阿斯匹林对人大肠癌细胞Lovo增殖和凋亡的影响.pdf

苏州大学硕士学位论文阿斯匹林对人大肠癌细胞Lovo增殖和凋亡的影响姓名：潘占胜申请学位级别：硕士专业：普外科指导教师：赵宏;陈少骥20070401阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响中文摘要阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响中文摘要目的研究阿斯匹林在体外对人大肠癌细胞株L o v o 生长抑制和诱导凋亡的作用，并对其机制做进一步探讨。方法不同浓度的阿斯匹林溶液(1 0 0 l a g m l、2 0 0 a g m l、3 0 0|_ t g m 1)处理对数生长的人大肠癌细胞株L o v o，用倒置显微镜每天观察细胞生长情况。采用M T T =g 色法测量A 值，计算对照组和各实验组L o v o 细胞的抑制率和生存率；应用流式细胞技术对阿斯匹林作用后的L o v o 细胞进行细胞周期分析，并计算细胞凋亡率；免疫细胞化学(I C C)法检测肿瘤细胞中B e l 2，B a x，S u r v i v i n 蛋白的表达变化；R T-P C R 半定量检狈I L o v o 细胞S u r v i v i nm R N A 的表达水平，以研究阿斯匹林诱导大肠癌L o v o 细胞凋亡的机制。结果M T T 法显示阿斯匹林可明显抑带l j L o v o 细胞的增殖，并且随着浓度的增加和作用时间延长而增强，阿斯匹林浓度为3 0 0 p g m l 的抑制率最大，约为5 6 9；流式细胞图上出现亚二倍体“凋亡峰”，定量分析显示，浓度为1 0 0 嵋m l、2 0 0 a g m l、3 0 0 a g m l 的阿斯匹林诱导L o v o 细胞产生的凋亡率分别为1 3 5、2 1 3、4 8 _ 3，与对照组3 2 的凋亡率比较均有显著差异(P 0 0 5)。随着阿斯匹林浓度的增高，处于G l G o 期的L o v o细胞逐渐增多，G 2 舢期细胞变化不明显，而处于s 期的肿瘤细胞逐渐减少；免疫细胞化学(I C C)结果显示，阿斯匹林处理4 8 h 后的细胞形态不规则，胞核染色较深且偏于一侧。胞浆内可见棕黄色颗粒，提示B a x 蛋白表达，阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和捅亡的影响中文摘要并且随着干预药物浓度增加，产生棕黄色颗粒的阳性细胞数逐渐增多。而对照组细胞形态基本正常，细胞内仅有少量棕黄色颗粒，B a x 蛋白表达水平较低。对照组细胞的S u r v i v i n 和B c l 一2 蛋白高表达，胞浆内可见大量棕黄色颗粒，染色较深。随着阿斯匹林浓度的增加，表达棕黄色颗粒的阳性细胞数减少，且染色也逐渐减淡，提示在阿斯匹林作用下S u r v i v i n 和B c l-2 蛋白的表达下降。阿斯匹林干预L o v o 细胞4 8 h 后，R B P C R 检测结果提示肿瘤细胞S u r v i v i nm R N A 的表达呈浓度依赖性降低。结论阿斯匹林可明显抑制大肠癌L o v o 细胞增殖，且呈时间和剂量依赖性。阿斯匹林抗肿瘤的作用机制除已经明确的C O X 2 抑制作用外，还可能与下调S u r v i v i n 和B c l 一2 的表达、上调B a x 的表达有关。关键词阿斯匹林；大肠癌；凋亡；S u r v i v i n；B c l 一2；B a xI I作者：潘占胜指导老师：赵宏陈少骥阿斯匹#对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响英文摘要T h ee f f e c t so fg r o w t ha n da p o p t o s i si n d u c e db ya s p i r i ni nh u m a nc o l o r e c t a lc a n c e rc e l ll i n eL O V OA b s t r a c to b j e c t i v eT os t u d yt h eg r o w t hi n h i b i t i n ga n da p o p t o s i si n d u c e db yA s p i r i no nt h ep r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i so ft h eh u m a nc o l o r e c t a lc e l ll i n eL o v o a l s ot oe x p l o r ei t sp o s s i b l em e c h a n i s m so fa n t i c a n c e re f f e c t s M e t h o d sI nv i t r o e x p o n e n t i a lp h a s eh u m a nc o l o r e c t a lc a n c e rc e l ll i n eL o v ow a s t r e a t e db ya s p i r i ni nv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s(0 0 1 _ L g m l、2 0 0 l g m l、3 0 0 p g m 1)c e l lm o r p h o l o g yc h a n g e sw a so b s e r v e db yo p f i c Mm i c r o s c o p y u s i n gM T Ta s s a yt od e t e c ta b s o r b a n c ev a l u ea n dc a l c u l a t ei n h i b i t i o no rs u r v i v i a lr a t e a n dt h e nt h ee f f e c to fc e l lg r o w t hi n h i b i t i o nw a sa s s a y e db yM T Tm e t h o d t h ei n d u c t i o no fc e l lc y c l ea n da p o p t o s i sb ya s p i r i nw a sa s s e s s e db yf l o wc y t o m e t r y,t h ee x p r e s s i o no fS u r v i v i n、B c l 一2a n dB a xp r o t e i nw e r ea n a l y z e db yi m m u n o c y t o c h e m i s t r y f l C C)t h ee x p r e s s i o no fS u r v i v i nm R N Aw a sd e t e r m i n e db yr e v e r s et r a n s c r i p l a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n(R T-P C R)t os t u d yt h em a c h a n i s mo fa p o p t o s i si n d u c e db ya s p i r i n R e s u l t s 1 Ta s s a ys h o wt h a tA s p i r i nc o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho ft h eh u m a nc o l o r e c t a lc a r c i n o m ac e l l l i n eL o v o，a n dt h ei n h i b i t o r ye f f e c tw a sd o s e a n d t i m ed e p e n d e n tf 氏O 0 5)t h ei n h i b i t i o nr a t ew a st h em a x i m u mu n d e rA s p i r i nd e n t i s yw a s3 0 0,r I l lw h i c hw a s5 6 9 T h e r ew a sa na p o p t o t i cp e a ki nL o v oc e l l sa f t e ri n c u b a t i n gw i t ha s p i r i nd e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r y Q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sr e s u l tf r o mD N Ab a r g r a g hw a st h a tc e l la p o p t o t i cr a t i oo f l 0 0 1 I g m l、2 0 0 1 a g m l、3 0 0 I t g m l d e n s i t y w a s1 3 5、2 1 3、1 I I旦塑坚堂型幽堑塑堕!竺竺望鳖塑塑圭墼星堕菱壅塑萋4 8 3 t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n tc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p s 3 2 t h ec e l l si nG i G os t a g em u l t e da st h ed e n s i t yo fA s p i r i ni n c r e a s e d，c e l l si nSs t a g ed e s c e n d e dg r a d u a l l y,w h i l ec e l l si nG 2 Ms t a g eh a v en ov a r i a t i o n A l s ot h ee x p r e s s i o n so fS u r v i v i na n db c l 一2w e r ed o w n r e g u l a t e d，t h e r ew e r em a n ye u m o r p h i s mi n c e l li nc o n t r o lg r o u p h o w e v e rt h ee x p r e s s i o no fb a xw a su p r e g u l a t e ds i g n i f i c a n t l ya st h ed e n s i t yo fA s p i r i ni n c r e a s e d m a n ye u m o r p h i s mc o u l db es e e ni nc e l lm e m b r a n ea n de m d o c h y l e m ar a t h e rt h a nc o n t r o lg r o u p t h ee x p r e s s i o no fS u r v i v i nm R N Aw a sd e t e r m i n e db yr e v e r s et r a n s c r i p l a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n(R T-P C R)E x p r e s s i o no fS u r v i v i nm R N Aw a sd o w n r e g u l a t e dt h r o u g hl a d d e rs t r a pa st h ei n c e a s i n go fA s p i r i nc o n c e n t r a t i o n C o n e l u s i o nC e l lc r o w t hi n h a b i t i o na n di n d u c t i o no fa p o p t o s i sc o u l db ec a r r i e do u tb yA s p i r i ni nad o s e-a n d-t i m ed e p e n d e n tm a n n e r,a n di t sp o s s i b l em e c h a n i s mw a sd o w n r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o n so fS u r v i v i na n dB c l 2 u p r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no f B a x K e yw o r d sA s p i r i n；C o l o r e c t a lc a n c e r；A p o p t o s i s；S u r v i v i n；B c l 2；B a xW r i t t e nb yZ h a n-s h e n gp a nS u p e r v i s e db yH o n gz h a oS h a o-j ic h e nI V阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和拥亡的影响中英文对照缩略词表英文缩写B pK b pC o xD M S OP B SM T TF C MO DB c l 2B a xP Ims R中英文对照缩略词表英文全称b a s ep a i r sk i l o b a s ep a i r sC y c l o o x y g e n a s ed i m e t h y ls u l p h o x i d ep h o s p h a t e-b u f f e r e ds a l i n eM e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u mf l o wc y t l m e t r yo p t i c a ld e n s i t yB c e l ll y m p h o m a l e u k e m i a-2B c l-2a s s o c i a t e dXp r o t e i nP r o p i d i u mi o d i d eI n h i b i t i O nr a t es u r v i v a lr a t e中文全称碱基对千碱基对环氧合酶二甲基亚砜磷酸盐缓冲液四甲基偶氮唑盐流式细胞仪光密度值B 细胞淋巴瘤白血病一2B c l 2 相关X 蛋白碘化丙啶抑制率生存率苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。研究生签名：盖釜上赴日期：I 蛆学位论文使用授权声明苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。论文的公布(包括刊登)授权苏州大学学位办办理。研究生签名：导师签名：日期：日期：Q 1：旦生坐。7，6 群，工扩阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响前言前言大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，发病率有明显增高趋势，低位直肠癌和青年患病者也更多见。目前，大肠癌的有效治疗方法是手术治疗，术前或术后辅以放、化疗。许多化疗药物如5-F U、阿霉素、顺铂、环磷酰胺等都有显著的疗效，紫杉醇、喜树碱等抗癌中药的疗效也得到肯定，但这些化疗药物毒副作用及耐药性仍然是一个不可回避的现实，一定程度上限制了其应用和发展，因此寻求新型抗癌药物成为医学领域的又一个热点。阿斯匹林(a s p i r i n)自1 8 9 7 年在德国问世以来，在临床上被广泛应用于解热镇痛和抑制血小板聚集，是临床上应用最为广泛的解热镇痛药，它属于非甾体抗炎药(N S 加s)。最近的流行病学、动物模型和临床研究中发现长期服用非甾体抗炎药对大肠癌及癌前病变有一定预防作用 1,2 1，甚至能够使腺瘤消退【l,2 1。实验也证实阿斯匹林对肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤均有不同程度的抑制作用，对于阿斯匹林抗肿瘤的确切作用机制仍不完全清楚。新近的研究资料表明，人体肿瘤组织及体外培养的肿瘤细胞检测出环氧合酶-2(C O X-2)，高表达的C O X-2 可干扰肿瘤细胞分裂周期，使细胞分裂停滞于S 期，抑制细胞凋亡使肿瘤无限增殖，而阿斯匹林正是通过抑制环氧合酶2 诱导肿瘤细胞凋亡，从而能够抗肿瘤和预防肿瘤。部分学者f l 捌则持有不同的观点，舒林酸等非甾体抗炎药能够诱导肿瘤细胞高表达F a s，而F a s F a s l 是细胞凋亡中最强的死亡信号转导途径。所以，上调F a s 的表达诱导肿瘤细胞凋亡，也是非甾体抗炎药抗癌作用机制之一。1 9 9 7 年耶鲁大学的A m b r o s i n i 等1 3,4 1 利用效应细胞蛋白酶受体1阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响前言(E f f c c t o rc e l l p r o t e a s er e c e p t o r-1E P R-1)e D N A 在人类基因组文库中克隆出S u r v i v i n，S u r v i v i n 基因定位于人染色体J 7 q 2 5 近端粒位置【3 一，其表达产物S u r v i v i n 蛋白是凋亡抑制蛋白(i n h i b i t o ro f a p o t o s i sp r o t e i n sI A P s)家族中的新成员，I A P s 是一类进化高度保守的凋亡抑制蛋白，主要通过c a s p a s e 蛋白酶，激活级联反应途径及肿瘤坏死因子受体(T N F R)介导的信号转导途径抑制细胞凋亡。S u r v i v i n 在胸腺、睾丸以外的组织器官中罕有表达，却广泛存在于人体多种肿瘤组织中，通过破坏细胞增殖和凋亡之间的平衡而使肿瘤发生发展，是目前已知作用最强的凋亡抑制因子。由于其分子结构独特，组织表达特异以及显著的生物学特性，越来越受到人们的重视。本实验以不同浓度阿斯匹林干预人大肠癌细胞株L o v o，通过M T T、流式细胞技术(F C M)检测阿斯匹林对肿瘤细胞生长抑制和细胞周期的影响。以免疫细胞化学法检测肿瘤细胞中S u r v i v i n、B c l 一2、B a x 蛋白的表达变化，R T-P C R 及电泳技术检测实验组和对照组中S u r v i v i nm R N A 的表达差异，并对阿斯匹林诱导L o v o 细胞凋亡的机制做进一步探讨，旨在对阿斯匹林抗肿瘤的作用机制更深入了解，对大肠癌药物治疗及化学预防提供新的理论参考。阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响材科和方法材料和方法1 1 实验材料1 1 1 细胞株和药物(1)细胞株人结肠癌细胞株L o v o 购于上海生物细胞研究所(2)药物阿斯匹林(乙酰水杨酸a c e t y l s a l i c y l i ca c i d,A S A)由苏州大学药学院惠赠5-F U(5 一氟尿嘧啶)购于上海旭东海普药业公司产品1 1 2 主要试剂(1)F 1 2 培养基购自美国G i b e o 公司(2)小牛血清(F C S)购自杭州四季青公司(3)二甲基亚砜(D M S o)为S i g m a 公司产品(4)四氮噻唑盐(M T T)为S i g m a 公司产品(5)焦碳酸-7,酯(D E P C)为加拿大B B I 公司产品(6)碘化丙啶(P I)染色液为S i g m a 公司产品(7)S u r v i v i n、B c I-2、B a x 抗体(R A B 0 5 3 6)为福州迈新生物技术开发有限公司产品(8)M M V L、R n a s i n、5 x b u f f e r、1 0 X b u f f e r、d l V I P、M g C l 2、T a q 酶购自美国P r o m e g a 公司(9)六随机引物购自上海生物工程有限公司(1 0)S u r v i v i n 基因引物由上海生工生物公司合成，肛孵妇基因引物由上海申能博彩生物公司合成(1 1)琼脂糖购自S i g m a 公司1 1 3 主要仪器阿斯匹林对人大肠癌细胞伽增殖和凋亡的影响材科和方法(1)超净实验台(苏州净化设备仪器厂)(2)B B 5 0 6 0 型c 0 2 孵育箱(H e r a e u s 公司，德国)(3)4 C 冰箱(苏州香雪海电器厂)(4)流式细胞仪(B e c k m a nC o u l t e r 公司，美国)(5)恒温水浴锅(上海医疗器械厂)(6)低温冰箱(S A N Y O，日本)(7)倒置显微镜(0 咖U SC X-4 0，日本)(8)紫外分光光度计(B e c k m a n C o u l t e r 公司，美国)(9)低温离一L,；肌L a b o f u g e 4 0 0 R(H e r a e u s 公司，德国)(1 0)凝胶成像系统(V i b e rL o u r m a t)(11)电泳电转移系统(B I O-R A DL a b o m t o d e sp t yL t d，美国)(1 2)酶联免疫检测仪(华东电子集团医疗设备装备有限公司)(1 3)光学显微镜(0 n m 口u SC X-4 0，日本)(1 4)9 6 0 0 型P C R 扩增仪(美国A B I 公司)1 2 实验方法1 2 1 细胞培养人结肠癌细胞L o v o 用含有1 0 d x 牛血清的F 1 2 培养基于3 7 C、5 c 0 2条件下培养，每6 天传代1 次，倒置显微镜每天观察细胞生长情况。1 2 2 药品配制精确称取乙酰水杨酸，以双蒸水溶解，使其浓度为I m g m l，以O 2 2J-t m的微孔滤膜加压过滤除菌；5-F U 用移液枪从安瓿中精确抽取，双蒸水稀释至l i n g m 1 的储备液，4 下保存，临用时3 7 C 水浴复温。1 2 3M T T 比色法检测不同浓度药物对L o v o 细胞的生长抑制1)培养细胞至对数生长期，用0 2 5 的胰酶消化后，8 0 0 r p m 离，1 1,1 0 m i n。阿斯匹林对人大肠癌细胞L O v O 增殖和捅亡的影响材料和方法2)弃去上清液，混悬于含有l O d、牛血清的F 1 2 培养基中，用血细胞计数板计数，调整细胞浓度为5X1 0 4 m l。3)以每孔1 0 0 1 1 加)k 9 6 孔板中，置于3 7、5 C 0 2 的培养箱中继续培养。4)2 4 h 后细胞贴壁，弃去原培养基，加入不同量阿斯匹林药液，使实验组药物终浓度为1 0 0 p g m l、2 0 0 L L g m l、3 0 0 p g n i l(O 5 m M 1、1 0 m M 1、1 5 m M 1)，5 0 1 x g m l 的5 F U 作为阳性对照，连同阴性对照共5 个组别，以培养基调节每孔至2 0 0“1，每组设3 个复孔，另设调零孔。5)分别于2 4 h、4 8 h、7 2 h 后终止培养，加入5 p g m l 的M 兀镕液2 0 p 1，继续孵育4 h 后，去除孔内的上清液。6)每孔加入1 5 0 1 d 的D M S O，振荡1 0 m i n 混匀，使结晶物充分溶解。7)置于酶联免疫检测仪中，在波长5 7 0 n m 处测定吸光度值(A b s o r b a n c e,A值)，计算细胞生存率(S u r v i v i lR a t e，S R)及抑制率(I n h i b i t o r yR a t e)，细胞生存率(s R)=实验孔A 值对照孔A 值1 0 0，抑制率(I R 户(对照孔A 值实验孔A 值)对照孔A 值1 0 0。1 3 流式细胞仪检测人大肠癌细胞凋亡率及进行细胞周期分析1)将处于对数生长期的肿瘤细胞以胰酶消化后，接种于辅照消毒后6 孔细胞培养板中培养。2)待细胞贴壁生长融合至瓶底的7 5，处于对数生长期时，弃去原培养液，加入含药培养基使阿斯匹林终浓度为1 0 0 p g m l、2 0 0 p g m l、3 0 0 p gm l，阴性对照组及实验组共4 个组别，每组设3 个复孔。3)温箱内孵育4 8 h 后终止培养，收获对照组和实验组的肿瘤细胞，以0 2 5的胰酶消化后制成单细胞悬液，用P B S 洗涤2 次。4)7 5 的乙醇(P B S 配制)固定，4 C 过夜。5)P B S 洗涤2 次后，加入1 0 0 u g m l 的R N A 酶l O O u l 消化3 0 m i n。阿斯匹林对人大肠癌细胞L a v a 增殖和凋亡的影响材科和方法6)加入5 0 p g，m l 的碘化丙锭(P I)染色液1 0 0 t t l，4 C T 避光染色3 0 r a i n。7)上机检测，采用流式细胞仪对样品进行检测，激发波长4 8 8 n m，分析软件C e l l Q u e s t 计算调亡及细胞周期。1 4 免疫细胞化学法(S P 法)检测B a x，B c l-2，S u r v i v i n 蛋白表达1)盖玻片洗涤剂清洗后，清水冲净，置于干燥箱中烘干。2)以含浓硫酸和重铬酸钾的清洗液中浸泡2 4 h，清水洗净后烘干，高压高温灭菌后烘干备用。3)取对数生长期的细胞，以0 2 5 的胰酶消化，用F 1 2 培养液稀释成单细胞悬液后，盖玻片置于6 孔板内，再将细胞以5 0 X1 0 4 m l 的浓度接种于6 孔板，阴性对照及实验组共4 个组别，每组设3 个复孔。4)待2 4 h 细胞贴壁后弃去原培养基，加入不同浓度药物干预4 8 h。5)弃上清夜，加入l m l P B S，5 m i n 后吸去P B S，如此清洗3 次(3+5)。6)加入7 5 的乙醇室温固定2 0 r a i n 后吸去液体，P B S 洗涤3*5。7)将细胞爬片从6 孔板中取出，晾干，用中性树胶粘于载玻片上，P B S冲洗细胞爬片3*5。8)置于1 的双氧水中，室温1 0m i n，以灭活内源性过氧化物酶的活性，P B S 冲洗3*5。9)加入正常羊血清封闭液(P B S 稀释)室温3 0r a i n，封闭非特异性抗原。1 0)分别加入S u r v i v i n,B d 2，和B a)【一抗2 0 0 t t l 使其完全覆盖细胞，置于湿盒中4 C 过夜，P B S 代替一抗作阴性对照。1 1)细胞爬片复湿l h 至室温，P B S 冲洗3*5，加入生物素标记的二抗，3 7湿盒孵育3 0m i n。1 2)加1 滴链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液，室温下孵育1 0m i n，P B S冲洗3*5。6阿斯匹#对人大肠癌细胞I m v o 增殖和凋亡的影响材料和方法1 3)D A B 显色：除去P B S 液，每张切片加一滴新鲜配制的D A B 溶液覆盖1 0 m i n，3 7。1 4)自来水冲洗，苏木素复染3 m i n，盐酸酒精分化数秒钟，自来水冲洗1 0 r a i n，P B S 返蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察并摄片。1 5)结果判定：当细胞胞浆内出现棕黄色均匀颗粒判为S u r v i v i n，B e l 2，和B a x 阳性细胞，光镜下随机选取1 0 个高倍镜视野(X 4 0 0)，共计数1 0 0 0 个细胞，计算阳性细胞百分率=(阳性细胞数1 0 0 0)1 0 0。1 4R T P C R 半定量检测S u r v i v i nm R N A 的表达1 A 1 U 加I 法抽提总R N A1)阴性对照及实验组细胞培养孵育4 8 h 后，以胰酶消化收获肿瘤细胞，每个组别细胞总数达1 1 0 7。2)P B S 洗涤后转入1 5 m l E P 管中，离心后去上清，加入l r r d T r i z o l 室温下充分裂解5 m i n。3)加入氯仿2 0 0 1 a l，猛烈上下颠倒2 0 次，充分混匀后室温静置5 r a i n。4)4 C，1 2 0 0 0 r p m 离-t),1 5 r a i n。一5)转移上清至1 5 1 m lE P 管中，加入异丙醇5 0 0 肛1 沉淀R N A，室温静置5 r a i n。6)4 C，1 2 0 0 0 r p m 离一I j q 5 m i n。7)弃上清，用6 0 0 I _ t 1 7 0 乙醇漂洗。8)4 C，1 2 0 0 0 r p m 离一L,1 0 m i n。9)弃上清，用8 0 0 p I 无水乙醇漂洗。1 0)4 C，1 2 0 0 0 r p m 离-1 1,1 0 m i n 后弃上清，室温下干燥5m i n，加适量D E P C水溶解。l1)取R N A 4 p l 力1,K 1 9 6 1 a l 的D E P C 水，用分光光度计测定混合物的浓度，阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响根据O D 2 6 0 2 8 0 在1 8 2 1 范围判断所测鼢派的纯度，最后将R N A 深度调整至0 5 p g o a 待用。1 4 2 逆转录反应(从R N A 至D N A)一份反应体系为：1)管l(共1 5 t t l)六随机引物R N AD E P C 水7 0，5 m i n，4，f o r e v e r 2)管2(共2 5 p 1)，5 B u f f e rM A 缸VR n a s i n棚旧D E P C 水2)将管2 加入管I 中，3 7 l h，9 5 5 m i n，4 C，f o r e v e r 1 4 3P C R 反应2 p l4 p l9 p l8 1 a ll p l0 5 p l1 2 5J _ t l1 4 2 5 t t l总体积共4 0 1 1 1。待扩增的S u r v i v i n 上游引物序列为：5 -T r G A A T C GC G G GA C CC G T I G G-3，下游引物序列为：5 -C A G A G G C C TC A A TC C A T G C 论A-3，扩增片段4 7 t o p，1 3-a c t i n 为内参照，上游序列为：5-A G C G A G C 朋陀c C c cA A A G T T-3，下游序列为：5 -G G G C A C G A A G G C T C A T C A T r-3，扩增阿斯匹样对人大肠癌细胞L a v a 增殖和捅亡的影响材料和方法片断2 8 5 b p。一份反应体系为：1 0 X B u f f e r 5 p lM 9 2+4 p ld N r P1 p 1上游引物l p l下游引物I F IT a q 酶0 3 I t l模板c D N A3 p lJ J O d d I-1 2 0 至T o t a l5 0 p l9 5 变性5 m i n，9 4 2 0 s 交性，5 8 退 X a o s，7 2 延伸3 0 s，共3 0 个循环7 2，7 m i n，4 0，f o r e v e r 1 A 4 电泳，观察结果1)准确称取1 9 琼脂糖放入洁净三角瓶内，J 日X 5 0 m 1 1X T A E(使成2 琼脂糖)，于微波炉内加热至溶化。2)待溶化的琼脂糖冷却至6 0 0 时，加入溴化乙淀(E B)后充分混匀，使其终浓度为0 5 p g m l。3)将溶化的琼脂糖倒入胶模中制胶，并将凝胶置于电泳槽中。4)向槽内加入1 T A E，使液面稍高于凝胶表面1 2 m m。5)将M a r k e r 及所获的D N A 样品与上样缓冲液(0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖)O阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v O 增殖和捅亡的影响材料和方法混合，并依次加入样品孔。6)电泳槽通电，8 0 V 恒压电泳，使D N A 向阳极方向移动。7)电泳约2 0 r a i n，切断电源后取出凝胶，紫外成像系统下观察照相。1 5 统计学处理所有数据以均数加减标准差(x s)来表示，统计学处理采用统计软件包S P S S l 2 0，采用单因素方差分析各组间差异，P 0 0 5 为差异有统计学意义。阿斯匹林对人大肠癌细胞L o-v o 增殖和凋亡的影响结果结果2 1 阿斯匹林对大肠癌L o v o 细胞生长的影响不同浓度的阿斯匹林(1 0 0 p g m l、2 0 0 p g m l、3 0 0 p g n i l)和5 _ F u(5 0 t,g m 1)均可X 日 L o v o 细胞产生抑制作用，随着阿斯匹林浓度升高和作用时间延长，所产生的抑制作用也越显著。各阿斯匹林组与对照组之间差异均有统计学意义(户 o 0 5)，不同时间组(2 4 h、4 8 h、7 2 h)间的差异也有统计学意义(尸O 0 5)，(见表1)，表明阿斯匹林对L o v o 细胞的生长抑制作用有比较明显的剂量时间依赖性。由抑制率计算得到肿瘤细胞生存率，并绘制生存率曲线(见附图1)。表1阿斯匹林及5-F l l 对L o v o 细胞的抑制率惭，弛，n=3)各实验组间相比较+P(o 0 5，同一实验组在不同时间点相比较#P O 0 5。2 2 阿斯匹林对L o v o 细胞周期和凋亡率的影响流式细胞术检测结果显示，L o v o 细胞经不同浓度的阿斯匹林(1 0 0 t t gn i l、2 0 0 t t g n i l、3 0 0 t t g m 1)作用4 8 h 后，各实验坌 t L o v o 细胞均出现亚G I峰凋亡峰(A P 峰)，随着阿斯匹林浓度的增加，L o v o 细胞凋亡率也逐渐升高，且凋亡率和药物浓度呈正相关(见图2 及表2)。而阴性对照组没有明阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响结果显的凋亡峰，各组之间差异有统计学意义(尸 0 0 5)。aCbd图2F C M 分析药物干预4 8 h 后L o v o 细胞月期和凋亡率的改变，a 为阴性对照组，b、c、d 为实验组，阿斯匹林浓度分别为l O O g g m l、2 0 0 p g n i l、3 0 0 p g r a l 1 2阿斯匹林对人大肠癌细胞L o v o 增殖和凋亡的影响结果对照组A S AA S AA S AO1 0 02 0 03 0 03 1 8 士1 3 81 3 5 2-t：3 5 2+#2 1 3 0 士4 4 l#4 8 2 7 4-6 7 8#各实验组与对照组相比P 0 0 5，各实验组之间比较#P o 0 5。药物干预后L o v o 细胞周期发生明显变化，主要表现为G l G o 期细胞比例上升，G 2 M 期细胞变化不明显，S 期细胞比例下降(见表3)，差异有统计学意义C P O 0 5)。7表3 示阿斯匹林诱导L o v o 细胞周期改变(王s，n-3)各实验组与对照组相比+P 0 0 5，各实验组之间比较#p o 0 5。2 3 阿斯匹林对L o v o 细胞S u r v i v i n、B c l-2 和B a x 蛋白表达的影响S u r v i v i n 和b a x 蛋白主要表达于胞浆，罕见于胞核。除胞浆之外，胞膜和核膜也可有B e l 2 蛋白表达。免疫细胞化学法(I C C)检测对照组及实验组的L o v o 细胞显示：对照组细胞浆中可见大量棕黄色颗粒，提示对照组中S u r v i v i n、B e l 一