呋喃西林代谢物快速检测.doc

呋喃西林代谢物（SEM）快速检测试
一、 原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的SEM，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的SEM和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃西林代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的SEM含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物含量。
二、 试剂盒技术指标：
试剂盒灵敏度： 0.1ppb
样本检测下限：
组织、蜂蜜 —————— 0.2ppb
回收率：
鱼/虾水产组织 ————— 85%±10%
蜂蜜/鸡肉/肝脏样本————75%±15%
交叉反应率：
呋喃西林代谢物 ————— 100%
呋喃它酮代谢物 ————— ＜0.1%
呋喃妥因代谢物 ————— ＜0.1%
呋喃唑酮代谢物 ————— ＜0.1%
三、试剂盒组成
1．微量测试孔：每条8孔，一板12条
2．标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3．酶标记物 12ml………………红色帽
4．抗体浓缩液 1ml…………….. 蓝色帽
5．底物A液 7 ml………………白色帽
6．底物B液 7 ml ……………. 黑色帽
7．终止液 7 ml ………………黄色帽
8．20X浓缩洗涤液40 ml……… 白色帽
9．2X浓缩复溶液 50 ml……… 透明帽
10．10ml衍生化试剂………….. 白色帽
（不能与其它衍生化试剂混用）
11. 样本提取液 500ml………… 黑色帽
（不能与其它试剂混用）
四、 所用仪器、试剂
具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl
试 剂：氢氧化钠、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、邻硝基苯甲醛、亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5•NO•3H2O）ZnSO4•7H2O
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
1．用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1 稀释，用于提取后的样本复溶
2．C液：（供奶样用）称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。
D液：（供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。
3．0.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO4•3H2O
加去离子水溶解定溶至1L
4．1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。
5．1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。
样本的处理
(a) 肉样或鱼虾
用均质器均质样本,接（d）的描述方法
(b) 奶样
1. 取出5ml的奶样本到玻璃离心管中,分别加入C液和D液各250µl。
2. 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000r/min以上离心10min(4-12℃).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8℃,然后离心。
3. 接(d)的描述方法
(c) 蜂蜜
1. 取1±0.05g样本到离心管中。
2. 加入4ml的去离子水溶解,再加入0.5ml 1M HCl和100µl衍生化试剂,充分振荡。
3. 接(d)第2步描述方法
(d)接上面的方法
1.取1±0.05g的均质样本(肉样/鱼虾)、牛
奶的离心上清液1.1ml（相当1ml奶样），
分别加入4ml的去离子水，0.5ml1M HCl
和100µl衍生化试剂，充分振荡。
2.置于37℃过夜孵育（大约16h）。
3.分别加入5ml 0.1M K2HPO4， 0.4 ml 1M
NaOH和5ml的样本提取液，充分振荡30s；
4.在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心
10min。
5.取出2.5ml的样本提取液到另一洁净容器中
于50℃氮气/空气吹干。
6.用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀释
好的复溶液充分混合；在室温下（20-25℃）
4000r/min以上离心10min。
7.取50µl下层相用于分析。
样本稀释倍数：2
六、酶标免疫分析程序
1．从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2．取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3．配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用（或按需要量稀释）。
4．编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5. 将浓缩抗体用已稀释好的复溶液11倍稀释（1份抗体加入10份稀释液）
6．加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。37℃环境中反应30min。
7．取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
8．每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
9．显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。
10．测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。
七、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与SEM的含量成负相关。
1、定性判定：
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含SEM浓度范围
（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.268，样品2的吸光度值为1.230，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.671；0.1ppb为1.425；0.3ppb为1.103； 0.9ppb为0.567； 2.7ppb为0.205； 8.1ppb为0.104。则样品1的浓度范围是0.9ppb-2.7ppb；样品2的浓度范围是0.1ppb-0.3ppb。（再乘以相应的稀释倍数）
2、定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以SEM标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中SEM实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
八、注意事项
1．用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。
2．用之后立即将所有试剂放回2-8℃冰箱。
3．在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的 洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。
4.所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
5．室温低于37℃或试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
6．在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
7．混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
8．反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
9．不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释
或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
10.不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
11．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
九、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。