蕨类植物叶绿体基因ycf94的分子进化研究.pdf

热带亚热带植物学报 2023,31(4):541 548 Journal of Tropical and Subtropical Botany 收稿日期收稿日期:2023-02-18 接受日期接受日期:2023-03-13 基金项目基金项目:国家自然科学基金项目(31770587)资助 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant No.31770587).作者简介:李子菲(1998 年生)，女，硕士研究生，研究方向为植物系统发育与分子进化。E-mail:*通讯作者 Corresponding author.E-mail:; 蕨类植物叶绿体基因蕨类植物叶绿体基因 ycf94 的分子进化研究的分子进化研究 李子菲1,苏应娟2,3*,王艇1*(1.华南农业大学生命科学学院,广州 510642;2.中山大学生命科学学院,广州 510275;3.中山大学深圳研究院,深圳 518057)摘要：摘要：ycf94 基因是近年来在叶绿体基因组中新发现的一个基因，在蕨类植物中表现高度保守。该研究共选取 94 种蕨类植物，在系统发育背景下，对 ycf94 基因的结构特征、密码子偏好性、进化速率和适应性进化进行分析。结果表明,ycf94 基因的密码子偏好性较弱，偏好使用以 A/U 结尾的密码子，且不同物种间的偏好性存在一定差异。密码子偏好性的形成主要受到突变压的影响，同时也存在其他因素的作用；基于凤尾蕨科和其他蕨类中 ycf94 基因的结构特征存在区别，对两者的分子替换速率进行了比较，表明颠换率、非同义替换率和 值间存在显著差异；仅检测出 1 个正选择位点 74A，强烈的负选择作用表明 ycf94 基因的结构和功能基本趋于稳定。这为蕨类系统发育分析提供了新依据，并提供了解析 ycf94 基因功能的线索。关键词：关键词：蕨类植物；ycf94；密码子偏好性；进化速率；适应性进化 doi:10.11926/jtsb.4780 Molecular Evolution of Chloroplast Gene ycf94 in Ferns LI Zifei1,SU Yingjuan2,3*,WANG Ting1*(1.College of Life Sciences,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.School of Life Sciences,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510275,China;3.Research Institute of Sun Yat-Sen University in Shenzhen,Shenzhen 518057,Guangdong,China)Abstract:As a newly discovered chloroplast gene in recent years,ycf94 gene,with length of about 200 bp,is conserved among ferns.However,the origin and function of ycf94 require further investigation.The study was performed on the ycf94 gene sequence of 94 species of ferns,in the phylogenetic background,analyzing codon usage bias,evolution rate and selection pressure.Results showed that the codon bias was weak in ycf94 gene which the 3rd position of codon prefers A/U,variously in closely species.The codon bias was mainly produced by gene mutation.In addition,based on the differences in the structural characteristics of ycf94 between Pteridaceae and other ferns,their evolution rate was compared,suggesting that there were significant difference in transversion rate,nonsynonymous substitution rate and omega.Besides,only one position selection site 74A was detected.The strong negative selection pressure indicated that the function and structure of ycf94 were mostly stabilized.The results provide a new clue of phylogenetic analysis in ferns and functional studies of ycf94 gene.Key words:Fern;ycf94 gene;Codon usage bias;Evolutionary rate;Adaptive evolution 叶绿体基因组具有长度短、拷贝数高、保守性强的特点，长期被广泛用于植物系统发育和分子进化研究1。叶绿体基因组作为双链环状闭合 DNA,大小一般为 110116 kb，具有典型的四区结构，包含了大单拷贝区(large single copy,LSC)、小单拷贝区(small single copy,SSC)和2 个反向重复区(inverted repeats,IR)。目前普遍认为陆地植物叶绿体基因组的基因组成是大致相似的，大约有 80 个蛋白编码基因(CDS,protein-coding gene)、30 个 tRNA 基因和4 个 rRNA 基因2。其中也包含一些保守的开放阅读542 热带亚热带植物学报 第 31 卷 框(open reading frame,ORF)，其所编码的蛋白相关功能仍在摸索中，通常称为假定叶绿体开放阅读框(hypothetical chloroplast open reading frame)基因(ycf)。蕨类作为最早脱离水体适应陆生环境、进化出维管组织的植物类群，在整个陆地植物的起源和演化历史研究中有着重要的地位3。蕨类植物现存约有 12 000 种，它在形态上具有丰富的多样性，广泛分布在热带和亚热带地区。同时，蕨类的质体基因组有独特的结构，相比于与种子植物的质体基因组结构基本一致的蕨类祖先类型“莲座蕨型”，“铁线蕨型”分别在跨 IR/LSC 区和 LSC 区中发生了约 20 和3 kb的两次重叠倒位，而“铁线蕨型”占据了蕨类90%的种类4。2016 年发表的 PPG I(the pteridophyte phylogeny group)系统是一个基本建立在分子系统发育研究之上的现代蕨类植物分类系统5，其中描述的分类较为全面且被接受。目前，有关蕨类叶绿体基因组和分类系统等各类信息仍在不断完善中。Song 等6于 2018 年在薄囊蕨类中发现 1 个新的假定 ORF，并将其命名为 ycf94。研究表明，ycf94位于 matK 和 rps16 之间，在薄囊蕨类中表现高度保守。同时在蕨类、石松类和苔藓类的质体中都发现其同源性，而种子植物中不存在该序列。在陆地植物中质体的进化历史是动态的，其基因组存在基因丢失的现象，基因会从质体基因组转移到核基因组7。ycf94 或许存在于陆生植物的祖先质体中，随后在种子植物中发生基因丢失。根据 ycf94 序列的保守程度，以及其编码跨膜蛋白和具有多个 RNA 编辑位点的特征6，可以表明ycf94 是一个具有功能意义的蛋白编码基因8，但其起源和功能目前尚不明确。本研究以 94 种蕨类植物的 ycf94 基因为研究对象，通过分析 ycf94 的碱基组成和密码子偏好性，并在系统发育背景下，分析其进化速率和选择压力，来探究 ycf94 的基因结构特征和在蕨类植物中的进化样式，挖掘 ycf94 在叶绿体基因组系统发育关系分析中的可用性，为蕨类植物分类提供新的依据，为进一步研究 ycf94 的起源和功能等提供基础信息。1 材料和方法 1.1 提取序列数据提取序列数据 根据Adiantum shastense的 ycf94 基因序列作为参考序列，用 NCBI-BLAST 在线比对(E value0.08 且 RSCU1的作为最优密码子。1.4 分子进化速率分析分子进化速率分析 采用 HyPhy v2.2.4 软件13基于核苷酸模型HKY85 和密码子模型 MG94HKY85_34 计算各物种分支 ycf94 基因的转换率(transition rate,trst)、颠换率(transversion rate,trsv)、转换率和颠换率的比值(trst/trsv)、非同义替换率(nonsynonymous substi-tution rate,dN)、同义替换率(synonymous substitu-tion rate,dS)，以及非同义替换速率和同义替换速率的比值(=dN/dS)。通过软件 SPSS 24 使用 Mann-Whitney 秩和检验对数据进行相关性分析。1.5 适应性进化分析适应性进化分析 使用 PAML v4.9 软件14中的 codeml 程序检测ycf94 基因中是否存在氨基酸正选择位点。采用检测谱系之间选择压力的 3 种模型：分支模型(Branch model)、位点模型(Site model)和分支-位点模型(Branch-site model)。分支模型中，单比率模型(one-ratio,M0)假定所有分支的 值相同；自由比率模型(free-ratio,F)假定所有分支的 值均不相同；二比率模型(two-ratio,M2)假定前景支与背景支的 值不相同。通过似然比检验进行模型比较，M0 和 F 检验不同分支间 值的差异性，M0 和M2 检验前景支和背景支间 值的差异性。位点模型假定不同位点的 值不同，其中存在4 对比较模型：M0(one-ratio)和 M3(discrete)检测位点间 值是否一致；M1a(neutral)和 M2a(selection),M7(beta)和 M8(beta&)，M8 和 M8a(beta&=1)用于检测是否存在正选择位点。分支-位点模型假定了分支间和位点间 值都存在差异。对模型 Model A 和零假设进行比较，检测前景支中的部分位点是否受到正选择作用。2 结果和分析 2.1 ycf94 的基因特征分析的基因特征分析 取样的 94 种蕨类植物 ycf94 基因长度为 222 156 bp。其中可以大致分为 2 种类型：以起始密码子为T(ACG)开头发生C to U RNA编辑的序列共28条，其中包括全部的凤尾蕨科 27 条，ycf94 大多为 219 bp(共20 条)；起始密码子为M(AUG)的序列共66 条,包含除凤尾蕨科外的 18 科，ycf94 大多为216 bp(共50条)，其中 6 条合囊蕨目的大小均为 177 bp。2.2 94 种蕨类植物的系统发育树种蕨类植物的系统发育树 利用 matK+rbcL 串联基因构建 NJ、ML 和 BI3种系统发育树并对其进行比较，用蕨类分类系统PPGI 进行修正。在ML 和BI 中水龙骨亚目和铁角蕨亚目为姐妹群且都是单系，与 PPGI 系统一致；而 NJ 中水龙骨亚目属于多系。BI 支持铁角蕨科和肠蕨科为姐妹群,ML 支持铁角蕨科位于铁角蕨亚目的基部位置。BI与 PPGI 系统最为接近，所以最后以 BI 为标准。构建出的系统发育树(附录2)主要为后续研究分析提供系统发育背景。2.3 密码子偏好性分析密码子偏好性分析 2.3.1 密码子碱基组成分析 附录 3 为 94 种蕨类 ycf94 基因的密码子碱基组成，其中 GC 含量为 23.73%47.75%，GC1、GC2和 GC3 分别为 19.72%47.22%、23.94%47.22%和20.34%56.94%，说明密码子总体的碱基组成偏向A/U。ENC 值为 6134.89，在近缘物种中 ycf94 基因的密码子偏好性存在差异。其中有 19 条序列的ENC=61 即每个密码子都被均衡使用。ENC 值以 35作为判断密码子偏好性强弱的标准15，大部分的ycf94 密码子偏好性较弱。对ycf94基因的密码子相关参数进行热图统计，大多数的 GC3 要高于 GC1、GC2 和 GC 值；合囊蕨目的 GC 各项数值要低于其他蕨类，凤尾蕨科的GC1 和 GC2 总体上也低于其他蕨类(图 1)。由表 1 可见，GC1、GC2、GC3 和 GC 相互间均为极显著相关，表明 ycf94 基因密码子三位的碱基组成相似；而ENC值与各项GC值相关性不显著，碱基组成对 ycf94 密码子偏好性的影响较小。表 1 ycf94 密码子各参数的相关性分析 Table 1 Correlation analysis between the parameters of ycf94 gene GC1 GC2 GC3 GC ENCGC1 GC2 0.589*GC3 0.585*0.720*GC 0.796*0.889*0.913*ENC 0.047 0.041 0.062 0.089*:P0.05;*:P0.01 544 热带亚热带植物学报 第 31 卷 图 1 ycf94 基因的密码子相关参数热图统计 Fig.1 Heat map of correlation parameter of ycf94 codon 2.3.2 GC3-GC12 分析 由图 2 可见，大部分散点位于对角线之下，除天星蕨(Christensenia aesculifolia)外，大部分物种的ycf94 基因的 GC3 值大于 GC12。相关性分析结果表明，双尾检验 P=0.00(1)26个，高表达密码子(RSCU0.08)24 个，而同时满足这两个条件的最优密码子有 14 个：UUU、GUU、GUA、GUG、UCU、CCC、ACC、GCC、UAU、AAA、GAU、AGG、GGC、GGA。其中 8 个以 A/U 结尾，6 个以 G/C 结尾。2.4 进化速率分析进化速率分析 对凤尾蕨科和其余蕨类的替换速率进行差异显著性分析，数据表明(附录 4)，凤尾蕨科除了同义替换率外的进化速率均值都大于其他蕨类(图 4)，秩 表 2 ycf94 基因的密码子 RSCU 统计以及最优密码子 Table 2 Relative synonymous codon usage of genes and the optimal codons in ycf94 gene 氨基酸 Amino acid 密码子 Codon RSCULowRSCUHigh RSCURSCU 氨基酸 Amino acid 密码子CodonRSCULow RSCUHigh RSCURSCU苯丙氨酸 Phe UUU*0.99 1.52 0.53*1.37*酪氨酸 Tyr UAU*1.18 1.42 0.24*1.10*UUC 1.01 0.48 0.53 0.63 UAC 0.82 0.58 0.24 0.90 亮氨酸 Leu UUA 1.28 1.20 0.08 1.36*组氨酸 His CAU 2.00 0.67 1.33 1.54*UUG 0.88 1.50 0.62*0.83 CAC 0.00 1.33 1.33*0.46 CUU 1.76 1.80 0.04 1.78*谷氨酰胺 Gln CAA 0.40 0.67 0.27*0.39 CUC 1.12 0.90 0.22 1.02*CAG 1.60 1.33 0.27 1.61*CUA 0.88 0.60 0.28 0.75 天冬酰胺 AsnAAU1.67 1.67 0.00 1.74*CUG 0.08 0.00 0.08 0.25 AAC 0.33 0.33 0.00 0.26 异亮氨酸 Ile AUU 1.17 1.00 0.17 0.95 赖氨酸 Lys AAA*1.37 1.58 0.21*1.46*AUC 1.11 0.95 0.16 1.10*AAG0.63 0.42 0.21 0.54 AUA 0.72 1.05 0.33*0.96 天冬氨酸 AspGAU*1.18 1.67 0.49*1.37*缬氨酸 Val GUU*1.17 1.33 0.16*1.16*GAC 0.82 0.33 0.49 0.63 GUC 1.08 0.57 0.51 0.74 谷氨酸 Glu GAA1.47 1.43 0.04 1.30*GUA*1.17 1.33 0.16*1.03*GAG0.53 0.57 0.04 0.70 GUG*0.58 0.76 0.18*1.08*半胱氨酸 Cys UGU2.00 2.00 0.00 1.00 丝氨酸 Ser UCU*1.52 2.62 1.10*1.72*UGC 0.00 0.00 0.00 1.00 UCC 1.62 0.76 0.86 1.27*色氨酸 Trp UGG1.00 1.00 0.00 1.00 UCA 0.19 0.34 0.15*0.14 精氨酸 Arg CGU 0.00 0.10 0.10*0.03 UCG 0.00 0.08 0.08 0.09 CGC 0.45 0.10 0.35 0.26 脯氨酸 Pro CCU 1.33 0.91 0.42 0.87 CGA 0.09 0.58 0.49*0.34 CCC*1.00 1.64 0.64*1.69*CGG 0.36 0.48 0.12*0.58 CCA 0.67 0.73 0.06 0.92 丝氨酸 Ser AGU1.52 1.52 0.00 1.69*CCG 1.00 0.73 0.27 0.52 AGC 1.14 0.68 0.46 1.08*苏氨酸 Thr ACU 0.67 0.31 0.36 0.52 精氨酸 Arg AGA3.85 3.39 0.46 3.28 ACC*2.33 2.46 0.13*2.28*AGG*1.25 1.35 0.10*1.51*ACA 0.33 0.31 0.02 0.39 甘氨酸 Gly GGU0.70 0.21 0.49 0.36 ACG 0.67 0.92 0.25*0.81 GGC*0.96 1.74 0.78*1.35*丙氨酸 Ala GCU 1.33 0.71 0.62 0.92 GGA*1.22 1.44 0.22*1.19*GCC*1.07 2.55 1.48*1.89*GGG1.13 0.62 0.51 1.10*GCA 1.33 0.36 0.97 0.84 GCG 0.27 0.36 0.09*0.34*:最优密码子;*:高表达密码子;*:高频密码子。*:Optimal codon;*:High expression codon;*:High frequency codon.546 热带亚热带植物学报 第 31 卷 和检验中颠换率，非同义替换率和 的 P 值分别是0.011、0.017 和 0.036(P0.05)，说明凤尾蕨科和其他蕨类 ycf94 基因的 trsv、dN 和 存在显著差异,而trst、trsv/trst 和 dS 无显著差异。图 4 凤尾蕨科与其他蕨类ycf94 进化速率均值比较及Mann-Whitney 检验 Fig.4 Comparison of mean values of ycf94 evolution rate between Pteridaceae and other ferns and Mann-Whitney U tests 2.5 适应性进化分析适应性进化分析 表 3 和 4 是 PAML 得出的 ycf94 基因适应性进化分析的结果。对各模型下计算出的对数似然值进行模型间的似然比检验，分析显著性选择更为适合的模型。结果表明，分支模型下 M0 和 F 检验结果显著(P=0.024)，表明不同分支间值存在显著差异。二比率模型中设定了以凤尾蕨科为前景支，其他蕨类为背景支，M0 和 M2 检验结果极显著(P=6.188 106)，表明凤尾蕨科和其他蕨类的 值存在极显著差异。位点模型下，结果显示位点间 值存在显著差异(P=0.000)，且 3 对模型比较都显示 ycf94 基因中存在正选择位点。以 BEB 后验概率大于 95%为标准，模型 M2a 和 M8 均鉴定出 1 个正选择位点74A。在分支-位点模型中，同样以凤尾蕨科为前景支，似然比检测结果显示零假设模型和 Model A 间不存在差异(P=1.000)，故不接受模型 A 的结果。表 3 不同模型下的参数估计值和对数似然值 Table 3 Parameter estimates and log-likelihood values under different models 模型 Model 对数似然值 Likehood-value 参数 Parameter 正选择位点 Positive selected site 分支模型 Branch model M0 6 230.169 036=0.416 06 F 6 117.741 146 M2 6 219.954 536 1=0.329 94,2=0.578 80 位点模型 Site model M1a 6 127.975 932 P0=0.689 72,0=0.261 43 不允许 P1=0.310 28,1=1.000 00 M2a 6 123.671 402 P0=0.675 37,0=0.266 54 74 A P1=0.302 59,1=1.000 00 P2=0.022 04,2=2.193 99 M3 6 106.590 522 P0=0.175 58,0=0.062 16 无 P1=0.573 65,1=0.350 45 P2=0.250 77,2=1.015 19 M7 6 106.590 522 P=0.960 67,q=1.168 03 不允许 M8 6 098.858 655 P0=0.918 31,P=1.204 73 74 A*q=1.879 88,P1=0.081 69 =1.472 03 M8a 6 102.276 428 P0=0.816 16,P=1.219 64 无 q=2.737 83,P1=0.183 84 =1.000 00 分支-位点模型 Branch-site model Null model 6 101.320 093 P0=0.447 51,P1=0.144 96 不允许 P2a+P2b=0.407 53,=1.000 00 Model A 6 101.320 093 P0=0.447 51,P1=0.144 96 P2a+P2b=0.407 53,=1.000 00 *:后验概率99%*:Posterior probability 99%第 4 期 李子菲等:蕨类植物叶绿体基因 ycf94 的分子进化研究 547 表 4 似然比检验 Table 4 Likelihood ratio tests 模型 Model 模型比较 Comparison of model 2l 自由度 d.f.P 分支模型 Branch model M0-F 224.855 78 185 0.024*M0-M2 20.429 00 1 6.188106*位点模型 Site model M0-M3 258.779 00 4 0.000*M1a-M2a 8.609 06 2 0.014*M7-M8 15.463 73 2 4.386104*M8-M8a 6.835 55 1 0.009*分支-位点模型 Branch-site model Null model-Model A 0 1 1.000*:P0.05;*:P1的分支，说明该部分分支可能有正选择存在，其中有 7 条分支属于凤尾蕨科，其余分支包括了蹄盖蕨科、鳞毛蕨科、水龙骨科和合囊蕨科。同时似然比检验表示二比率模型优于单比率模型，凤尾蕨科和其他蕨类的 值存在极显著差异，这与 HyPhy 的分子进化速率计算结果一致。但是前景支 值(=0.578 8)并不高于 1，尚不能认为它是受正选择作用的，选择压力约束放松可能是较为合理的解释。ycf94基因共编码 80 个氨基酸位点，位点模型 M2a 和 M8均检测出一个正选择位点 74A，占总序列 1.25%;基于 M8 模型检测负选择位点 63 个(P0.05),占总序列 78.75%。当一个基因受到正选择压力时，蛋白功能可能发生改变来适应外界环境变化；而当一个基因受到负选择压力，则说明该基因倾向保持原有的功能19。总的来说 ycf94 基因大部分位点受到负选择作用，推断其进化高度保守，在蕨类中 ycf94 基因的结构和功能基本趋于稳定。下一步分析氨基酸位548 热带亚热带植物学报 第 31 卷 点在蛋白质结构域中的分布，对正选择位点的定位可以探究 ycf94 基因功能，进一步了解适应性进化发生的原因和作用。本研究以94种蕨类植物的ycf94基因为对象,揭示了 ycf94 基因的基本结构特征，为叶绿体基因组的基因组成补充信息。在探讨 ycf94 的碱基组成与密码子偏好性的研究中，ycf94 基因的密码子偏好较弱,偏好使用 A 和 U 结尾的密码子，其密码子偏好性主要受到突变的影响，并且不同物种之间密码子偏好性具有一定差异。同时，通过对 ycf94 基因的进化分析，发现该基因表现高度保守，为 ycf94 基因的功能研究提供参考。参考文献参考文献 1 RAUBESON L A,JANSEN R K.Chloroplast genomes of plants 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