六妹羊肚菌分生孢子室内产生条件.pdf

13 食用菌学报 2023.30（4）：2023.04.六妹羊肚菌分生孢子室内产生条件赵 坤，刘 玥，梁 珍，李林辉*（西华师范大学生命科学学院“西南野生动植物资源保护”教育部重点实验室，四川 南充637002）摘 要：羊肚菌（Morchella spp.）成功实现大田栽培后，其栽培过程中产生大量分生孢子而形成菌霜。纯培养条件下羊肚菌分生孢子的产生及萌发成为研究重点。为实现羊肚菌分生孢子的室内获取，通过模拟六妹羊肚菌（M.sextelata）室外栽培条件，从培养容器、培养基组分、覆盖物种类、覆盖厚度及覆盖时间这5个方面研究六妹羊肚菌分生孢子产生的室内条件。结果显示：用六棱形玻璃罐头瓶（底径7.6 cm，口径6.6 cm，高9.8 cm，容积280 mL）为容器，以体积比11的土壤（含水量20%）和PDA为培养基，接种六妹羊肚菌菌丝块20 d后，在菌落表面覆盖厚度为1.5 cm的无菌湿润河沙，可在室内获得分生孢子，每平方厘米分生孢子产量为(2.370.63)106个。关键词：羊肚菌；分生孢子；室内；菌丝；培养基Indoor Conidium Production Conditions of Morchella sextelata ZHAO Kun,LIU Yue,LIANG Zhen,LI Linhui*Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation(Ministry of Education),College of Life Sciencs,China West Normal University,Nanchong 637002,Sichuan,ChinaAbstract:During cultivation of Morchella spp.in the field,a large number of conidia were produced in the cultivation process to form conidium frost.The production and germination of conidia under axenic culture conditions became the research focus.To achieve indoor production of Morchella conidia,the indoor conditions simulating the temperature and soil conditions of M.sextelata cultivation in the field were studied,including culture container,medium composition,mulch type,mulch thickness and mulch time.The results showed that condia were obtained indoors by using hexagonal glass cans(diameter 7.6 cm,caliber 6.6 cm,height 9.8 cm,volume 280 mL)filled with soil+PDA at a volumetric ratio of 1:1(water content 20%).Twenty days after inoculation of M.sextelata mycelium blocks into the above mentioned glass cans,the medium surface was covered with 1.5 cm thick aseptic moist river sand to allow conidium production,and the yield was (2.370.63)106 per square centimeter.Key words:Morchella spp.;conidium;indoor;hypha;culture medium羊肚菌（Morchella spp.）属于子囊菌1，具有极高的食药用价值2-5，但野生羊肚菌资源有限，羊肚菌市场需求缺口巨大6-7。自1982年OWER等8首次报道室内成功栽培羊肚菌以来，各国科学家对羊肚菌的人工栽培进行了大量研究9-13。在21世纪，研究人员在羊肚菌人工栽培技术上不断更新收稿日期：2023-03-21原稿；2023-04-23修改稿基金项目：武胜县2021年大中型水库移民后期扶持项目“礼安镇羊肚菌高效栽培技术”作者简介：赵 坤(1996)，男，在读硕士，研究方向为微生物学。*本文通信作者 E-mail:1320002 14 第 30 卷食 用 菌 学 报突破14-16，人工栽培羊肚菌的产量逐年上升。随着羊肚菌产业不断扩大，栽培范围越来越广，栽培面积逐年增加17。2021年，我国羊肚菌栽培面积达到16 466.7 hm218。虽然羊肚菌已进入规模化栽培时代，但其大规模栽培技术仍不成熟，产量极不稳定19。研究发现，成功的羊肚菌栽培必然伴随着分生孢子的产生。在栽培过程中，如果没有产生分生孢子，则一定不会有子实体形成；有分生孢子产生的栽培地也不一定有子实体形成20-22。羊肚菌分生孢子在其生长发育过程中的作用机制尚不清楚，因而，获得羊肚菌分生孢子并对其进行深入研究具有重要意义。然而，羊肚菌分生孢子的产生条件极为苛刻，只有在气温较低的冬季，在土壤中栽培羊肚菌后，才可能产生分生孢子。目前，还未见室内获得羊肚菌分生孢子的相关报道。笔者首次研究在实验室获得大量羊肚菌分生孢子的方法，以期为探索分生孢子在羊肚菌发育中的作用机制提供帮助。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌株六妹羊肚菌（M.sextelata）由“西南野生动植物资源保护”教育部重点实验室真菌资源研究室保存。1.1.2 培养基PDA（potato dextrose agar）培养基（200 g土豆、20 g葡萄糖、18 g琼脂、1 000 mL水，pH自然）；1/5PDA培养基（40 g土豆、4 g葡萄糖、18 g琼脂、1 000 mL水，pH自然）；1/10PDA培养基（20 g土豆、2 g葡萄糖、18 g琼脂、1 000 mL水，pH自然）；1/20PDA培养基（10 g土豆、1 g葡萄糖、18 g琼脂、1 000 mL水，pH自然）；WA（water agar）培养基（18 g琼脂、1 000 mL水）；土壤（在西华师范大学校内实验地挖取距表层020 cm的土壤，过孔径10 mm筛，调整含水量为20%）。1.1.3 培养容器六棱形玻璃罐头瓶（底径7.6 cm，口径6.6 cm，高9.8 cm，容积280 mL）；玻璃三角瓶（容积500 mL）；聚丙烯（polypropylene,PP）材质塑料瓶（底径12.5 cm，口径17.2 cm，高13.5 cm，容积2 000 mL）。1.1.4 覆盖物细土（在西华师范大学校内实验地挖取距表层约5 cm处的土壤，去除植物残体，自然风干后过筛，颗粒直径为12 mm）；河沙（去除植物残体后用水清洗，自然风干，使用前按实验需要混合，喷水使其含水量在25%左右，121 灭菌20 min，保持封口滤纸湿润）。1.2 方法1.2.1 菌株活化将菌株接种在PDA平板上，25 培养5 d。1.2.2 培养容器对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响分别在3种培养容器内加入PDA培养基，厚度约1.5 cm，以单层无菌中速滤纸封口，121 灭菌20 min，冷却后，在培养基中心接种直径为8 mm的菌丝块，然后置于20 避光培养。待菌丝变黄后，覆盖厚度为1.5 cm的河沙。随后模拟冬季羊肚菌播种后气温变化，设置日循环温度诱导分生孢子产生：8时到10时10、10时到12时12、12时到14时16、14时到16时12、16到18时10、18时到次日8时6。变温培养16 d后，统计分生孢子产量。每个处理重复3次。分生孢子统计方法：在超净工作台上用直径1 cm的打孔器在有分生孢子产生的培养基表面随机取样3次。将样品放入无菌水中，充分摇晃，然后用脱脂棉过滤柱（直径1.5 cm，高8.3 cm）过滤(填充过滤棉，确保菌丝体不能通过)并洗脱，得到的孢子悬液梯度稀释后用血球计数板进行计数。每个 15 赵 坤，等：六妹羊肚菌分生孢子室内产生条件第 4 期处理的3个重复分别计数。分生孢子产量为每平方厘米培养基上的分生孢子数量，以平均值标准差表示。选择产生分生孢子数量最多的容器进行后续实验。1.2.3 培养基组分对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响取5 个容器（六棱形玻璃罐头瓶），装入100 g土壤，然后分别注入PDA、1/5PDA、1/10PDA、1/20PDA和WA培养基，至稍低于土壤表面12 mm处，另取2个容器分别加入100 g含水量为20%的土壤和等体积PDA培养基。以单层无菌中速滤纸封口，121 灭菌20 min，冷却后，在培养基中心接种直径为8 mm的菌丝块，置于20 避光培养。待菌丝变黄后，覆盖厚度为1.5 cm的河沙，按1.2.2所述方法变温培养，诱导分生孢子产生，统计分生孢子产量。每个处理重复3次。1.2.4 覆盖物种类对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响在容器（六棱形玻璃罐头瓶）中加入100 g土壤，然后注入PDA培养基至稍低于土壤表面12 mm处。以单层无菌中速滤纸封口，121 灭菌20 min，冷却后，在培养基中心接种直径为8 mm的菌丝块，置于20 避光培养。待菌丝变黄后，分别覆盖厚度为1.5 cm的细土，体积比为21的细土和河沙，体积比为11的细土和河沙，体积比为12的细土和河沙，河沙。按1.2.2所述方法变温培养，诱导分生孢子产生，统计分生孢子产量。每个处理重复3次。1.2.5 覆盖厚度对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响按1.2.4所述方法制作培养基并接种培养。待菌丝变黄后，分别覆盖厚度为0.5、1.0、1.5、2.0 cm的河沙，以不覆盖河沙的处理为对照。按1.2.2所述方法变温培养，诱导分生孢子产生，统计分生孢子产量。每个处理重复3次。1.2.6 覆盖时间对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响按1.2.4所述方法制作培养基并接种培养。在培养11、14、17、20、23 d时，覆盖厚度为1.5 cm的河沙，按1.2.2所述方法变温培养，诱导分生孢子产生，变温培养16 d后统计分生孢子产量。每个处理重复3次。2 结果与分析2.1 培养容器对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响在接种后的第2 天，各容器内菌丝均开始萌发，68 d后菌丝长满整个培养基表面。覆盖河沙时，PP材质塑料瓶内的菌丝已贴壁向上生长810 cm，而玻璃三角瓶与六棱形玻璃罐头瓶内的菌丝贴壁向上生长不到2 cm。变温培养16 d后的分生孢子产量：六棱形玻璃罐头瓶玻璃三角瓶PP材质塑料瓶（图1）。每平方厘米培养基上分生孢子产量：六棱形玻璃罐头瓶中(1.960.37)106个；玻璃三角瓶中(3.370.52)102个；PP材质塑料瓶中(0.320.11)102个。注：A.六棱形玻璃罐头瓶；B.玻璃三角瓶；C.PP材质塑料瓶。Notes:A.hexagonal glass can;B.conical flask;C.polypropylene bottle.图1 培养容器对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响Fig.1 Effect of culture container on conidium yield of M.sextelata 16 第 30 卷食 用 菌 学 报2.2 培养基组分对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响在菌丝培养期间，不同培养基上生长的菌丝长势具有差异，在土壤培养基上无明显菌丝生长，在WA培养基上菌丝较稀疏，在土壤加不同比例PDA的混合培养基上菌丝生长较浓密。在土壤培养基上无分生孢子产生，在土壤加WA、土壤加1/20PDA、土壤加1/10PDA、土壤加1/5PDA、土壤加PDA以及PDA培养基上，每平方厘米分生孢子产量分别为(2.690.43)102、(7.301.09)103、(9.840.81)104、(8.541.27)105、(2.120.74)106、(6.671.01)105个（图2）。注：A.土壤；B.土壤加WA；C.土壤加1/20PDA；D.土壤加1/10PDA；E.土壤加1/5PDA；F.土壤加PDA；G.PDA培养基。Notes:A.soil;B.soil+water agar;C.soil+1/20PDA;D.soil+1/10PDA;E.soil+1/5PDA;F.soil+PDA;G.PDA.图2 培养基组分对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响Fig.2 Effect of medium component on conidium yield of M.sextelata2.3 覆盖物种类对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响覆盖河沙及体积比为12的细土和河沙的处理，覆盖3 d后，便有菌丝从覆盖物表面露出；覆盖体积比为21的细土和河沙，体积比为11的细土和河沙的处理，覆盖4 d后，均有菌丝露出覆盖物表面；而覆盖细土的处理，覆盖5 d后才在覆盖物表面观察到菌丝。随着覆盖物中河沙含量的增加，孢子的产量呈现增加的趋势（图3）。覆盖细土，体积比为21的细土和河沙，体积比为11的细土和河沙，体积比为12的细土和河沙，河沙的处理，每平方厘米分生孢子产量分别为(1.060.53)105、(1.440.77)105、(2.560.49)105、(9.041.36)105、(2.120.66)106个。注：A.细土；B.体积比为21的细土和河沙；C.体积比为11的细土和河沙；D.体积比为12的细土和河沙；E.河沙。Notes:A.fine soil;B.2/3 fine soil+1/3 river sand(volumetric ratio);C.1/2 fine soil+1/2 river sand(volumetric ratio);D.1/3 fine soil+2/3 river sand(volumetric ratio);E.river sand.图3 不同覆盖物对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响Fig.3 Effect of mulch type on conidium yield of M.sextelata2.4 覆盖厚度对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响随着覆盖厚度的增加，菌丝露出河沙表面的时间越晚。在覆盖16 d后，覆盖物越厚，其表面的菌丝越少。未覆盖的处理，土壤表面菌丝较多，且未有分生孢子产生。覆盖厚度为0.5、1.0、1.5、2.0 cm的处理，每平方厘米分生孢子产量分别为(7.250.89)102、(9.671.63)105、(2.080.52)106、(2.240.67)106个（图4）。2.5 覆盖时间对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响分别在接种后培养11、14、17、20、23 d时覆盖河沙，变温培养16 d后，每平方厘米分生孢子产量分别为(8.572.33)102、(1.260.47)105、(6.581.08)105、(2.370.63)106、(2.120.76)106个（图5）。17 赵 坤，等：六妹羊肚菌分生孢子室内产生条件第 4 期注：A.未覆盖；B.0.5 cm；C.1.0 cm；D.1.5 cm；E.2 cm。Notes:A.0 cm(without sterile moist river sand covering);B.0.5 cm;C.1.0 cm;D.1.5 cm;E.2 cm.图4 覆盖厚度对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响Fig.4 Effects of sterile moist river sand cover thickness on conidium yield of M.sextelata注：A.11 d；B.14 d；C.17 d；D.20 d；E.23 d。Notes:A.11 d;B.14 d;C.17 d;D.20 d;E.23 d.图5 覆盖时间对六妹羊肚菌分生孢子产量的影响Fig.5 Effect of time to start covering on M.sextelata conidium yield 3 讨论有研究表明，无性孢子可以作为传播媒介或精子，对物种的交配、繁殖和传播非常重要23。也有研究认为，无性孢子的产生是一种接触和定植新环境的生态适应机制24。分生孢子的产生是真菌在遭遇干旱、营养不良、寒冷等恶劣环境时自行启动的自我保护机制,是对种质资源的保存25-28。分生孢子的产生需要冰点以上的温度和较低的湿度，在完全干旱的环境中不会产生分生孢子24。一般来说，分生孢子出现在裸露的土壤、岩石上，对菌丝的物理刺激会诱导分生孢子的产生24。分生孢子反应微生物自身细胞代谢的整体状态，受环境及内源性生物节律的影响29-33。本研究中覆盖物的种类、厚度、时间都是对羊肚菌菌丝不同程度的物理刺激。羊肚菌分生孢子仅出现在栽培过程中34-35。在已有的羊肚菌分生孢子研究中，未见关于室内分生孢子培养容器的研究，而要在室内培养获得大量分生孢子，需要选择合适的培养容器。氧气对菌丝生长和激发分生孢子具有重要作用36-37。玻璃三角瓶中的菌丝生长茂盛，并贴壁向上生长，这可能是因为三角瓶口较小，通气量少，导致瓶内气体交换不充分，菌丝生长的好氧性致使其贴壁生长38-39。PP材质塑料瓶开口向上呈漏斗状，且其表面较玻璃粗糙，易于攀附，开口大，氧气交换充分，因此，PP材质塑料瓶中的菌丝生长旺盛。六棱形玻璃罐头瓶呈柱状，氧气交换较为均一，羊肚菌菌丝都生长在培养基表面，更适合作为培养羊肚菌分生孢子的容器。培养基组分对微生物的生长极为重要40-42。本研究结果表明，以土壤加PDA为培养基，能获得大量的分生孢子。仅以土壤为培养基的处理在整个培养过程中未观察到明显的菌丝生长，最终没有分生孢子产生，推测其原因可能是土壤保水能力太差，培养基中水分丢失太快，营养太少，导致接种块上的菌丝无法正常生长。大量研究表明，营养物质和底物对真菌分生孢子的产生具有极大影响，主要表现在碳氮状态、pH及Ca2+信号传递等方面29-33。与以PDA为培养基的处理相比，以土壤加PDA为培养基的处理分生孢子产量更高，这说明在一定程度上土壤也可以促进羊肚菌分生孢子的 18 第 30 卷食 用 菌 学 报产生15-16。研究表明，胁迫条件是激发分生孢子形成的重要因素43-45，对菌丝的机械损伤有利于诱导分生孢子的产生29,33,46。覆盖物会对羊肚菌菌丝造成损伤，使羊肚菌菌丝的生长环境恶劣47，分生孢子产量随着覆盖物中河沙比例的增大而增加，这或许与羊肚菌分生孢子的产生需要较高的氧气含量与较低的湿度密切相关24,48。河沙疏松透气，有利于氧气的传播，更容易使羊肚菌菌丝分化出更多的分生孢子梗，提供较低的湿度环境，这与分生孢子产生需要的环境相符48。覆盖厚度实验结果表明覆盖物对羊肚菌分生孢子产生的必要性，没有覆盖物的处理无分生孢子产生。在一定范围内，分生孢子产量随着覆盖物厚度的增加而增加。覆盖0.5 cm厚河沙的处理，可能由于覆盖物过薄，使得菌丝完全将其包裹，从而没有对其产生较大的胁迫效应，因而分生孢子产量较少。当覆盖厚度达到1.5 cm时，胁迫效果明显，分生孢子产量提高。适当厚度的覆盖物，不仅可以为下层菌丝的生长分化保持湿润的环境，还可以形成必要的胁迫环境，促进分生孢子的产生，但厚度过大反而不利于分生孢子的产生。笔者在羊肚菌菌丝培养的不同时间点铺加覆盖物，以期找到胁迫效应的最佳时间，结果表明：在菌丝培养2023 d时铺加覆盖物，分生孢子产量较高。过早加入覆盖物，可能此时菌丝过于幼嫩，覆盖物的添加破坏了菌丝的生长，延缓了其生长进程，阻碍羊肚菌菌丝的分化及分生孢子的产生；而培养20 d左右的菌丝逐渐扭结变黄老化，虽然其生长速度会大幅降低，但抗逆性却变得更强，当感知到外界的胁迫环境时，老化的菌丝会更倾向于产生大量分生孢子以保存自身种质资源，使分生孢子产量增高；反之，过长时间的培养，使菌丝扭结形成的菌核开始皱缩，不利于分生孢子的产生49-50。本研究通过多组单因素实验，探索羊肚菌室内产生分生孢子的最佳培养容器、培养基组分、覆盖物种类、覆盖物厚度以及覆盖时间，最终建立起一套室内获得大量羊肚菌分生孢子的可行培养体系：六棱形玻璃罐头瓶（直径7.6 cm，口径6.6 cm，高9.8 cm，容积280 mL）作为培养容器，以土壤和PDA培养基作为培养底物，接种六妹羊肚菌，20 避光培养20 d后，在菌落表面覆盖1.52 cm厚的无菌湿润河沙，模拟冬季室外气温变化进行变温培养，变温培养16 d后便可收获大量分生孢子。参考文献1 MASAPHY S.External 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