基于全基因组的穿心莲NRAMP基因家族鉴定与生物信息学分析.pdf

接收日期：2023-04-24 接受日期：2023-05-15 基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程经费资助(2021-I2M-1-071)*通信作者。E-mail: 基于全基因组的穿心莲基于全基因组的穿心莲 NRAMP 基因家族鉴定与生物信息学分析基因家族鉴定与生物信息学分析 范潘慧1，武立伟1，孙 伟2，王 瑀1，高 巍3,4，邢建永3,4，宋经元1,5，姚 辉1,5*(1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所国家中医药管理局中药资源保护重点研究室，北京 100193；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3.华润三九(六安)中药材产业发展有限公司，安徽 六安 237000；4.华润三九现代中药制药有限公司，广东 惠州 516000；5.中药资源教育部工程研究中心，北京 100193)摘 要：自然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural resistance associated macrophage protein，NRAMP)是一类广泛存在于动植物及微生物中重要的膜转运蛋白，在植物重金属离子转运和重新利用中起着重要作用。为探究穿心莲 Andrographis paniculata 的 NRAMP 基因家族生物学特性，本研究根据拟南芥 NRAMP 家族的蛋白序列，从穿心莲全基因组中筛选鉴定了 7 个 NRAMP 家族成员，命名为 ApNRAMP1ApNRAMP7，并分析其基因结构和编码蛋白的理化性质等相关信息。结果表明，ApNRAMPs 基因编码蛋白的长度为 513553 aa，分子量在 56.0060.54 kD 之间，所有成员均定位于细胞膜上。系统进化分析表明，NRAMP 基因家族分为 2 个亚家族。基因结构分析发现，属于 Group的 ApNRAMP3ApNRAMP6含有 3 个内含子，而属于 Group的 ApNRAMP1、ApNRAMP2、ApNRAMP7 则含有 12 个内含子；保守基序分析发现，Motif18 保守基序存在于所有的 ApNRAMPs 编码的蛋白序列。蛋白结构预测分析发现，ApNRAMPs 蛋白二级结构主要由-螺旋和无规则卷曲构成，三维结构较为相似。该研究结果为进一步解析 ApNRAMPs 基因参与镉胁迫响应的分子机制提供参考。关键词：穿心莲；NRAMP 基因家族；鉴定；生物信息学；全基因组 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2023.03.001 中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2023)03-0175-08 Identification and Bioinformation Analysis of NRAMP Gene Family Based on Andrographis paniculata Genome FAN Pan-hui1,WU Li-wei1,SUN Wei2,WANG Yu1,GAO Wei3,4,XING Jian-yong3,4,SONG Jing-yuan1,5,YAO Hui1,5*(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry of Education,Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100193,China;2.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;3.China Resources Sanjiu(Luan)Traditional Chinese Medicine Industry Development Co.,Ltd.,Luan 237000,Anhui China;4.China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co.,Ltd.,Huizhou 516000,Guangdong China;5.Engineering Research Center of Chinese,Beijing 100193,China)Abstract:Natural resistance associated macrophage protein(NRAMP)is a major class of membrane transporters widely found in animals,plants and microorganisms,and play an important role in transporting and reusing heavy metal ions in plants.For exploring the biological characteristics of NRAMP gene family in Andrographis paniculata,seven NRAMP gene family members were screened and identified from the whole genome,named 2023,52(3):175182.Subtropical Plant Science 第 52 卷 176ApNRAMP1ApNRAMP7,and their gene structures and physicochemical properties of the encoded proteins were analyzed.The results showed that the proteins encoded by ApNRAMPs genes ranged from 513 aa to 553 aa in length,and their molecular weight were between 56.00 kD and 60.54 kD.The subcellular localizations of all members were in the cell membrane.Phylogenetic analysis found that the NRAMP gene family was divided into two subfamilies.ApNRAMP3ApNRAMP6 in Group contained 3 introns,while ApNRAMP1,ApNRAMP2,and ApNRAMP7 in Group contained 12 introns,and their encoded protein sequences all contained Motif18 sequences.Protein structure prediction analysis showed that the secondary structures of ApNRAMPs proteins were mainly composed of-helix and random coil,and the three-dimensional structures were relatively similar.This study provides a reference for further elucidation of the molecular mechanism of ApNRAMPs genes involvement in cadmium stress response.Key words:Andrographis paniculata;NRAMP;identification;bioinformatics;whole genome 土壤是植物重金属的主要来源之一1，随着全球工业化的进程以及人口的快速增长，废弃物的排放使得重金属污染进一步加剧，导致植物从土壤环境中吸收过量的重金属离子。金属转运蛋白在植物对重金属的摄取、吸收和转运过程中发挥着重要的作 用。自 然 抗 性 相 关 巨 噬 细 胞 蛋 白(Natural resistance-associated macrophage protein,NRAMP)基因家族编码多个膜定位的金属转运蛋白，参与 Cd、Pb 等多种重金属的吸收和转运23。目前，拟南芥Arabidopsis thaliana 4、水稻 Oryza sativa 5、烟草Nicotiana tabacum 6、大麦 Hordeum vulgare 7、大豆Glycine max 8等植物的NRAMP基因家族均被挖掘报道。拟南芥中 AtNRAMP6 参与 Cd 的转运3。水稻中 OsNRAMP5 参与 Cd、Pb 的转运2,9，其过表达减少了 Cd 从根向芽的转移，从而降低水稻籽粒的 Cd 含量10；OsNRAMP1 的敲除可降低水稻籽粒 Cd 含量5。此外，药用植物黄连 Coptis chinensis中的 NRAMP4 和 NRAMP5 基因被证明参与 Cd 的吸收1112。这些研究表明，在植物对重金属的吸收和转运中，NRAMP 基因家族起着至关重要的作用。穿 心 莲 Andrographis paniculata 为 爵 床 科Acanthaceae 穿心莲属一年生草本植物，广泛分布于热带、亚热带区域，20 世纪 50 年代引种于我国广东、广西、福建和海南等地区13。传统中医药理论认为穿心莲具有清热解毒、凉血、消肿等作用14，现代药理研究表明其主要活性成分为穿心莲内酯，具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等多种作用15，因此又被称为“中药抗生素”16。在新冠肺炎流行期间，穿心莲被用作抗病毒治疗的有效药物而需求激增17。然而，由于种植过程中的农药化肥滥用等问题，导致穿心莲中重金属含量超标问题频出18。目前对于穿心莲的重金属污染问题的相关研究报道较少1920，对穿心莲重金属吸收转运分子机制解析的研究较为欠缺。本研究基于穿心莲参考基因组数据21，筛选鉴定得到 7 个穿心莲 NRAMP 基因家族成员，并对其基因结构、编码蛋白的理化性质及进化关系等方面进行系统的生物信息学分析，为进一步探讨穿心莲NRAMP 基因家族成员对重金属胁迫响应的具体功能提供理论和实践基础。1 材料与方法 1.1 穿心莲基因组数据来源及其 NRAMP 基因家族成员的鉴定 穿心莲的全基因组数据(ASM980555v1)来源于NCBI 数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/GCF_009805555.1/)21，以已知模式物种拟南芥的 NRAMP 基因家族蛋白序列为索引，利用本地 Blastp 在穿心莲全基因组的蛋白数据中进行比对分析，选取 E1010的序列；并通过 SMART(http:/smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI Conserved Domains(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对 Blastp 比对得到的候选序列进行检索筛选和确认。最终，在穿心莲全基因组中共鉴定获得 7 个 ApNRAMPs 基因，并用于后续分析。第 3 期 范潘慧等：基于全基因组的穿心莲 NRAMP 基因家族鉴定与生物信息学分析 1771.2 ApNRAMPs 基因编码的蛋白序列的基本理化性质分析 将所获穿心莲ApNRAMPs基因家族的蛋白序列上传至在线网站 ProtParam(http:/web.expasy.org/protparam/)和 ExPASy(https:/web.expasy.org/protscale/)对其编码蛋白质的长度、分子量、理论等电点和亲水性等基本理化性质进行分析22；并通过在线网站WoLF-PSORT(https:/wolfpsort.hgc.jp/)对其亚细胞定位进行预测分析。1.3 ApNRAMPs 蛋白的系统进化、基因结构和保守基序分析 将穿心莲、拟南芥及水稻的 NRAMP 蛋白序列导入 MEGA 11 软件进行多序列比对，而后采用邻接法(Neighbor-joining，NJ 法)构建系统进化树，并用 Bootstrap 法评估系统进化树，其中重复次数(Replications)设定为 100023。根据 ApNRAMPs 基因的 CDS 序列及其基因组的DNA 序列，利用 GSDS(http:/gsds.gao-lab.org/)网站绘制ApNRAMPs基因家族成员的外显子和内含子结构模式图24，通过NCBI CD-search 功能预测ApNRAMPs蛋白结构域。通过 MEME(https:/meme-suite.org/)网站完成 ApNRAMPs 蛋白序列的保守基序分析25。1.4 ApNRAMPs 蛋白空间结构分析预测 通过在线网站 SOPMA(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测分析 ApNRAMPs 蛋白二级结构26；利用 SWISS-MODEL(https:/swissmodel.expasy.org/)在线分析网站对 ApNRAMPs 蛋白的三维空间结构进行预测27，并通过 PyMOL 优化所预测蛋白质的三级结构 28。2 结果与分析 2.1 穿心莲 NRAMP 基因家族成员的鉴定及其编码蛋白的理化性质分析 以模式植物拟南芥中已知的 6 个 NRAMP 蛋白序列为参考，共鉴定获得 7 条穿心莲 NRAMP 蛋白序列，确定其为 NRAMP 基因家族成员，命名为ApNRAMP1ApNRAMP7。对 ApNRAMPs 基因编码的氨基酸序列进行理化性质分析，发现 ApNRAMPs氨基酸长度与分子量均十分接近，分别为 513553 aa 和 56.0060.54 kD(表 1)。ApNRAMPs 蛋白均有 1012 个跨膜结构域，所有成员的亚细胞定位均为细胞膜(表 1)，表明穿心莲 NRAMP 基因家族成员可能均参与植物体内重金属的跨膜转运9。2.2 穿心莲 NRAMP 基因家族成员进化分析 将 7 个 ApNRAMPs 编码的蛋白序列与模式物种拟南芥中 6 个 AtNRAMPs 和水稻中 7 个 OsNRAMPs编码的蛋白序列进行多序列比对，采用邻接法构建系统进化树。穿心莲、拟南芥和水稻的 NRAMP 基因家族，共计 20 条序列被分为 2 个亚组：Group和 Group(图 1)。其中穿心莲 ApNRAMP1/2/7 属于Group，并包含有拟南芥 AtNRAMP1/6 和水稻OsNRAMP1/3/4/5/6；而穿心莲 ApNARMP3/4/5/6 和拟南芥、水稻中的其余NRAMP成员聚类于Group。此外，从进化树来看，ApNRAMP1 和 ApNRAMP2聚为一支，ApNRAMP5 和 ApNRAMP6 聚为一支，展现出较短的进化距离。表 1 ApNRAMPs 基因家族成员编码蛋白的理化性质 Table 1 The physical and chemical properties of the proteins encoded by ApNRAMPs family members 基因 蛋白质 氨基酸长度/aa 分子量/kD 理论等电点 不稳定系数 平均 亲水性 脂溶 指数 亚细胞定位 跨膜 结构域 ApNRAMP1 XP_051123994.1 529 56.71 8.60 30.81 0.649 120.91 细胞膜 12 ApNRAMP2 XP_051139237.1 522 56.42 8.27 35.62 0.644 119.96 细胞膜 11 ApNRAMP3 XP_051139599.1 541 58.60 6.56 42.53 0.558 113.60 细胞膜 11 ApNRAMP4 XP_051140625.1 513 56.00 5.32 34.80 0.645 124.13 细胞膜 11 ApNRAMP5 XP_051150037.1 538 58.56 5.37 40.92 0.504 117.47 细胞膜 10 ApNRAMP6 XP_051151057.1 553 60.54 5.23 39.00 0.414 116.44 细胞膜 11 ApNRAMP7 XP_051152631.1 540 58.70 8.24 40.17 0.563 121.61 细胞膜 12 第 52 卷 178 图 1 穿心莲、拟南芥和水稻 NRAMP 基因家族成员系统进化树 Fig.1 Phylogenetic tree of NRAMP gene family members among Andrographis paniculata,Arabidopsis and Oryza sativa 注：为拟南芥；为穿心莲；为水稻 2.3 穿心莲 NRAMP 基因结构分析 通过分析穿心莲 ApNRAMPs 基因的保守结构域，发现该基因家族的所有成员均含有完整的Nramp 结构域，具有极强的保守性。在穿心莲的 7个 ApNRAMPs 基因中，ApNRAMP3ApNRAMP6 均含有 3 个内含子，而 ApNRAMP1、ApNRAMP2、ApNRAMP7 则含有 12 个内含子(图 2)。2.4 穿心莲 NRAMP 基因家族编码蛋白的保守基序分析 为进一步分析穿心莲 NRAMP 基因家族成员在编码蛋白水平的差异，本研究采用 MEME 在线分析工具对 7 个 ApNRAMPs 基因编码蛋白的保守基序进行分析，共获得 16 个 Motif(图 3)。不同 ApNRAMPs基因的基序数量相近，1214 个不等。所有穿心莲 图 2 ApNRAMPs 基因的内含子和外显子结构 Fig.2 Gene structure of ApNRAMPs 第 3 期 范潘慧等：基于全基因组的穿心莲 NRAMP 基因家族鉴定与生物信息学分析 179NRAMP 家族成员蛋白质序列均包含 Motif 18 和Motif 13。ApNRAMP1、ApNRAMP2、ApNRAMP7均含有 Motif 12 和 Motif 13，而 ApNRAMP4、ApNRAMP5、ApNRAMP6 含有 Motif 11，这与系统进化树中，ApNRAMP1/2/7 属于 Group，而ApNRAMP4/5/6 属于 Group一致。2.5 穿心莲 NRAMPs 蛋白结构预测 在 ApNRAMPs 蛋白的二级结构中，-螺旋及无规则卷曲占比最大，分别占比 49.17%60.23%和25.93%31.80%，延伸链和-折叠的氨基酸数目最少，分别占比 10.53%15.71%和 2.71%4.07%(表 2)。使用 SWISS-MODEL 在线模拟 ApNRAMPs蛋白的三级结构，并使用 Pymol 对预测得到的 ApNRAMPs 蛋白的三级结构进行优化。结果显示，ApNRAMPs 蛋白的三级结构极为相似，并主要由-螺旋所构成(图 4)。表2 穿心莲NRAMP家族蛋白质二级结构主要构件占比 Table 2 The percentage of secondary structure of NRAMP family proteins in Andrographis paniculata 蛋白质-螺旋/%-折叠/%无规则卷曲/%延伸链/%ApNRAMP153.50 2.84 30.62 13.04 ApNRAMP251.34 3.07 31.80 13.79 ApNRAMP349.17 4.07 31.05 15.71 ApNRAMP460.23 3.31 25.93 10.53 ApNRAMP556.51 2.97 29.00 11.52 ApNRAMP655.33 2.71 30.74 11.21 ApNRAMP752.78 2.78 30.37 14.07 图 3 ApNRAMPs 蛋白保守基序分析 第 52 卷 180Fig.3 Conservative motifs of ApNRAMPs proteins 图 4 ApNRAMPs 蛋白三级结构预测 Fig.4 The 3D structures analysis of ApNRAMPs proteins 注：蓝色为-螺旋，紫色为-折叠。3 结论与讨论 作为中医药的发源地，中国是中药资源大国，但中医药的发展受到中药安全问题的困扰，其中重金属污染问题尤为严重29。作为南药大品种之一的穿心莲，由于其抗炎、抗菌等明确的疗效，近年来市场需求递增13。为了降低重金属污染，提高穿心莲品质，了解重金属在穿心莲体内的吸收和转运机制十分重要。NRAMP 是一类分布极为广泛的膜转运蛋白质家族，在进化过程中极度保守，并在重金属的吸收和转运中发挥关键性作用30。通过对穿心莲 ApNRAMPs 进行深入分析，可以较为全面地了解该基因家族成员的特征，阐明其功能，为阻断穿心莲对有害重金属的吸收和转运提供思路，对推动其无公害种植具有重要的现实意义。在模式植物中，NRAMP 基因家族参与重金属吸收、转运的功能已有较为深入的研究，为药用植物响应重金属胁迫的机制研究提供了很好的借鉴。水稻的 OsNRAMP1 定位于细胞膜上，被认为参与水稻根系对 Cd 的吸收5；OsNRAMP5 则对根系吸收 Cd和 Pb 发挥重要作用2,31。拟南芥 AtNRAMP3 定位于液泡膜上，参与液泡中 Cd 的外排32；AtNRAMP6 参与胞内 Cd 的转运3。在药用植物中，参与重金属胁迫响应的基因研究才刚刚起步，甘草 Glycyrrhiza uralensis 和黄连的 NRAMP 基因家族已被鉴定挖掘1112,33。黄连在受到 Cd 胁迫时，定位于液泡膜上的CcNRAMP3基因在须根中首先大量表达而后逐渐下降，这与植物中金属吸收转运的规律一致，推测其可能与 Cd 转运相关11。本研究从穿心莲基因组中共鉴定到 7 个NRAMP 基因，命名为 ApNRAMP1ApNRAMP7，对其蛋白理化性质进行分析，发现该家族成员的氨基酸序列长度相近，均定位于细胞膜上，含有 1012 个跨膜结构域。植物 NRAMP 蛋白的跨膜结构域不仅将其锚定到生物膜上，还发挥了维持生物学功能的作用34。系统进化树显示，NRAMP 基因家族可分为 2 个亚家族(图 1)，穿心莲和水稻、拟南芥等植物的 NRAMP 基因家族具一致的进化方向。此外，ApNRAMPs 家族成员的基因结构显示，在系统进化树被分为两个不同亚家族的成员在保守基序和基因第 3 期 范潘慧等：基于全基因组的穿心莲 NRAMP 基因家族鉴定与生物信息学分析 181结构上也存在显著差异，这与拟南芥、水稻和大豆中的 NRAMP 基因结构相近6，暗示植物的 NRAMP基因家族可以较为明显的分为两个类群以及该家族基因结构的保守性。ApNRAMPs 蛋白的二级结构主要由-螺旋和无规则卷曲构成，所有成员的三级结构高度相似。上述结果有助于更加深入地了解穿心莲 ApNRAMPs 的结构和功能，为后续抗性品种筛选奠定基础。未来可通过转基因等生物技术手段获得低 Cd 吸收的穿心莲新品种，实现穿心莲的无公害种植13,29。参考文献 1 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