人大肠癌细胞建株的初步研究.pdf

山西医科大学硕士学位论文人大肠癌细胞建株的初步研究姓名：张毅强申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：程牛亮20070508一、摘要目的大肠癌是一种常见的消化系统肿瘤，目前的基础性研究主要集中在对它的发病机理的研究方面，临床研究主要集中在对大肠癌早期诊断与治疗的研究，随着对疾病认识的进展，研究者逐步认识到，不论从基础、临床还是预防方面都需要对大肠癌细胞的生物学性状有一个深刻的了解。细胞株的建立为研究细胞的生物学特性提供了一个较好的靶材料。本实验拟建立人大肠癌细胞株，为大肠癌的致病机制研究、提供一个良好的细胞模型。方法本实验分为四部分：第一部分为肿瘤组织的体外培养，患者男性，年龄7 0，取手术切除的该患者的新鲜大肠癌组织，病理确诊为直肠管状腺癌级，采用组织块培养法与胶原酶消化法做细胞原代培养。在含1 0 胎牛血清的高糖D M E M 培养液中培养扩增，稳定传代，倒置显微镜下观察细胞形态特征和细胞生长的状况。第二部分对所培养的细胞进行鉴定，包括：(1)H E 染色观察固定细胞的形态，看是否具有肿瘤细胞的形态学特点。(2)透射电镜下(T E M)观察细胞的超微结构，从细胞内部观察是否符合癌组织的特点。(3)免疫细胞化学鉴定细胞角蛋白来判断细胞的组织来源，是否符合癌起源于上皮组织的特性。第三部分对所培养细胞进行生物学性状的描述。采用M T T 法绘制细胞的生长曲线；流式细胞技术检测细胞D N A 指数，分析研究细胞的染色体倍性；并采用b o y d e n 小室观察细胞的转移力。第四部分为动物实验，B A L B Cn u n u 裸鼠腋背部皮下接种3 x 1 0 6(2 0 0 u 1)，4周后处死裸鼠，取出瘤组织做病理诊断，做H E 染色观察，观察是否仍具有肿瘤的特点，观察细胞的成瘤性。结果(1)大肠癌细胞在体外连续培养4 个月，体外培养初步成功。(2)细胞生长曲线表明，在原代培养时细胞生长较慢，传代后细胞生长速度加快，细胞每传一代时间为1 W。(3)倒置显微镜下观察细胞呈梭形及不规则多角形，有聚集生长趋势；H E 染色显示核大蓝染，符合癌细胞的形态学特征；细胞角蛋白鉴定胞浆黄染，C K 阳性，证明癌细胞起源于上皮组织；透射电镜下，见细胞核大、细胞内丰富的线粒体、表面微绒毛，细胞间连接复合体结构，符合代谢旺盛的癌细胞的特点。流式细胞D N A 倍体分析结果证明细胞为异倍体细胞，也证明了肿瘤细胞的特点；b o y d e n d x 室实验表明此细胞具有转移性。(4)动物实验，B A L B(2n u n u 裸小鼠腋背部皮下接种三天后，可见接种部位产生小米粒大小肿物，l W 后肿物增大，随着瘤组织的继续增大，4 W 后裸小鼠精神不佳，体表温度降低，此时测量瘤组织最终大小为2 x 2 5 c m，瘤组织H E 染色结果显示细胞排列紊乱、失去了正常细胞所具有的接触抑制的性质，具有癌细胞的形态学特征。结论本实验在体外成功进行了人大肠癌组织来源的癌细胞的原代培养、稳定传代，并对其生物学性状进行了初步描述及鉴定，初步证明了此细胞来源于上皮组织，具有癌细胞的主要形态特征，此细胞具有转移性和成瘤性的特点，为人大肠癌细胞的成功建株奠定了基础。关键词大肠癌，细胞株，细胞原代培养n二、A b s t r a c to b j e c t i v eC o l o r e c t a lc a n c e ri sav e r yc o m l n o nd i g e s t i v es y s t e mc a n c e r A tp r e s e n tt h ef u n d a m e n t a lr e s e a r c hi sf o c u s e do ns t u d y i n gi t sp a t h o g e n e s i s，a n dc l i n i c a lr e s e a r c hi sc e n t r a l i z e di ni t se a r l yd i a g n o s i sa n dt h e r a p y W i t ht h ei n c r e a s i n gr e c o g n i t i o no ft h i sd i s e a s e r e s e a r c h e r sg r a d u a l l yr e a l i z et h a tb o t hf u n d a m e n t a lr e s e a r c h，c l i n i c a lr e s e a r c ha n dp r e v e n t i o nn e e dt h o r o u g h l yu n d e r s t a n d i n go fb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sc o l o r e c t a lC a n C e rc e i l E s t a b l i s h m e n to fc e l ll i n ep r o v i d e sau s e f u lt a r g e tm a t e r i a lt os t u d yc e l lb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s T h ep r e s e n te x p e r i m e n tp l a n st oe s t a b l i s hh u m a nc o l o r e c t a lc a n c e Tc e l ll i n ef o rb e t t e ru n d e r s t a n d i n go fc o l o r e c t a lc a n c e rc e l lb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i ca n dp r o v i d eau s e f u lc e l lm o d a lf o rs t u d y i n gc o l o r e c t a lC a n C e l p a t h o g e n e s i sm e c h a n i s m M e t h o d sT h i se x p e r i m e n tc o n s i s t so ff o u rp a r t s T h ef i r s tp a r ti si nv i t r oc u l t u r et u m o rt i s s u e T i s s u ew a so b t a i n e df r o mas u r g i c a l l yr e s e c t e df r e s hc o l o r e c t a lc a n c e r，m o d e r a t e l yd i f f e r e n t i a t e dt u b u l a ra d e n o c a r c i n o m ag r a d eI I，o c c u r r i n gi na7 0 y e a r-o l dm a l e U s i n gt i s s u ep i e c ea n dI Vc o l l a g e n a s ed i g e s t i o nd op r i m a r yc e l lc u l t u r e T h ec e l l sw e r ep r o l i f e r a t e da n dp a s s a g e di nh i g hg l u c o s eD M E Mm e d i u m,s u p p l e m e n t e dw i t h1 0 h e a t-i n a c t i v a t e dF B St h e no b s e r v a t i o nc e l lm o r p h o u r sc h a r a c t e r i s t i ca n dc e l lg r o w t hc o n d i t i o ni ni n v e r t e dm i c r o s c o p e T h es e c o n dp a ni si d e n t i f i c a t i o nc u l t u r e dc e l l s i n c l u d i n gh i s t o l o g i c a ls t a i n(脏)t oo b s e r v ec e l ls h a p ea n dt os e ew h e t h e ro rn o th a v et u n l o rm o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c；U s i n gt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p et ov i e wc e l l su l t r a m i c r o s t r u c t u r e a n df r o mc e i l si n s i d et os e ei ft h e ya c c o r d、i t l lC a n C e l c e l l s；U s i n gi m m u n o e y t o c h e m i s t r yi d e n t i f yc y t o k e r a t i nt 0s e ei fi tf i t st oc a n c e ri so r i g i u l n gf r o me p i t h e l i a lt i s s u ec h a r a c t e r i s t i c；T h et h i r dp a r ti st od e s c r i b ec u l t u r e dc e l l sb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c A p p l y i n gM T Ta s s a yt od r a wc e l lg r o w t hC U l-V e，t od e t e c tc e l lD N Ai n d e xn u m b e ra n da n a l y s i sc e l lp l o i d y；o b s e r v a t i o nc e l li n v a s i o nb yb o y d e nc h a m b e rt e c h n i q u e；t h ef o u rp a r t si sa n i m a le x p e r i m e n t v i e w i n gc e l lo n c o g e n i c i t yb ys u b c u t a n e o u si n o c u l a t i o no nB A L B Cn u n un o d em i c eb a c k；4w e e k sl a t e rp u tn o d em i c et od e a t ha n do b t a i nt u m o rt i s s u ef r o mn o d em i c et om a k ep a t h o l o g i c a ld i a g n o s i sa n dH Es t a i n R e s u l t s(1)C o l o r e c t a lc a n c e l c e l lW a ss u c c e s s f u l l yc u l t u r e di nv i t r of o r4m o n t h s T h ec e l lc u l t u r eg o ti n i t i a lS U C C C S S S(2)T h ec e l lg r o w t hc u r v es h o w e d,w h e nd o i n gp r i m a r yc u l t u r ec e l lg r o w ns l o w l y,w h e np a s s a g i n gc e l tg r o w nf a s t e r,o n ew e e ko n ep a s s a g e(3)T h ec e l l s m o r p h o u sw g r ef u s i f o r ma n di r r e g u l a rp o l y g o n h a v i n ga g g r e g a t i o ng r o w t hc o n d e n c y H Es t a i ns h o w e dk a r y o m e g a l ya n db l u e-s t a i n,a c c o r d i n gw i t hc a n c e rc e l lm o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c I m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys h o w e dc y t o p l a s my e l l o w-s t a i nC Kp o s i t i v e T E Ms h o w e db i gc e l ln u c l e a r,a b u n d a n c ei nm i t o c h o n d r i a,c e l ls u r f a c em i c r o v i l l u sa n dc e l l-c e l lj u n c t i o n a lc o m p l e x a c c o r d i n gw i t hm e t a b o l i s mv i g o r o u sc a n c e rc e l lc h a r a c t e r i s t i c H e a l t h1 1 1h u m a ne e l l i Sd i p l o i dc e i l D N Ai n d e xr e s u l ts h o w e dh e t e r o p l o i d(4)A n i m a le x p e r i m e n t T h r e ed a y sl a t e ra f t e ra p p e a r e ds m a l lt u n l o rt r a n s p l a n t,aw e e kl a t e rt h et u m o rt r a n s p l a n tb e g i n st og r o wb i g 4w e e k sl a t e Ln o d e m i c e h a dab a da p p e t i t e，w e i g h ta n db o a ys u r f a c et e m p e r a t u r ew e r el o w l y,a n dd i s l o c a t i o np u tm i c et od e a t h H Es t a i ns h o w e dc a n c e rc e l lm o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c s C o n c l u s i o nT h i se x p e r i m e n ts u c c e s s f u l l yd o e sp r i m a r yc e l lc u l t u r e，s t a b l ep a s s a g ed c s e r i p t i o na n di d e n t i f i c a t i o nc e l lb i o l o g i c a lc h a r a c t e r,t e s t i f m gt h ec e l lo r i g i n i n gf r o me p i t h e l i a lt i s s u e，h a v i n gc a n c e rc e l l。Sm a i nm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e ra n dh a v eo n c o g e n i c i t ya n di n v a s i o nc h a r a c t e r i s t i c s，g i v eab a s e m e n tf o rf u t u r er e s e a r c ha n dS U C c e s s f u le s t a b l i s h m e n tc e l ll i n e K e y w o r dc o l o r e c t a lc a n c e l (C R C)，c e l ll i n e，p r i m a r y c e l lc u l t u r e学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本文独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：I、交回学校授予的学位证书；2、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。4、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：日期：照Z 年月望日学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。(保密论文在解密后应遵守此规定)萋喜姜嘉萎耄：魏指导教师签名：4 主纽日期：殳Z 年月兰星日日期：Q 1年月上日(本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用)山西医科大学硕士学位论文刖吾大肠癌(e o l o r e c t a lc a n c e r，C R C)是消化系统常见恶性肿瘤之一，发病率居全球肿瘤的第三位【1 1，近年来我国大肠癌的发病率也不断的提高，己上升至第3 5 位【2 1，有研究表明大肠癌的发病率随着年龄的增加而增高，发病的高峰年龄介于6 0 一7 9 岁。大肠癌的发病率在4 0 岁之前较低，除非个体具有遗传易感性或者既往有炎性肠疾患的病史 3 1。虽然近几年来我国在大肠癌的基础、临床和预防方面的研究取得了较大的进展，但是对其发病、复发、转移机制的了解仍十分有限。目前公认的，大肠癌的发生受到遗传和环境因素的作用，涉及多个癌基因和抑癌基因的改变，表现为多基因、多步骤的协同累积作用的结果。肿瘤细胞体外培养是研究癌变机理和肿瘤细胞生物学特性的较好手段，在组织培养中占有重要地位。鉴于人们目前对大肠癌发病、复发、转移机制认识的局限性，因此建立体外培养的人大肠癌细胞株可以进一步研究大肠癌细胞的生物学特性和发生发展机制。细胞体外培养就是将活细胞放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法细胞株是指通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物【4 J。从1 8 9 8 年L j u n g g r e n 第一次进行了人类组织的体外培养开始，到1 9 5 1 年报道了G e o r g eG e y 体外成功培养了人类第一个癌细胞株-H e L a，细胞培养技术发展迅速。人类大肠癌细胞体外培养开始于二十世纪六十年代，国外最早的大肠癌细胞株是在1 9 6 1 年由M o o r e 等人建立【5 1，他报道了新建的8 种人类肿瘤细胞株，这些细胞株有一个共同的特点，均是在培养基中悬浮生长。在美国已经建立了专门的机构一A T c C(A m e r i c a nT y p eC u l t u r eC o l l e c t i o n)储存这些已通过一定生物学鉴定的细胞株，为研究者提供科研上的便利。到且前为止A T C C(A m e r i c a nT y p eC u l t u r eC o l l e c t i o n)已经报道了一些人类大肠癌细胞株：如L o v o(结肠腺癌)、H C T-8(回盲肠腺癌)、S W 4 0 3 等1 6 7。9 1，但每种细胞都体现出不同的生物学特点：如细胞形态、培养特点等。我国的细胞建株工作起步较晚，较多的文献集中在肝细胞建株的研究领域，对大肠癌细胞建株工作的描述j 较少，由于肿瘤的异质性和复杂性，不同种族和地域来源的同组织肿瘤，其细胞特性不尽相同I lo】，因此有必要建立一种能反映我省大肠癌特点的细胞株。我们根据我省的特点，采集了一些大肠癌病人的手术标本，进行大肠癌细胞的建株工作j 由于病人来源于我省及周边地区，因此如果能够成功建立起此细胞株，可以有效的反映我国北方黄土高原地区大肠癌的发病特点，可以更为有效的筛选出该地区大肠癌细胞的特殊性质或标志，为我省该疾病的研究提供更准确的研究工具，为大肠癌的致病机制、诊断及治疗以及与之相关的抗肿瘤药物的研究和开发提供一个有用的细胞模型。大肠癌细胞的成功建株，细胞的原代培养是关键，它是建立各种细胞系的第一步。原代培养是指从体内取出组织或细胞的第一次培养，确切定义为首次成功地传代培养之前的培养为原代培养】。目前人类大肠癌细胞原代培养失败由于微生物的污染、间质细胞的过分生长以及对复杂营养成分的需求【1 2 1，我室根据自身的特点，优化了大肠癌细胞原代培养山西医科大学硕士学位论文方案，建立了一套自己的培养方法：(1)利用自制的鼠尾胶原铺制细胞培养瓶底，为大肠癌细胞的贴壁提供了适宜的底物。(2)抗生素洗液中加入了两性霉素B，且加大了抗生素的用量，有效控制了细胞原代培养的污染。(3)L e i b o v i t z 等在培养基中加入生长因子制成混合培养基【1 3】而B r a t t a i n 等加入3 T 3 成纤维细胞滋养层【1 4】来促进细胞的生长，由于表皮生长因子费用较高，我室选择了胰岛素、转铁蛋白和适当的血清浓度，实验结果表明加入适当的胰岛素、转铁蛋白和血清浓度为成功原代培养细胞提供了促进细胞生长的因子，促进了细胞原代培养的成功。(4)在细胞的原代培养过程中，我们选用了不同浓度抗生素量的培养基，如在首次细胞培养时，培养基中抗生素的量为常规用量的十倍，当细胞原代培养成功后，将培养基换为含有常规抗生素用量的培养基。细胞原代培养成功以后，对所生长的细胞，我们进行一系列的鉴定，主要目的在于证明所培养的细胞确实来源于原体内具有恶性行为的细胞，而非正常细胞或其他细胞，并阐明其一般生物学性状【l”。本实验我们进行了从大肠癌细胞原代培养到稳定传代的初步研究，为大肠癌细胞的成功建株奠定了基础。2山西医科大学硕士学位论文研究步骤及技术路线山西医科大学硕士学位论文第一部分人大肠癌细胞的原代培养与鉴定1 材料与方法1 1 材料1 1 1 主要仪器设备纯水仪M i l l i p o r e超净工作台细胞培养箱S a n y o倒置显微镜O l y m p u s自动高压锅S a n y o离心机北京离心机厂水浴箱、低温冰箱4 0 C 及-2 0 0 C、超低温冰箱一7 0。C、O i l s o n 移液器、p H 计8 0 0 型、精密天平、眼科剪、眼科镊、2 5 0 目不锈钢筛网、细胞计数板1 1 2 主要试剂D M E M 干粉型培养基一袋(h i 曲g l u c o s e)t r y p s i n a s ei V C o l l a g e n a s e透明质酸酶I n s u l i nA m p h o t e r i c i nF B S鼠抗人角蛋白兔抗鼠二抗G I B C OG I B C OG I B C OG m C 0S i g m aS i g m a杭州四季青北京中杉金桥北京中杉金桥D A B 试剂盒组成试剂A封闭用正常山羊血清工作液试剂B生物素化二抗工作液试剂C辣根酶标记链酶卵白素工作液E D T A、D M S O、细胞培养瓶、培养板、培养皿、其他试剂1 1 3 实验液体的配制4山西医科大学硕士学位论文(1)H a n k s 洗液N a C lK C IC a C l 2M g S 0 4 7 H 2 0N a 2 H P 0 4 H 2 0K H 2 P 0 4N a H C 0 3G(葡萄糖)酚红市售青霉素市售链霉素A m p h o t e r i c i n(3 u g m 1)去离子水8 0 0 90 4 0 9O 1 4 9O 2 0 9O 0 6 9O 0 6 90 3 5 91 0 0 90 0 2 90 6 9(1 0 6 U)1 0 0 0 U m ll g(1 0 6 0)1 0 0 0 U m l3 m g1 0 0 0 m l准确称量以上成分，先将C a C l 2 溶解于1 0 0 m l 二蒸水中，依次将其他成分溶解于8 0 0 m l二蒸水中，酚红用数滴5 6 N a H C 0 3 将之溶解，缓慢将1 0 0 m lC a C h 液倒入第三步的溶液中，调节P H 值至7 O 7 2 补加水至1 0 0 0 m l 容量瓶中，无菌抽率分装，-2 0。C 保存。(2)P B S 配制(5 m g m 1)N a C I8 0 0 9K C l0 2 0 9N a 2 H P 0 4-1 2 1 4 2 03 6 9K H 2 P 0 40 2 0 9去离子水1 0 0 0 m l调节P H 值至7 O 7 2，分装高压消毒备用(3)完全D M E M 培养液的配制(1 0 0 0 n i l)【1 6 1 7 1 8】D M E M 干粉培养基一袋2 3 8 9H E P E S2 3 8 9N a H C 0 32 0 9I n s u l i n(1 0 u g m 1)1 0 m gT r a n s f e r r i n(2 u g m 1)2 m g市售青霉素(1 0 0 u m 1)O 0 6 9市售链霉素(1 0 0 u m 1)O 1 9山西医科大学硕士学位论文去离子水9 0 0 m lF B S1 0 0 m l调节P H 值至7 0-7 2，无菌抽率后，-2 0 保存(4)胶原酶消化液的配制(1 0 0 m 1)不完全D M E M 培养液1 0 0 m lC o l l a g e n a s e l V(1 S m g m 1)1 5 0 m gA m p h o t e r i c i n(3 u g m 1)O 3 m g透明质酸酶(O 2 5 m g m 1)2 5 m g市售青霉素(1 0 0 0 u m 1)0 0 6 9市售链霉素(1 0 0 0 u m 1)O 1 0 9分装1 0 m l 小瓶，-2 0 0 C 保存(5)多聚甲醛的配制1 0 多聚甲醛的配制：称取4 0 9 多聚甲醛，用蒸馏水定容至4 0 0 m l，随后加热(低于6 0 1 2，温度不能太高否则甲醛成为甲酸)，使之溶解，过滤备用。4 多聚甲醛的配制：P B S 5 0 0 m l+1 0 多聚甲醛4 0 0 m l+蒸馏水定容至1 0 0 0 m l(6)O 4 台盼蓝染液配制称取0 4 9 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，然后加双蒸水至1 0 0 m l，用0 2 2 u r n 滤膜过滤后，制备成母液，4 0 C 保存(7)鼠尾胶原的制备取健康S D 大鼠(2 5 0 9)左右1 只，将大鼠鼠尾从尾根部剪断，用自来水、蒸馏水分别清洗干净后，将其放入7 5 乙醇中浸泡3 0 m i n。在超净工作台中将浸泡后的鼠尾切成1 5 c m的小段，用齿镊剥去鼠尾的皮毛，抽出其中的白色尾腱，置于玻璃皿中；用眼科剪剪碎尾腱，转移入0 1 灭菌醋酸溶液密封，随后置于4 0 C 冰箱中，并不时摇动，4 8 h 后移入灭菌离心管中，以4 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i n，无菌条件下吸取上清(即鼠尾胶液体)，并将上清液置于2 0 0 C 冰箱中保存1 1 9】。(8)鼠尾胶原铺制培养瓶用玻璃吸管将制备好的鼠尾胶液体吸入2 5 e m 2 的培养瓶中，厚2 m m-3 m m 即可；不要盖培养瓶，遂将培养瓶放入无菌饭盒中，用棉花蘸淡氨水放入饭盒中，将饭盒盖紧，持续3 0 m i r a3 0 r a i n 后可见液态的鼠尾胶原已变为胶冻状并贴于培养瓶壁上；用P B S 漂洗己贴壁的鼠尾胶3 次，然后置于超净台上晾干备用。6山西医科大学硕士学位论文1 1 4 实验标本标本来自手术切除的新鲜人大肠癌组织。大肠癌病人是在山西省肿瘤医院进行手术治疗的患者。大肠癌的确诊以手术切除的肿瘤组织或活检组织的病理学检查为依据。全部大肠癌患者均经组织病理学确诊。大肠癌患者术前均未经放射治疗和抗肿瘤化学药物治疗。1 2 方法1 2 1 细胞培养(1)取材患者，男，7 0 岁，汉族，直肠癌，管状腺癌1 I 级，检测指标如下：C E A1 0 7 2(+)C A l 9 93 9 4 9(+)C A 2 4 23 1 8 1(+)A F P4 4 3()C A 7 2 40 4 7()取材时选择瘤细胞集中的和细胞活性较好的部位，指肉眼观察瘤组织表面无溃烂。将手术中切除的癌组织放入含有不完全D M E M 培养基的无菌玻璃瓶中，此转移用的不完全D M E M 培养基中舍有十倍常规抗生素的用量。将此瓶放入冰盒中，尽快转移到实验室进行操作。将癌组织取出，置于无菌平皿中，用无菌眼科剪、眼科镊去除坏死组织、脂肪组织和血凝块，选择肉眼观察较好的组织，将其置于1 5 I I l l 离心管中，H a n k s 洗液冲洗1 0 次，去除红细胞及表面污物，如果组织较脏应适当增加冲洗次数，后将组织块置于无菌平皿中。(2)组织块培养法培养细胞精细地将组织块切碎(O 5 1 m m 3)，用1 0 m l 的H a n k s 洗液强有力地反复吹打，使组织分离为小的聚集物。小心地用吸管将细胞的团块连同洗液一同吸入支1 5 m l 无菌塑料离心管中。1 0 0 0 r p m 离心I m i n,移除上清液。用H a n k s 洗液重悬，重复步骤一次。用吸管将组织碎块放入2 5 e m 2 预先铺好鼠尾胶的培养瓶中，竖起培养瓶加1 2 m l 的完全D M E M 培养液，培养箱中将培养瓶底朝上放置2 4 h 后，缓慢将培养瓶放正，放入3 7 0 c含5 C 0 2 和9 5 空气的C 0 2 培养箱中培养。绝对静置3 4 小时，缓慢取出培养瓶补加培养液至5 m l，加液方法同继续培养。绝对静置两天，但要注意培养基颜色变化，若发现细胞污染，及时弃掉，若不存在污染，三天后小心取出培养瓶观察。三天后小心取出培养瓶仔细观察，有贴壁的组织块，也存在未贴壁漂浮的组织块收集并转移漂浮的组织块至一支无菌的离心管中。(亘)4 0 0 r p m 离心3 m i n,弃掉2 3 的上清液，补加5 m l 完全D M E M 培养液。转移入2 5 c m 2预先铺好鼠尾胶的培养瓶中继续培养。7山西医科大学硕士学位论文(3)胶原酶消化法培养细膨2 0】将上述平皿中的大肠癌组织用无菌眼科剪切成O 5 1 O m m 3将组织碎块移入l P m l 玻璃离心管中，加入5-1 0 m l 胶原酶消化液，放入3 7 0 C 水浴中，不断振荡，连续观察l h，直至组织碎块弥散开为止(组织块由初始的边缘处出现毛糙、云雾状改变，至后来用滴管触动液体可见拉丝出现为止)，每隔3 0 m i n 收集消化液。4 0 0 r p m 离心4 m i n,收集细胞沉淀，用H a n k s 液冲洗。重复步骤一次。将收集的细胞沉淀用完全D M E M 培养液重悬，置于4 0 C 冰箱中，直至消化过程全部结束。将细胞悬液通过2 5 0 目无菌的不锈钢筛网，移除大的细胞团块，已过筛网的液体转移入2 5 c m 2 预先铺好鼠尾胶的培养瓶中。放入3 7 0 c 含5 C 0 2 和9 5 空气的C 0 2 培养箱中培养。(4)培养细胞的纯化与计数以上两种方法培养细胞的生长过程中，常伴有成纤维细胞的混合生长，影响了肿瘤细胞的生长，我室采用胰酶消化法去除成纤维细胞。这种方法取决于不同的细胞对胰酶消化的敏感性1 2 1】，利用细胞对胰酶消化敏感性的差异，达到细胞纯化的目的。贴壁的组织块常伴有杂细胞的生长，国外许多学者的经验表明，当肿瘤组织块贴壁后，其癌细胞成片的生长，形成集落，常常抑制了杂细胞的生长2 3 2 4 2 5 1，但也存在少量的杂细胞。根据这个结论，我们暂不对贴壁的细胞进行纯化，当细胞培养至1 5 2 0 天后组织块自动脱落，随后弃去漂浮的组织块，之后对贴壁的细胞进行纯化。细胞的纯化过程需要重复多次，具体方法如下：取出培养瓶，弃掉培养基，加入5 m I P B S 冲洗后，吸除P B S。加1 S m lO 2 5 的胰酶，前后旋转培养瓶4 5 次，以便胰蛋白酶包被所有瓶内细胞，放入3 7。C 细胞培养箱中2 m i n。取出培养瓶在倒置显微镜下观察，可见部分细胞首先变圆、脱落被消化下来，这时停止消化这些首先被消化下来的细胞为成纤维细胞，吸除成纤维细胞及消化液。往培养瓶中加入5 m l 完全D M E M 培养液，用吸管吹打细胞，收集细胞悬液。1 0 0 0 r p m 离心3 m i n，弃上清。加入5 m lP B S 洗涤细胞沉淀，重复步骤一次。加入5 m lP B S 后，取纯化后的细胞悬液5 0 u l 加入等体积O 4 台盼蓝(w v)充分混匀。5 分钟内进行细胞计数及活性鉴定，死细胞着蓝色，活细胞不着色。按1X1 0 5 个n i l的浓度接种于预先铺好鼠尾胶的2 5 锄2 培养瓶中，继续培养。山西医科大学硕士学位论文(5)台盼蓝染色细胞纯化后要进行细胞活力染色，确定群体细胞中存活的细胞数，采用台盼蓝染料排斥实验，其原理为正常健康的细胞能排斥染料，但细胞膜完整性破坏后，染料可弥散入细胞内【2 6 1。步骤同(6)培养细胞的计数取待测细胞悬液1 0 0 u l，加入P B S9 0 0 u l 混匀，滴于血细胞计数板上，于1 0 0 倍镜下(1 0 目镜、1 0 物镜)计数四角的四个大方格细胞，计数过程中，对大方格的边缘压线细胞按数上不数下、数左不数右的原则进行计数1 2 r t细胞计数方法：(4 大格活细胞数之和4)X1 0 4 稀释倍数=细胞数，m l(7)细胞传代待细胞长至7 0-8 0 融合时，吸除培养液，P B S 洗两次，加入含0 0 2 E D T A 的0 2 5 胰蛋白酶消化液1 5 m l，放入细胞培养箱中，消化2 m i n，镜下观察待细胞胞质回缩，细胞间隙增大，胞体趋于变蹰，但没有大部分脱落时，加入完全D M E M 培养液终止消化，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞使细胞成悬液，按l：3 分装传代，即为P l 代。1 2 2 培养细胞的鉴定(1)形态学观察：H E 染色将已处理并消毒的盖玻片放入6 孔板内，取P 3 代细胞，以l X l 0 5 个m l 的浓度接种常规培养，待细胞达到7 0-8 0 融合时，