灵芝产漆酶工艺优化.pdf

2023 年第 8 期灵芝产漆酶工艺优化马亚萍1，2，文武1，2，暴霆杰1，2，刘民昌1，2，刘洋1，2，张荣亚1，2，李力1，2，何玲英1，2，曾正蓉1，2，杨小琴1，2，*张艇1，2（1.四川中烟工业有限责任公司 技术中心，四川 成都 610066；2.卷烟减害降焦四川省重点实验室，四川 成都 610066）摘要：通过单因素试验筛选出最适氮源、碳源；通过 Plackett-burman 设计从酵母浸粉、玉米浆、烟梗粉末、KH2PO4、MgSO4 7H2O、麸皮、维 B1、接种量、转速、pH 值共 10 个因素中筛选出对灵芝产漆酶影响较大的因素，采用最陡爬坡试验接近最大响应区，通过 Box-behnken 响应面试验建立试验因素与漆酶酶活力的回归模型。确定发酵最优条件是酵母浸粉质量浓度 3 g/L，玉米浆质量浓度 20 g/L，烟梗粉末质量浓度 10 g/L，KH2PO4质量浓度 1.1 g/L，MgSO4 7H2O 质量浓度 1.04 g/L，麸皮质量浓度 31.6 g/L，维 B1质量浓度 0.1 g/L，接种量 6%，转速 165 r/min，pH 值 3.8，发酵时间112125 h，此时发酵液漆酶活力达到 65 387 U/L。在 50、添加量 10%（按烟梗质量分数的 10%计算）、发酵时间6 h 的条件下，烟梗木质素降解率达到 38%。关键词：漆酶；灵芝；发酵；酶活；烟梗中图分类号：S567.3文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2023.08.043（1.Technology Center，China Tobacco Sichuan Industrial Co.，Ltd.，Chengdu，Sichuan 610066，China；2.Key Laboratoryfor Harmful Components and Tar Reduction in Cigarette of Sichuan Province，Chengdu，Sichuan 610066，China）Firstly，optimum nitrogen source and carbon source were screened out by single factor experiment，and thenKH2PO4，rotational speed and pH were found to have significant effects on the Ganoderma lucidum laccase production from 10factors including yeast extract，corn syrup，tobacco stem powder，KH2PO4，MgSO4 7H2O，bran，VB1，inoculation amount，rotational speed，pH through Plackett-Burman design.Subsequently，the optimal response region was approached by thesteepest ascent method.Finally，the regression between these three factors and the laccase activity was established by theBox-Behnken response surface methodology.The results determined the optimal fermentation conditions were yeast extract3 g/L，corn syrup 20 g/L，tobacco stem powder 10 g/L，KH2PO41.1 g/L，MgSO4 7H2O 1.04 g/L，bran 31.6 g/L，VB10.1 g/L，inoculation amount 6%，rotation speed 165 r/min，pH 3.8，fermentation time 112125 h，at this time fermentationbroth laccase activity reached 65 387 U/L.Under the conditions of 50，addition amount w.t 10%，and fermentation time of6 h，the degradation rate of tobacco stem lignin reached 38%.laccase；Ganoderma lucidum；fermentation；enzyme activity；tobacco stems收稿日期：2022-04-04基金项目：四川中烟工业有限责任公司院士科研项目（HX201801，GY202004）。作者简介：马亚萍（1990），女，硕士，助理工程师，研究方向为食品发酵技术。*通讯作者：张艇（1981），男，硕士，高级工程师，研究方向为产品配方。木质素广泛分布于植物的细胞壁中，是一种结构复杂的有机高分子化合物1，在木本植物细胞壁中，木质素含量为 20%35%，在草本植物细胞壁中，木质素含量为 15%25%2。其结构复杂，不易降解，极大地限制了生物质资源的生产3，并且燃烧时产生刺激性、木质气，每年有 5 亿 6 亿 t 未得到充分利用4，有数十万吨的烟梗被废弃，对环境造成了严重的污染，对生物质资源产生了极大浪费。漆酶是一种分布广泛的多酚氧化酶，以分子氧作为最终电子受体，是重要的木质纤维降解酶之一，在生物质能源、染料脱色、生物漂白、食品加工、污水处理等领域有深远的应用前景5。与细菌、植物产的漆酶相比，真菌产的漆酶具有更高的金属离子耐受性、热稳定性和底物催化氧化性6。灵芝属于白腐真菌，能产生包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶，具有真菌产漆酶良好的酶学特性，在工农业、环境领域和科研工作中受到了广泛的关注。柴新义等人7从 11 株野生大型真菌中文章编号：1671-9646（2023）08b-0061-06第 8 期（总第 582 期）农产品加工No.82023 年 8 月Farm Products ProcessingAug.农产品加工2023 年第 8 期筛选出有柄树舌灵芝具有较高的产漆酶活性。谢玉清等人8优化无柄灵芝菌培养基，发现配方为干酪素质量浓度 25 g/L、麦麸质量浓度 15 g/L、葡萄糖质量浓度 10 g/L 和酒石酸铵质量浓度 6 g/L，相应的菌漆酶活性达到 15 800 U/L。李彩联等人9开展白腐菌固态发酵产酶发酵条件优化，以麸皮为发酵基质，接种量 5%，发酵 120 h 时漆酶活性最大。于建军等人10采用响应面法优化漆酶降解梗丝木质素工艺，显著改善香气质、香气量、余味和刺激性。但前人研究一般试验设计较为简单或者试验酶活较低，通过单因素试验设计选出最佳碳氮源，通过 Plackett-bur-man 试验筛选出影响显著的因素，结合最陡爬坡试验，最后采用 Box-behnken 中心组合试验得到最优发酵工艺条件，在此条件下获得的漆酶酶活显著提高，大大提高烟梗处理水平，减少烟梗废弃化处理。1材料与方法1.1.1菌种灵芝菌（Ganoderma lucidum）本实验室保藏。1.1.2培养基马铃薯葡萄糖水（生物试剂），海博生物公司提供；葡萄糖、MgSO4 7H2O、KH2PO4、维 B1、NaOH、柠檬酸、K2HPO4（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、玉米浆（生物试剂），国药集团化学试剂有限公司提供；麸皮（食品级），山东省青岛市面粉加工厂提供。PDB 培养基：马铃薯葡萄糖水质量浓度 26.1 g/L，pH 值自然，于 121 下灭菌 15 min；原始发酵培养基：葡萄糖质量浓度 20 g/L，酵母粉质量浓度 5 g/L，蛋白胨质量浓度 10 g/L，MgSO47H2O 质量浓度 1 g/L，KH2PO4质量浓度 1 g/L，维 B1质量浓度 0.1 g/L，pH 值自然，于 121 灭菌 15 min。1.1.3仪器与设备FD100A 型高压灭菌锅，致微仪器有限公司产品；BCM-1000A 型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；ZQWY-200V 型卧式全温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司产品；1810 型紫外分光光度计，上海普析产品；JE3002GE 型电子天平，梅特勒产品。1.2.1菌株培养方法（1）菌液制备。将 250 mL 三角瓶中装入 50 mLPDB 培养基，从平板上挑取 34 个菌饼接种于 50 mLPDB 培养基中，于 30 下以转速 150 r/min 培养 5 d，用玻璃珠打散菌丝体备用。（2）摇瓶发酵培养。配制 50 mL 发酵培养基盛放于 250 mL 锥形瓶中，加入 3 mL 培养好的菌液至发酵培养基中，于 30 下以转速 180 r/min 培养 5 d，测定发酵液漆酶酶活力。1.2.2漆酶酶活力测定方法酶活测定方法为：3 mL 反应体系里含有浓度为2 mmoL/L 的 ABTS 溶液 0.5 mL、浓度为 0.05 moL/L且 pH 值为 3 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 2 mL 和粗酶液（发酵液过 0.22 滋m 微孔滤膜）0.5 mL，于45 下反应 5 min，测定 OD420。漆酶=106V总A420着V酶t.式中：着系数，值为 3.6104，L/（mol cm）；V总漆酶酶活测定反应体系总体积，mL；V酶添加酶液体积，mL；t反应时间，min。每组试验平行培养 3 瓶，每瓶发酵液平行测量3 次漆酶酶活力，取平均值。1.2.3单因素试验筛选氮源、碳源、烟梗粉末（1）培养基氮源的优化。以原始培养基为基础，分别以玉米浆、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨为氮源，添加质量浓度为 10，15，20，25 g/L，按菌液体积的6%接种量接种同一瓶菌液，摇瓶培养 120 h，测定发酵液漆酶酶活力。（2）培养基碳源的优化。以原始培养基为基础，分别以葡萄糖、麸皮、蔗糖、淀粉为碳源，添加质量浓度为 5，10，15，20 g/L，按 6%的菌液接种量接种同一瓶菌液，摇瓶培养 120 h，测定发酵液漆酶酶活力。（3）烟梗粉末的优化。以原始培养基为基础，产酶诱导因子烟梗粉末添加质量浓度分别设置为 0，5，10，15 g/L，按 6%的菌液接种量接种同一瓶菌液，摇瓶培养 120 h，测定发酵液漆酶酶活力。1.2.4Plackett-burman 试验根据前期单因素预试验结果，选取玉米浆为氮源、麸皮为碳源，考查酵母浸粉（2 g/L 和 3 g/L）、玉米浆（20 g/L 和 30 g/L）、烟梗粉末（10 g/L 和 15 g/L）、KH2PO4（1 g/L 和 1.5 g/L）、MgSO4 7H2O（1 g/L 和1.5 g/L）、麸皮（30 g/L 和 45 g/L）、维 B1（0.1 g/L 和0.15 g/L）、接种量（6%和 9%）、转速（140 r/min 和200 r/min）、pH 值（3.8 和 5.7）共 10 个因素，设 1 个虚拟变量。Plackett-burman 试验的因素和水平见表 1。1.2.5最陡爬坡试验设计按照一定梯度设置 KH2PO4、转速、pH 值，通过测定漆酶酶活，进而确定最优量。1.2.6Box-behnken 响应面法优化在 1.2.5 节试验结果的基础上，以 KH2PO4、转速、pH 值为自变量，设计三因素三水平试验。1.2.7发酵时间的优化622023 年第 8 期表 1Plackett-burman 试验的因素和水平水平酵母浸粉/g L-1玉米浆/g L-11-1232030烟梗粉末/g L-11015KH2PO4/g L-11.01.5MgSO4 7H2O/g L-1麸皮/g L-1维 B1/g L-11.01.530450.100.15接种量/%69转速/r min-1pH 值1402003.85.7在上述发酵条件下，测定不同发酵时间下的发酵液漆酶酶活，确定较优发酵时间。1.2.8灵芝发酵液处理烟梗采用上述优化好的灵芝发酵液，按烟梗质量分数的 5%，10%，15%，20%，25%均匀喷洒到烟梗中，另外均匀喷洒水，使得烟梗最终含水率达到35%，密封好放入 50 的恒温培养箱中，处理 6 h，80 烘 2 h，按照国标 YC/T 347-2010 测定样品的木质素含量。1.2.9数据处理采用 Design Expert 12 开展试验设计和结果分析。2结果与分析2.1.1碳源筛选培养基氮源筛选见图 1。原始发酵培养基分别添加了玉米浆、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨之后的发酵液酶活，由图 1 可知，氮源玉米浆 大豆蛋白胨 牛肉膏蛋白胨，且玉米浆质量浓度 20 g/L 时，酶活最高。因此，选用玉米浆作为碳源，质量浓度 20 g/L。因为玉米浆中香草酸和阿魏酸是有效的产漆酶促进剂11-12。2.1.2碳源的优化培养基碳源筛选见图 2。原始发酵培养基分别添加了葡萄糖、麸皮、蔗糖、淀粉之后的发酵液酶活，由图 2 可知，碳源蔗糖、淀粉 麸皮 葡萄糖，但是以蔗糖、淀粉为碳源时，灵芝菌丝体固形物含量高，接近糊状。因此，优选麸皮作为培养基的碳源。2.1.3产酶诱导因子的优化烟梗中含有丰富的纤维素，并且成本低、易获取，因此采用烟梗粉末作为灵芝产漆酶诱导因子。灵芝产漆酶随烟梗粉末质量浓度的变化见图 3。由图 3 可知，05 g/L，漆酶酶活快速增加，510g/L，增加放缓，1015g/L，趋于平稳。当添加10g/L的烟梗粉末时，漆酶酶活增加到对照组的 1.59 倍。通过 Plackett-burman 试验，筛选出对灵芝产酶的关键因素。Plackett-burman 试验结果见表 2，Plackett-bur-man 试验方差分析结果见表 3。由表 2 表 3 可知，结果显著（p0.05），确定系数 0.98，说明模型有较高的拟合度和可靠性。其中，KH2PO4（p0.05）、转速（p0.05）、pH 值（p0.01）这 3 个因素对漆酶酶活存在显著影响。试验发现，所有 pH 值 5.7 的发酵液均染菌，酶活较低，可能是因为 pH 值 5.7 的发酵液不适合灵芝菌的生长，导致培养过程中杂菌生长，与陈建军等人13的研究结果一致。选取 KH2PO4、转速、pH 值为主要影响因素，继续优化其水平。对其余因素，因其影响不显著，根据正负效应，确定各组分的质量浓度为酵母浸粉 3 g/L，玉米浆 20 g/L，烟梗粉末 10 g/L，MgSO4 7H2O 1.04 g/L，麸皮 31.6 g/L，维 B10.1 g/L，接种量 6%。选取 KH2PO41 g/L，转速 150 r/min，pH 值 3.8，依次按一定的步长向下试验。图 1培养基氮源筛选50 00040 00030 00020 00010 0000空白培养基氮源-10 g/L；-15 g/L；-20 g/L；-25 g/L玉米浆大豆蛋白胨牛肉膏蛋白胨图 2培养基碳源筛选60 00050 00040 00030 00020 00010 0000葡萄糖培养基氮源-5 g/L；-10 g/L；-15 g/L；-20 g/L麸皮蔗糖淀粉图 3灵芝产漆酶随烟梗粉末质量浓度的变化50 00040 00030 00020 00010 0000051015烟梗粉末质量浓度/g L-1马亚萍，等：灵芝产漆酶工艺优化63农产品加工2023 年第 8 期表 5Box-behnken 试验的因素与水平设计表 6 Box-behnken 响应面试验结果最陡爬坡试验结果见表 4。由表 4 可知，随着 KH2PO4、转速、pH 值的减小，酶活力依次降低。因此，以试验组 1 为下一步试验中心点。在 Plackett-burman 试验和最陡爬坡试验的基础上，选取 A：KH2PO4、B：转速、C：pH 值进一步做Box-behnken 响 应 面优化，A（-1：0.85 g/L，1：1.15 g/L）、B（-1：130 r/min，1：170 r/min）、C（-1：3.2，1：4.4）。Box-behnken 试验的因素与水平设计见表 5，Box-behnken 响应面试验结果见表 6。通过 Design Expert 11 软件进行响应面分析，得到各因素对漆酶酶活影响的二次多项式回归方程：漆酶酶活=10 581A+10 227B+3 098C+1 290AB-1 845AC+1 286BC-4 098A2-5 370B2-4 242C2.Box-behnken 方差分析见表 7。由表 7 可知，p0.05），表明模型显著且具有较好的拟合度，响应面模型的信噪比大于 4，说明模型设计合理，可信度高14，可用模型对灵芝产漆酶进行分析和预判。KH2PO4和转速一次项极显著，pH 值显著，依据 p 值显著性各因素影响排序为 KH2PO4 转速 pH 值。KH2PO4和转速对漆酶酶活的等高线图和响应面图见图 4，KH2PO4和 pH 值对漆酶酶活的等高线图和表 2Plackett-burman 试验结果表 3Plackett-burman 试验方差分析结果试验号酵母浸粉/g L-1玉米浆/g L-11234567891011121-1-1-1-11-111-11111-1-11-1-1111-1-1烟梗粉末/g L-1-1-10-10-1-1-10000KH2PO4/g L-1-111-1-11-11-111-1MgSO4 7H2O/g L-1麸皮/g L-1维 B1/g L-11-11-1-1-111-11-11-11-1-1-111-111-11111-111-1-1-1-1-11接种量/%111-111-1-1-1-1-11转速/r min-1-1-11-111111-1-1-1pH 值1-1-1-1111-1-111-1酶活/U L-16 07525 27119 83445 621223 088017 77819 77301 26639 577表 4最陡爬坡试验结果方差来源平方和估算系数p 值模型酵母浸粉玉米浆烟梗粉末KH2PO4MgSO4 7H2O麸皮维 B1接种量转速pH 值误差R2R2Adj2.7691098.4751051.3651082.5121071.6011081.1561076.9431057.4101069.5581072.7381082.0651091.6561070.967 30.980 3-265-3 372-2 893-3 652-982-240786-2 822-4 776-13 1170.026 5*0.779 30.055 70.223 70.048 0*0.358 80.799 40.347 50.076 80.028 9*0.004 0*编号KH2PO4/g L-1转速/r min-1pH 值酶活力/U L-1123451.000.850.700.550.4015013011090703.83.22.62.01.452 28451 14549 12531 13531 463水平A KH2PO4/g L-1B 转速/r min-1-1010.81.01.2120150180C pH 值3.03.84.6试验号AB酶活/U L-11234567891011121314151617001-1-101100-1-1000100110-110-10-1010000-150 87259 78163 77429 90624 17547 36155 17542 34352 01035 15036 14240 44758 67849 08250 12554 03127 874C010-10-1-1001100001-1642023 年第 8 期表 7Box-behnken 方差分析方差来源平方和自由度模型ABCABACBCA2B2C22.141098.961088.37108/7.681076.651061.361076.621067.071071.211087.581079111111111残差失拟项R2R2Adj信噪比8.991073.221070.959 60.907 615.139 373注：p0.01，极显著；p0.05，显著。均方和2.371088.961088.371087.681076.651061.361076.621067.071071.211087.581071.291071.07107F值p 值18.4769.7265.145.980.51791.060.51495.59.455.90.000 40.000 10.000 10.044 40.495 00.337 50.496 30.051 40.018 00.045 50.741 90.580 3响应面图见图 5，转速和 pH 值对漆酶酶活的等高线图和响应面图见图 6。通过软件 Design Expert 11 分析，确定最佳培养基为 KH2PO41.1 g/L，转速 165 r/min，pH 值 3.8，相应响应面二次模型预测漆酶酶活最大值为 63 824 U/L。按照优化后的条件培养 120 h，平行测定 3 次取平均值，得到漆酶酶活为 65 387 U/L，与理论预测值误差 2.4%，证明响应面法模型较准确地拟合了实际情况，证明了模型的可靠性。灵芝产漆酶随发酵时间的变化见图 7。由图 7 可知，前 48 h 漆酶酶活很低，48 h 后开始增长，在 112125 h 漆酶酶活达到最大，之后开始降低。因此，优选发酵时间 112125 h 作为发酵最佳时间。烟梗木质素降解率随灵芝发酵液添加量的变化见图 8。由图 8 可知，添加量为 5%10%时，烟梗木质素降解率随添加量的增大而快速增大，发酵液添加量为 10%，烟梗木质素降解率达到 38%，之后增加发酵液添加量，木质素降解率缓慢增大至趋于平衡，最大可降解 42%左右。灵芝发酵液富含漆酶，漆酶可降解木质素，说明灵芝发酵液在降解废弃生物质方面可发挥极大的作用。3结论通过 Plackett-burman、最陡爬坡、Box-behnken对灵芝产漆酶发酵条件进行先“定性”、后“定量”的研究方式15。首先，通过 Plackett-burman 设计从酵母浸粉、玉米浆、烟梗粉末、KH2PO4、MgSO4 7H2O、麸皮、维 B1、接种量、转速、pH 值共 10 个因素中马亚萍，等：灵芝产漆酶工艺优化图 4KH2PO4和转速对漆酶酶活的等高线图和响应面图图 5KH2PO4和 pH 值对漆酶酶活的等高线图和响应面图图 6转速和 pH 值对漆酶酶活的等高线图和响应面图1801651501351500.80.91.01.11.2A KH2PO4/g L-180 00070 00060 00050 00040 00030 00020 00010 000180漆酶酶活/U L-1150120 0.81.21.0（b）（a）0.91.14.64.23.83.43.00.80.91.01.11.2A KH2PO4/g L-180 00070 00060 00050 00040 00030 00020 00010 0004.6漆酶酶活/U L-13.83.00.81.21.0（b）（a）0.91.14.64.23.83.43.0120135150165180B 转速/r min-180 00070 00060 00050 00040 00030 00020 00010 0004.6漆酶酶活/U L-13.83.0120180（b）（a）1501651354.23.44.23.416513565农产品加工2023 年第 8 期polysaccha-rides：A review of compositions，isolation，th-erapeutics and prospect J.International Journal of Bio-logical Macromolecules，2018（111）：894-902援邹胜，徐溢，张庆.天然植物多糖分离纯化技术研究现状和进展 J.天然产物研究与开发，2015，27（8）：1 501-1 509援辛国贤.柿子单宁提取及脱臭活性研究 D.保定：河北农业大学，2013.马鸿承，蒋磷雷，邓云.黑蒜粉喷雾干燥工艺优化 J.上海交通大学学报（农业科学版），2019，37（5）：64-67，75.赵磊，楚文靖，姜薇，等.香葱粉喷雾干燥工艺优化 J.保鲜与加工，2020，20（4）：165-170.韦璐，唐婷，王敏，等.响应面法优化南瓜淮山复合固体饮料喷雾干燥工艺 J.食品研究与开发，2020，41（17）：114-121.于方园，张丁洁，吴娜娜，等.草莓速溶粉喷雾干燥工艺的研究 J.食品研究与开发，2020，41（10）：161-166.梁子敬，张景艳，冯海鹏，等.响应面优化黄芪多糖的提取工艺 J.食品研究与开发，2018，39（21）：74-76.殷（上接第 60 页）9101112131415图 7灵芝产漆酶随发酵时间的变化图 8烟梗木质素降解率随灵芝发酵液添加量的变化筛选出 KH2PO4、转速、pH 值这 3 个对灵芝产漆酶有显著影响的因素；其次，最陡爬坡试验确定最优发酵条件大致范围；最后，通过 Box-behnken 响应面试验建立这 3 个因素与漆酶产量的回归模型，确定发酵最优条件是酵母浸粉 3 g/L，玉米浆 20 g/L，烟梗粉末10 g/L，KH2PO41.1 g/L，MgSO4 7H2O 1.04 g/L，麸皮31.6g/L，维B10.1g/L，接种量6%，转速165 r/min，pH值 3.8，此时发酵液酶活活可达 65 387 U/L，以此发酵液添加量 10%，木质素降解率可达 38%。这种研究方式适合因素多的试验，先找出影响显著的因素，进而逼近最优区域。参考文献：王绍敏，赵新兰，马亚男，等.不同致病力 Rhizoctonia菌株对玉米木质素代谢、总酚含量及相关基因表达的影响 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