连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定.pdf

药学与临床研究药学PharmaceuticalandClinicalResearch研究连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定陆杰霖,郭曼曼,殷文娟,钱叶飞,汪怡1*1昆山市中医医院，昆山2 45347；2 苏州市药品检验检测研究中心，苏州2 1510 4摘要目的：采用指纹图谱结合多成分含量测定，提升院内制剂连贯抗病毒颗粒质量标准。方法：采用HPLC-UV法，色谱柱为YMC-Pack ProCis（2 50 mm4.6 mm,5m)色谱柱，流动相为乙睛-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0 mLmin,检测波长为2 8 0 nm，柱温35,进样量为10L；建立10 批次连贯抗病毒颗粒指纹图谱；同时测定了连翘酯苷A、连翘苷和咖啡酸的含量。结果：指纹图谱中，共标定了13个共有峰，指认了其中4个色谱峰，并测定连翘酯苷A、连翘苷及咖啡酸的含量分别为13.2 2 18.0 5、2.432 3.540.0.2 7 11 0.342 8 mg*g。结论：本文通过指纹图谱定性、含量定量方式，多维度提升院内制剂连贯抗病毒颗粒的质量控制水平。关键词连贯抗病毒颗粒;HPLC指纹图谱；质量控制中图分类号R927.2文献标志码A文章编号号16 7 3-7 8 0 6(2 0 2 3)0 4-317-0 4流行性感冒是流感病毒引起的一种急性呼吸道感染，在中医学被称为“时行感冒”，属疫类（即传染病)。医院制剂连贯抗病毒颗粒由连翘、贯众、香需及青蒿组成，具有疏表达邪、清热解毒之功效，治疗病毒性感冒、支气管炎、肺炎及病毒感染性疾病。连翘药理结果表明，其具有抗甲型流感病毒作用,也有很好的抗呼吸道合胞病毒的作用 2-4;绵马贯众能降低感染FM1株流感病毒的小鼠肺指数，降低病毒引起的肺损伤，香需及青蒿也有相似的抗流感病毒活性,能减轻小鼠肺部的病变 6,7 。目前，该制剂的质量标准仅检测酸碱度、密度等，无法适应现代中药制剂对质量控制的要求。本文采用HPLC法建立连贯抗病毒颗粒的指纹图谱，同时测定了制剂中咖啡酸、连翘酯苷A及连翘苷的含量，提升院内制剂质量控制水平。1仪器与试药e2695型色谱系统（美国沃特世公司）；BT25S型分析天平（德国赛多利斯公司）;KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。咖啡酸（MUST-22062118)、芦丁（MUST-22022507）、连翘酯苷A（M U ST-2 2 0 3310 5）、连翘苷（M U ST-2 2 0 42 111）对照品均购于成都曼斯特生物*基金项目昆山市中医医院青年科学基金项目（2 0 2 0 QNJ12)作者简介陆杰霖，女，主管中药师E-mail:*通信作者汪怡，女，副主任中药师E-mail:收稿日期2023-04-06修回日期2 0 2 3-0 7-17科技有限公司，纯度均98%。10 批次连贯抗病毒颗粒均由昆山市中医医院制剂室提供，样品编号（批号）分别为LG1（2 0 2 1112 0）、LG 2(2 0 2 1112 5）、LG3(20220106)、LG 4(2 0 2 2 0 12 0)、LG 5(2 0 2 2 0 30 4)LG6(20220501)、LG 7(2 0 2 2 0 50 8)、LG 8(2 0 2 2 0 7 0 7)、LG9(20220725）、LG 10(2 0 2 2 0 8 0 1）。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。2方法与结果2.1试液与条件供试品溶液：取装量差异下的本品，研细，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加稀乙醇25mL，称重，超声处理（功率6 0 0 W，频率40 kHz）30min,冷却至室温，再用稀乙醇补足失量,摇匀，高速离心，取上清液，过0.45m有机滤膜，取续滤液。对照品溶液：分别取连翘酯苷A、连翘苷、芦丁、咖啡酸对照品适量，精密称定，加稀乙醇配制成浓度分别为4938.13、338 6.8 8、133.40 和6 48.8 3gmL-1的对照品储备液。色谱条件:YMC-Pack Pro Cis(250mm4.6mm,5m)色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.2%甲酸水，性线梯度洗脱（A:B）：0 mi n(10:90)15mi n(10:90)60min(16:84)90 min(28:72)110 min(70:30)；柱温35;检测波长2 8 0 nm。2.2#指纹图谱方法学考察2.2.1进样精密度试验取编号LG8样品供试品溶液，连续进样6 次，以连翘酯苷A为参照峰，记录3172023Aug;31(4)连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定并计算得各共有峰相对保留时间RSD0.77%(（n=6),相对峰面积RSD4.98%（n=6),表明仪器精密度良好。2.2.2重复性试验取编号LG8样品供试品溶液共6 份，进样测定，以连翘酯苷A为参照峰，记录并计算得各共有峰相对保留时间RSD0.97%（n=6），相对峰面积RSD4.77%（n=6），表明该方法重复性良好。2.2.3稳定性试验取编号LC8样品供试品溶液，于0、4、8、12、16、2 0 h,进样测定，以连翘酯苷A为参照峰，记录并计算得各共有峰相对保留时间RSD0.73%（n=6)，相对峰面积RSD0.92,说明10 批连贯抗病毒颗粒指纹图谱有较好的相似性，生产稳定性较好。2.3.3共有峰的标定与归属对10 批样品图谱进行分析，其中连翘酯苷A紫外响应明显，色谱保留时间适中，且为处方中主要活性成分，故以其为参照峰(s),10批次连贯抗病毒颗粒的13个共有峰的保留时间及相对峰面积见表1。共标定了13个共有峰，通过相对保留时间和紫外光谱与对照品一致的318比较，指认出4号峰为咖啡酸、6 号峰为芦丁、8 号峰为连翘酯苷A，13号峰为连翘苷，见图2。表110 批次连贯抗病毒颗粒各峰保留时间及相对峰面积（n=10）峰号保留时间（s）17.15 0.14212.00 0.17313.02 0.35417.89 0.34550.46 0.58654.65 0.54759.44 0.48861.21 0.44963.31 0.501065.63 0.311170.94 0.241276.75 0.201386.01 0.098RS10S9S8S7S6S5S4S3S2S1使用中药色相对峰面积0.0365 0.00310.0264 0.00220.0230 0.00780.1275 0.198 00.606 2 0.01670.0610 0.00470.3344 0.02121.0000 0.00000.0301 0.00700.0944 0.05520.03200.00500.0418 0.01160.1053 0.01591310623010203040506070 80 90100110t/min图2连贯抗病毒颗粒指纹图谱共有模式图4.咖啡酸；6.芦丁；8.连翘酯苷A；13.连翘苷分别取连翘、香、贯众、青蒿单味药，按照处方工艺制备单味药对照品。按“2.1 项下方法制备单味药对照品溶液，按“2.1 项下条件进行测定，记录色谱图，见图3。将单味药对照品与样品图谱进行比对1、4、5、6、7、8、9、10、13号峰来自于连翘；12 号峰为连翘、贯众和香的共有峰；3号峰来自于香；2 号峰和11号峰为香和青蒿的共有峰。2.4连贯抗病毒颗粒中3种成分含量测定2.4.1系统适用性试验精密吸取“2.1 项下制备的咖啡酸储备液1mL、连翘酯苷A储备液7 mL、连翘苷储备液2 mL，置2 5mL容量瓶中，用稀乙醇定容，得混合对照品溶液；取编号LG8的连贯抗病毒颗粒供试品溶液；精密吸取混合对照品稀释液与供试品溶液各10 L，按“2.1 项下色谱条件分别进样，得到混合对照品HPLC图及连贯抗病毒颗粒HPLC图，见图4。结果显示，咖啡酸、连翘酯苷A及连翘苷之间分离度良好，理论塔板数均大于50 0 0，分离度均大于1.5。11药学与临床研究药学Pharmaceutical and Clinical Research研究积并按标准曲线法计算样品含量。结果供试品中咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷平均含量分别为0.32 38、16.4115、2.950 8 m g g(n=6),R SD 分别为1.40%、1.54%、1.8 3%（n=6），表明该方法重复性良好。1096T015图3连贯抗病毒颗粒色谱峰归属图451234015图4混合对照品溶液(A）和连贯抗病毒颗粒（B)HPLC图2.4.2线性关系精密吸取“2.1 项下的咖啡酸储备液1mL、连翘酯苷A储备液7 mL、连翘苷储备液2mL,定容至10 mL,配制成储备液，以稀乙醇稀释配制成不同质量浓度的系列混合对照品溶液，（咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷质量浓度分别为5.19 64.88 g mL-l,276.54 3 456.69.54.19 677.38 gmL-)。进样测定,记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度为横坐标(X)进行线性回归，得到标准曲线，咖啡酸回归方程Y=3.30X104-1.10103(r=0.9996)，连翘酯A回归方程Y=9.94X103+1.04105（r=0.9995），连翘昔回归方程Y=6.50X10+7.31103(r=0.9996）,均与峰面积线性关系良好。2.4.3进样精密度试验取线性曲线中间点的对照品溶液适量，按“2.1”项下条件，连续进样6 次，测得各成分的峰面积，结果咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷峰面积RSD分别为1.56%、1.51%、2.0 4%，表明仪器进样精密度良好。2.4.4稳定性试验1取编号LG8连贯抗病毒颗粒供试品溶液，按“2.1 项下条件分别于0、4、8、12、16、2 0 h 进样测定，记录峰面积，结果咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷峰面积RSD分别为0.6 1%，1.53%，2.26%，表明供试品溶液中咖啡酸、连翘酯苷A及连翘苷在2 0 h内稳定。2.4.5重复性试验取编号LG8连贯抗病毒颗粒供试品溶液，按“2.1 项下条件进样测定，记录峰面1311130453045连贯制剂连翘贯众香青嵩60751310136960752.4.6加样回收率试验取编号LG8连贯抗病毒颗粒6 份，每份2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各份分别加入咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷对照品储备液1.2 5、8.50、2.2 5mL，再用稀乙醇补足至2 5mL，按“2.1 项下条件进样测定，记录峰面积并按“2.5.2”90105AB1190项下咖啡酸、连翘酯苷A及连翘苷的对应标准曲线计算含量及回收率，结果连翘酯苷A、连翘苷、咖啡酸的平均回收率分别为97.55%、98.98%、97.37%、RSD分别为2.38%、3.2 7%、1.92%，表明该方法的回收率良好，结果见表2。表2回收率试验结果（n=6）样品成分加人量测得量平均回RSD成分含量（mg)(mg)41.063 241.9741 84.651641.137 141.9741 81.241610541.081341.974181.4892连翘酯昔A41.032041.974182.082741.158441.974 181.282741.174841.9741 81.56847.3832 7.620515.10027.39657.620514.87677.38647.620514.8198连翘昔7.37767.620 515.03497.40037.620514.74647.403 37.620515.026 20.81020.81101.58000.81160.81100.81050.8110咖啡酸0.80960.81100.81210.81100.81240.81102.4.7样品含量测定取10 个批次连贯抗病毒颗粒各2.5g，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积，通过回归方程计算含量。结果10 批次连贯抗病毒颗粒中咖啡酸含量为0.2 7 11 0.342 8 mg?g，连翘酯苷A的含量为13.2 2 18.0 5mg?g，连翘昔的含量为2.432 3.540 mg:g。3 结 论3.1色谱方法考察本实验在建立连贯抗病毒颗粒HPLC指纹图谱的过程中,考察了乙腈、甲醇及不同种类、浓度的酸319(mg)1.62251.62521.59441.59501.5871收率（%）(%）103.8595.5596.272.3897.8095.5996.23101.2798.1697.543.27100.4896.40100.0394.9299.98100.461.9296.7796.5595.522023Aug;31(4)连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定对样品的分离效果影响，发现乙腈-0.2%甲酸水作为流动相时，基线平稳，各个峰之间分离效果最好，杂峰少，故选用乙腈-0.2%甲酸水作为最优指纹图谱流动相条件。连贯抗病毒颗粒全波长扫描时，在280nm波长下，综合色谱峰的响应值明显，峰型较好，峰信息全面，能够很好展现全方的化学成分特征,最终选择2 8 0 nm波长作为检测波长。3.2结果分析对10 批次连贯抗病毒颗粒进行指纹图谱的聚类分析及主成分分析发现，基本聚为一类，表明10批次的连贯抗病毒颗粒制剂的质量具有良好的一致性。连翘作为方中君药，连翘酯苷A及连翘苷为其主要成分，连翘酯苷A可抑制TLR4/NF-kBp65/NL-RP3信号通路改善宫内感染致新生大鼠肺损伤8,也能抑制哮喘小鼠的气道炎症反应9，连翘苷流感病毒株、人呼吸道合胞病毒、人肠道病毒7 1型、人腺病毒3型及人单纯疱疹病毒均具有一定的抑制作用,且能明显减轻间质性肺炎的肺部病变。因此，本文建立的以连翘酯苷A、连翘苷和咖啡酸为指标成分的连贯抗病毒颗粒的指纹图谱具有代表性。连贯抗病毒颗粒来源于我院的名医经方，在抗病毒性感冒、肺炎等病毒性感染方面,具有一定的疗效。但我院自制制剂质量标准相对简单,因此，本文采用HPLC建立了连贯抗病毒颗粒的指纹图谱，提高自制制剂的质量标准，全面反映连贯抗病毒颗粒质量的整体面貌，也为临床使用提供稳定的产品。参考文献1】齐有胜，孙毅坤，刘为萍。单味中药抗流感病毒研究进展 .中国实验方剂学杂志，2 0 17，2 3(14)：2 10-18.2 田文静，李洪源，姚振江，等.连翘抑制呼吸道合胞病毒作用的实验研究 .哈尔滨医科大学学报，2 0 0 4，38(5):421-3.3 王泽凤温病学古方中以连翘为核心的药对极其配伍规律探讨 J山西中医，2 0 2 0，36(1)：45-6.4段林建，张清，王农荣，等连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响研究 中西医结合研究，2 0 12,15(6):2082-84.5孙科峰，于艳，李丽静，等，绵马贯众水和乙醇提取物抗病毒的实验研究 中国中西医结合儿科学，2 0 10,2(4):319-21.6】徐军烈，蒋维尔.石香需水提物抗流感病毒作用研究 浙江中医杂志，2 0 13，48(4)：2 7 3-4.7王旭，何林青蒿素类化合物对疾外其他疾病药效作用研究进展 J中国新药杂志，2 0 18，2 7(19)：2 2 58-63.8 1王云，赵亚丽，郎明瑶，等连翘酯苷A通过TLR4/NF-kBp65/NLRP3轴对宫内感染致新生大鼠肺损伤及免疫功能的影响研究 .重庆医学，2 0 2 2，51(17)：2 8 91-900.9】林星，李俊峰，车楠，等，连翘酯苷A通过p38MAPK/NF-kB信号抑制哮喘气道炎症 J.中国免疫学杂志,2 0 19,35:2 9 7 1-9.10 郭健敏，富力，秦丽莉，等连翘苷体内外抗病毒及解热作用机制 J中国药理学通报，2 0 2 2，38(8)：117 0-5.Quality Control of Lianguan Antiviral Granules by HPLC Fingerprints andMulti-index DeterminationLU Jielin,CUO Manman,YIN Wenjuan,QIAN Yefei?,WANG YiKunshan Hospital of Chinese Medicine,Kunshan 245347,China,2Suzhou Municipal Institute for DrugControl,Suzhou 215104,ChinaABSTRACT Objective:To establish quality control methods for Lianguan Antiviral granules by HPLCfingerprints and multicomponent determination.Methods:The analysis was developed on a YMC-Pack ProCis(250mm4.6mm,5 m)column with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.2%formic acid inwater at 1.0mLmin in a gradient elution and the UV detection at 280nm.The injection volume was 10 L.The fingerprints were constructed with 1o batches of Lianguan Antiviral granules.In addition,the contentsof caffeic acid,forsythoside A and forsythin in Lianguan Antiviral granules were also determined.Results:A total of 13 common peaks were picked in the HPLC fingerprints with 4 peaks identified;and thecontents of caffeic acid,forsythoside A and forsythin were in the ranges of 0.2711-0.3428,13.22-18.05and 2.432-3.540 mgg,respectively.Conclusion:The HPLC fingerprints and the contents determinationstudy of Lianguan Antiviral granules will provide a scientific basis for its quality control.KEY WORDS Lianguan Antiviral granule;HPLC fingerprints;Quality control320