有限公司；ZWY-2012C振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；DF-101Z 集热式恒温加热磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV-8 000 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；H550L 光学显微镜，尼康株式会社；KD-VI、KD-2268 冷冻切片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。1.3试验方法取 1.5%的壳聚糖溶于 1%乙酸溶液中，待充分溶解后加入 2%的 CaCl2。取上述溶液 20 mL 置于磁力搅拌器，将 10 g 含有 1%纳米 SiO2和 2%海藻酸钠的混合溶液逐滴滴入含有 CaCl2的壳聚糖溶液中，以一定转速搅拌，形成 23 mm 的光滑小球后置于4下硬化 1 h，用蒸馏水清洗去除凝胶表面的离子，抽滤除去表面水分并用滤纸吸干微球水分，置于4备用。将空白微球置于 2.5%戊二醛溶液中，交联搅拌10 h 后，用蒸馏水清洗去除多余戊二醛溶液，抽滤除去表面水分后用滤纸充分吸干。将交联后的纳米SiO2-壳聚糖-海藻酸钠微球按照 10%固液比加入2000 U/mL 的中性蛋白酶中，30振荡过夜，用蒸馏水清洗 35 次，抽滤除去表面水分后用滤纸充分吸干，即得到固定化中性蛋白酶。将纳米 SiO2-壳聚糖-海藻酸钠空白微球分别置于粗酶液、75%乙醇纯化和 3 倍丙酮纯化后的中性蛋白酶液体中，按照 1.3.2 制备得到固定化中性蛋白酶，并将制得的固定化中性蛋白酶以及制备固定化中性蛋白酶后剩余的酶液分别测定酶活性，计算回收率。中性蛋白酶液体纯化工艺：将中性蛋白酶粗酶液加入 95%的乙醇使其浓度达到 60%，4静置过夜，弃上清，取沉淀加入适量 pH 7.5 的磷酸缓冲液使其中性蛋白酶酶活达 2000 U/mL。将粗酶液与丙酮按照 13 的比例混匀后，4静置过夜，弃上清，取沉淀加入适量 pH 7.5 的磷酸缓冲液使其中性蛋白酶酶活达 2000 U/mL。在制备纳米 SiO2-壳聚糖-海藻酸钠空白微球时分别添加 0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的纳米SiO2；分别添加 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的壳聚糖；分别添加 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的海藻酸钠，按 1.3.1 和 1.3.2 制备得到固定化中性蛋白酶并测定回收率。以回收率（Y）为响应值，运用 Design-Expert8.0.6 对纳米 SiO2添加量（X1）、壳聚糖添加量（X2）和海藻酸钠添加量（X3）进行响应面优化。取鲜牛皮，经过浸水、脱脂、充分水洗后沿背脊线分割，将相同部位的牛皮分割为两块，分别作为对照组（液体中性蛋白酶粗酶液）和实验组（固定化中性蛋白酶），实验采用有温有浴且不补加酶的循环脱毛方法，控制酶活力 150 U/mL、温度 35、pH 7.0、固液比 13。每批次脱毛完成后，从液体酶中直接取出旧皮块，调整 pH 至 7.0 左右，再添加新皮块继续新批次脱毛；固定化酶脱毛时在取出旧皮块后将固定化酶清洗干净，再重新添加蒸馏水并调整 pH至 7.0 左右。每批次脱毛完成后记录脱毛时间，测定脱毛浴液的酶活保存率。固定化中性蛋白酶和液体中性蛋白酶粗酶液脱毛结束后，取 2 cm2 cm 裸皮样品，用蒸馏水清洗样品至废水无酶活力测出，然后置于 10%中性甲醛溶液中固定化 24 h，再采用冷冻切片法纵切样品至15m 的薄片，HE 染色后光学显微镜观察皮粒面和纤维分散情况21。酶活力的测定方法，参照 GB/T 23527-2009 蛋白酶制剂 中附录 B 的方法，其中固定化中性蛋白皮革与化工LEATHER AND CHEMICALS第 40 卷10酶酶活性的测定将方法中液体酶改为固定化中性蛋白酶。回收率的计算公式：w(%)=Ai/A0100（w：回收率；Ai：固定化酶的活性；A0：液体酶的初始活性）酶活保存率计算公式：m(%)=Bi/B0100（m：酶活保存率；Bi：脱毛后剩余的酶活力；B0：脱毛前初始酶活力）2结果与讨论2.1酶的不同处理对固定化的影响将纳米 SiO2-壳聚糖-海藻酸钠空白微球分别置于粗酶液、75%乙醇纯化和 3 倍丙酮纯化后的中性蛋白酶液中制得固定化中性蛋白酶，固定化酶及制备固定化酶后的剩余酶液的回收率见图 1。经丙酮纯化后的固定化中性蛋白酶的回收率最高，可达54.81%0.19%。经乙醇纯化后制备的固定化中性蛋白酶并未检测出酶活，而剩余酶液的回收率为34.35%0.23%。这可能是由于没有丙酮作为沉淀剂，未纯化的酶液相对稳定性较差，在硅酸钠的作用下反而合成了大尺寸的团聚体，影响酶分子的释放5。图 1蛋白酶液的不同处理对固定化的影响Fig.1Effect of different purification ofprotease liquid on immobilization2.2中性蛋白酶固定化复合材料的单因素优化纳米 SiO2添加量对中性蛋白酶固定化回收率的影响如图 2 所示，固定化中性蛋白酶的回收率随纳米 SiO2添加量的增加而上升，当纳米 SiO2添加量为 1.0%时，固定化中性蛋白酶的回收率达到最大，继而开始下降。因此，中性蛋白酶固定化材料纳米 SiO2的最适添加量为 1.0%。图 2纳米 SiO2添加量对中性蛋白酶固定化的影响Fig.2The influence of nano-SiO2additionon immobilization of neutral protease如图 3 所示，回收率随壳聚糖浓度的增加而上升，当壳聚糖浓度为 1.0%1.5%时，中性蛋白酶的回收率达到最大，继而开始下降。壳聚糖分子在适量浓度的酶分子存在下可扩散进入海藻酸钙凝胶表层，大量的NH3+与COO-结合形成致密且厚的薄膜，可将游离酶固定在微球内部；当浓度继续升高时，膜过厚以及密度过大严重影响酶的扩散与释放；而当壳聚糖浓度为 1.0%时形成的薄膜密度较低且薄，在应用过程中容易破碎。因此，壳聚糖最适浓度为 1.5%。图 3壳聚糖添加量对中性蛋白酶固定化的影响Fig.3 The influence of chitosan additionon immobilization of neutral protease海藻酸钠是制备固定化酶最常用的包材之一，其浓度对形成的海藻酸钙凝胶孔径以及形成的微球形态都有很大的影响。由海藻酸钠和 Ca2+的作用机理可知，如果海藻酸钠浓度较低，其与 Ca2+的离子交换会不完全，导致凝胶结构疏松酶分子容易流失，微球表面也不圆整，而随着海藻酸钠浓度上升，就有足够的COO-提供给 Ca2+和NH3+结合，此时微球的形态好，且强度大不易黏连；当海藻酸钠浓度进一步增加时，凝胶强度增强，但海藻酸钠与 Ca2+形成的凝胶以及外层纳米 SiO2、海藻酸钠和壳聚糖薄膜过第 4 期11吴芳彤，等：枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化及应用的研究于致密，使得内部的酶分子难以释放到外部与底物结合，且高浓度的海藻酸钠黏度较高，形成的微球因拉伸扭曲而变形。从图 4 可以看出，固定化中性蛋白酶的回收率随海藻酸钠浓度增大而升高，当海藻酸钠浓度达到 1.5%时，回收率达到最高。图 4海藻酸钠添加量对中性蛋白酶固定化的影响Fig.4The influence of sodium alginate additionon immobilization of neutral protease2.3中性蛋白酶固定化材料的响应面优化响应面优化采用 Design-expert 8.0.6 中 Responsesurface 的 Central Composite Design（CCD），涉及立方点1、轴向点 以及中心点 0，当因素为 3 的时候 为 1.682，试验因素与水平设计见表 1。表 1响应面试验因素与水平Tab.1Response surface test factors and levels以中性蛋白酶酶活回收率为响应值，将中性蛋白酶酶活回收率最高作为优化目标进行实验。实验设计及响应值见表 2。利用 Design-Expert 8.0.6 对表的实验数据进行二次多项式回归拟合，获得回归方程：Y=65.74+1.79A-2.99B+1.73C+2.59AB-3.01AC-1.45BC-5.76A2-4.31B2-8.13C2。对该模型方程进行方差分析和显著性分析，结果见表 3。模型 F=13.20，P=0.00040.01 极显著，负相关系数 R2=92.96%，校正决定系数 RAdj2=水平因素X1纳米 SiO2添加量/%X2壳聚糖添加量/%X3海藻酸钠添加量/%-1.6820.160.660.66-10.51.01001.01.51.5+11.52.02.0+1.6821.842.342.34试验号X1X2X3回收率/%1-11-137.8321-1-153.2231.6820049.54401.682048.6351-1150.016001.68245.24700-1.68238.48800069.80900058.4210-11141.201100067.4812-1.6820047.621300068.3314-1-1-143.931511-151.52160-1.682056.721700064.9718-1-1159.071911148.45表 2CCD 试验设计及其结果Tab.2CCD design and experimental results表 3二次逐步回归模型方差分析Tab.3Quadratic stepwise regression model analysis of variance编码变量平方和自由度df均方F值p 值模型1 638.509182.0613.200.0 004*A43.59143.593.160.1 091B122.101122.108.860.0 156*C40.78140.782.960.1 196AB53.61153.613.890.0 801AC76.82176.825.570.0 426*BC16.91116.911.230.2 968A2452.641452.6432.830.0 003*B2253.651253.6518.400.0 020*C2903.201903.2065.510.0 001*残差124.09913.79失拟项43.7158.740.440.8 071纯误差80.38420.09总和1 762.5818注：*表示极显著（P约0.01）；*表示显著（P约0.05）。皮革与化工LEATHER AND CHEMICALS第 40 卷1285.92%，表明 85.92%的变化可以由此模型解释，说明模型的拟合程度较好，能很好地反映纳米 SiO2添加量（X1）、壳聚糖添加量（X2）和海藻酸钠添加量（X3）对中性蛋白酶固定化的影响。其中纳米 SiO2添加量（X1）和海藻酸钠添加量（X3）之间交互作用显著（P0.05）。失拟项（P=0.80710.05）不显著，表明未知因素对实验结果影响较小。观察两因素交互作用对响应值的影响可采用降维分析（Dimension Reduction Analysis，DRA），即其他因素保持在零水平情况下，观察两个因素交互作用对响应值的影响并得到其响应面及等高线，如图 5所示。通过 Design-Expert8.0.6 对该模型进行分析，获得多组最优解，选取预测响应值最高的前三组分别为 X1=1.02%、X2=1.32%、X3=1.57%。在此条件下进行了 3 次验证试验，其回收率为 67.28%4.21%。2.4固定化中性蛋白酶在脱毛中的应用以黄牛皮为研究对象，采用不补加酶液的有温有浴循环脱毛，共进行了 4 次循环脱毛试验。如图 6所示，固定化中性蛋白酶第 4 次脱毛完成后，脱毛废液的中性蛋白酶的酶活保存率为 85.85%1.56%，脱毛时间 7 h，与第一次脱毛时间 6 h 相比增加了 1 h；而液体中性蛋白酶粗酶液第 3 次脱毛完成后，脱毛废液的中性蛋白酶的酶活保存率为 54.11%2.38%，脱毛时间 8 h。液体中性蛋白酶粗酶液第 4次脱毛至 9 h 时测得酶活保存率为 34.84%1.86%，但此时毛根与毛囊结合仍较为紧密，还未达到较好的脱毛效果。因此，中性蛋白酶经固定化处理后其稳定性显著提高，在循环脱毛工艺中可提高蛋白酶的利用率，降低酶法脱毛成本。2.5固定化中性蛋白酶脱毛后牛皮组织学观察如图 7（a）和 7（b）所示，用固定化中性蛋白酶与液体中性蛋白酶粗酶液经 67 h 有温有浴脱毛后，冷冻纵切皮块样品，经光学显微镜观察可知，固定化酶和液体酶脱毛后的皮块样品粒面和毛孔结构清图 5纳米 SiO2和海藻酸钠添加量交互作用对回收率影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour map of the interaction effect of nano-SiO2and sodium alginate addition on recovery rate图 6固定化中性蛋白酶和液体中性蛋白酶粗酶液在酶循环脱毛过程中酶活力的变化Fig.6The change of enzyme activity of immobilized and crudeliquid neutral protease during enzyme depilation recycle（a）4，液体酶脱毛后牛皮粒面；（b）4，固定化酶脱毛后牛皮粒面；（c）10，液体酶脱毛后牛皮网状层；（d）10，固定化酶脱毛后牛皮网状层图 7固定化中性蛋白酶和液体蛋白酶脱毛后的组织学切片图Fig.7Histological sections of depilation by immobilizedneutral protease and liquid protease第 4 期13吴芳彤，等：枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化及应用的研究晰，90%毛囊干净无毛根残留，但仍有部分毛囊可观察到细小毛根未除净，未脱净的小毛多集中在皮块边角处；如图 7（c）和 7（d）所示，皮块样品网状层结构紧密，无缝隙，其胶原纤维束内部略松散，胶原纤维束之间略松散。说明中性蛋白酶经固定化处理后并未改变其酶学特性，对牛皮的脱毛效果并未见明显差异。3结 论截至目前，酶法是最有可能代替灰碱法的清洁化脱毛方法，但由于酶稳定性差、易受 pH 和温度影响、工人操作粗放、成本高，造成酶法脱毛一直未实现产业化。本文采用共价结合法，以纳米 SiO2-壳聚糖-海藻酸钠为固定化材料，获得了皮革脱毛用中性蛋白酶，通过单因素结合响应面法优化了固定化材料配比，1.02%的纳米 SiO2、1.32%的壳聚糖和1.57%的海藻酸钠，其回收率可达 67.28%4.21%。将固定化中性蛋白酶应用于皮革循环脱毛中，可循环脱毛 4 次，且第 4 次脱毛完成后脱毛液酶活保存率可达 85.85%1.56%，而液体中性蛋白酶粗酶液仅可循环脱毛 3 次，酶的稳定性得到了显著提高。同时脱毛后的牛皮经组织学观察，粒面和毛孔结构清晰，网状层联系紧密，无缝隙；胶原纤维束内部略松散，胶原纤维束之间略松散，适用于后续皮革的鞣制。本文研究的固定化中性蛋白酶应用于皮革脱毛工艺可显著提高脱毛效率，并通过循环脱毛工艺能降低脱毛成本，为实现酶法脱毛提供了参考。参考文献：1 何灿,但年华,张玉红,等.几种保毛脱毛法及其作用机理J.西部皮革,2014,36(18):24-29.2 SUJITHA P,SHANTHI C.Insights into substrate specificityof proteases for screening efficient dehairing enzymes J.International journal of biological macromolecules,2021,172:360-370.3 DE LIMA E E,FRANCO D G,GALEANO R M S,et al.Biochemical characterization of a partially purified proteasefrom Aspergillus terreus 7461 and its application as anenvironmentally friendly dehairing agent for leather industryJ.Preparative biochemistry and biotechnology,2021,51(4):320-330.4 CHOI J M,HAN S S,KIM H S.Industrial applications ofenzyme biocatalysis:current status and future aspects J.Biotechnology advances,2015,33(7):1443-1454.5 JOSHI N,KOCHER G S,KALIA A,et al.Bacillus circulansMTCC 7906 aided facile development of bioconjugatenano-silica alkaline protease 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