降解紫花苜蓿复合菌群的筛选及产酶条件优化.pdf

农业科学 农业与技术 降解紫花苜蓿复合菌群的筛选及产酶条件优化洪梓萌 白狄纯 王金龙(天津农学院农学与资源环境学院 天津)摘 要:为解决紫花苜蓿秸秆直接还田秸秆利用率低下的问题 实现绿肥作物还田的高效利用提供理论依据和实践参考 本试验通过测定羧甲基纤维素酶活力和滤纸酶活力 对 (、和 )、培养温度(、和)和接种量(、和 /)这 个因素进行产酶条件优化 筛选出紫花苜蓿秸秆高效降解复合菌群 (细疣篮状菌 加青霉菌 )和复合菌群 (子囊菌属 加黄孢原毛平革菌 )培养温度对复合菌群的羧甲基纤维素酶产酶能力影响最大 值对复合菌群的滤纸酶产酶能力影响最大 复合菌群 的产酶最佳水平为 值 接种量 复合菌群 的产酶最佳水平为 值 接种量关键词:紫花苜蓿秸秆 降解菌 羧甲基纤维酶活力 滤纸酶活力 产酶条件优化中图分类号:文献标识码:/收稿日期:基金项目:国家自然科学基金(项目编号:)天津农学院大学生创新创业训练项目(项目编号:)作者简介:洪梓萌()女 硕士在读 研究方向:作物栽培学与耕作学 通讯作者王金龙()男 博士 教授 研究方向:作物生理生态 为响应我国提出种植业结构调整 农业面源污染削减等系列政策 绿肥还田成为重要耕作模式 豆科作物紫花苜蓿作为绿肥耕入土壤可为种植系统提供大量的氮投入 其残留物分解缓慢释放氮相对于合成肥料中快速释放氮可更好地匹配土壤氮供应和作物氮需求 对于改善农业生产力具有重要作用 紫花苜蓿秸秆的化学组成包括纤维素、半纤维素、木质素等 纤维素在常温下不溶于水 也不溶于稀酸和稀碱 难以被分解利用 紫花苜蓿秸秆存在降解率低下问题 而特定的微生物可以有效提高秸秆降解率 因此 如何筛选高效降解紫花苜蓿秸秆的复合菌群 探索其最佳产酶条件成为研究热点 吕卓呈等试验结果表明冬小麦夏闲期种植翻压豆科作物可有效提高旱地麦田土壤细菌群落丰度和多样性 崔欣雨等经筛选后获得 株菌株 经、值 培养后 苜蓿降解率获得提高 等试验表明 在接种菌株苜蓿青贮过程中 霉菌占据细菌群落的主导地位 简化了青贮苜蓿的细菌互作网络 等采用蜡样芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、丛毛单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌制备复合菌系 复合菌系的接种促进了紫花苜蓿对、和 的吸收 已有结果表明 以种植苜蓿为材料 菌肥处理对土壤速效磷及速效钾影响显著 祁娟等试验表明 菌肥与磷肥配施能显著提高土壤微生物数量 明显提高了 种土壤酶活性 对微生物量碳、氮及磷影响较其他处理明显 由于紫花苜蓿在土壤中的腐解是一个复杂的过程 不同微生物对纤维素的降解能力存在差异性 不同条件下同种微生物对纤维素的降解能力也存在异质性 目前关于高效降解秸秆纤维素菌株的筛选应用研究越来越多 但不具有普遍性 针对紫花苜蓿秸秆降解菌的筛选及产酶条件优化研究较为缺乏 本试验通过羧甲基纤维素酶活力及滤纸酶活力测定筛选高效降解紫花苜蓿秸秆的复合菌群 并优化其产酶最佳水平 对于解决紫花苜蓿作物秸秆降解效率低下问题提高绿肥资源的循环利用和实现绿色循环农业稳步提升具有重要的理论意义和实践意义 材料与方法 试验材料 供试复合菌群供试复合菌群来源于保存于实验室 冰箱内的 组复合菌群 分别编号为复合菌群、供试秸秆来源紫花苜蓿 采自天津农学院西校区试验田 培养基及配方 农业与技术 农业科学羧甲基纤维素钠液体培养基:蛋白胨 牛肉膏 蒸馏水 培养基 灭菌 后备用 滤纸液体培养基:蛋白胨 牛肉膏 滤纸条 蒸馏水 培养基灭菌 后备用 试验地点及仪器盆栽试验于天津农学院作物标本园露天平台进行 试验主要仪器:全自动灭菌锅()上安医疗器械厂 摇床()冰箱()新飞 电子天平()托利多仪器有限公司 磁力搅拌器()恒温培养箱()上海一恒 往复式调速多用振荡器()恒温水浴锅 超净工作台酶标仪等表 复合菌群编号及组成编号组成菌株种属黑曲霉()产紫篮状菌()微紫青霉()东京根霉()细疣篮状菌()青霉菌()子囊菌属()黄孢原毛平革菌()欧洲链霉菌()扩展青霉()曲霉属()哈茨木霉()试验方法 酶活力的测定将复合菌群分别接种于反应底物为紫花苜蓿秸秆粉末的液体培养基中 置于 摇床震荡培养 分别在、取上清液离心 试验设置 次重复 用目的菌株发酵上清液和柠檬酸柠檬酸钠缓冲液加入 溶液或者滤纸条 对照管加入灭活的发酵上清液 放置 恒温水浴锅中反应 快速加入 试剂后在沸水浴中煮 取出后立即冰水浴冷却 至 室 温 使 用 酶 标 仪 测 定 吸 光 度 值()定义为每分钟催化产生 葡萄糖所需的酶数量为 个酶活力单位 葡萄糖标准曲线回归方程为 用于后续酶活力计算 复合菌群产酶条件优化 因素 水平进行优化 确定目标复合菌群的最佳产酶条件和主要影响因素 数据处理与分析采用 进行数据计算 统计软件进行方差和相关性分析 结果与分析 紫花苜蓿秸秆降解复合菌群的筛选 复合菌群对降解紫花苜蓿秸秆的羧甲基纤维素酶活力的影响由图 可知 在 条件下 复合菌群、在 羧甲基纤维素酶活性均出现由高降低后再升高的生长趋势 复合菌群 第 天时羧甲基纤维素酶活性为 显著高于其他复合菌群酶活性 即 羧甲基纤维素酶活性依次为复合菌群 表 复合菌群产酶条件优化试验设计表试验编号培养温度/值接种量图 复合菌群降解紫花苜蓿的羧甲基纤维素酶活力()农业科学 农业与技术 复合菌群对降解紫花苜蓿秸秆的滤纸酶活力的影响由图 可知 在 条件下 复合菌群、在 滤纸酶活性均出现先升高后降低再升高的生长趋势 复合菌群 第 天时滤纸酶活性为 显著高于其他复合菌群酶活性 即 滤纸酶活性依次为复合菌群 图 复合菌群降解紫花苜蓿的滤纸酶活力()降解紫花苜蓿秸秆复合菌群的确定根据复合菌群的羧甲基纤维素酶活力及滤纸酶活力测定结果 综合考虑其培养温度、值、培养时间等因素 确定高效降解紫花苜蓿秸秆复合菌群、紫花苜蓿秸秆降解复合菌群的产酶条件优化 复合菌群 对羧甲基纤维素酶及滤纸酶活力的影响由表、表 可知 通过比较 值 复合菌群 的羧甲基纤维素酶产酶能力最佳水平为 值 接种量 滤纸酶产酶能力最佳水平为 值 接种量 通过比较 值 培养温度对复合菌群 的羧甲基纤维素酶产酶能力影响最大 对滤纸酶产酶能力影响小 值对复合菌群 的滤纸酶产酶能力影响最大 对羧甲基纤维素酶产酶能力影响较大 接种量对复合菌群 的滤纸酶产酶能力影响较大 对羧甲基纤维素酶产酶能力影响小 复合菌群 的产酶能力最佳水平为 值 接种量 复合菌群 对羧甲基纤维素酶及滤纸酶活力的影响由表、表 可知 通过比较 值 复合菌群 的羧甲基纤维素酶产酶能力最佳水平为 值 接种量 滤纸酶产酶能力最佳水平为 值 接种量 通过比较 值 培养温度对复合菌群 的羧甲基纤维素酶产酶能力影响最大 对滤纸酶产酶能力影响小 接种量对复合菌群 的羧甲基纤维素酶、滤纸酶产酶能力影响较大 值对复合菌群 滤纸酶产酶能力影响最大对羧甲基纤维素酶产酶能力影响小 复合菌群 的产酶能力最佳水平为 值 接种量 表 复合菌群 的羧甲基纤维素酶活力极差分析表项水平 值接种量温度/值 值 最佳水平 水平数量每水平重复数 注:“”表示没有该水平数据 值为某因素某水平时试验数据求和 值为对应的平均值 指因素的极差值水平数量指某因素的水平数 每水平重复数 指水平的平均试验重复次数 下同表 复合菌群 的滤纸酶活力极差分析表项水平温度/值接种量 值 农业与技术 农业科学续表 复合菌群 的滤纸酶活力极差分析表项水平温度/值接种量 值 最佳水平 水平数量每水平重复数 表 复合菌群 的羧甲基纤维素酶活力极差分析表项水平 值接种量温度/值 值 最佳水平 水平数量每水平重复数 讨论紫花苜蓿秸秆在自然环境中的降解本质为借助微生物的降解作用高效分解纤维素、半纤维素的过程目前关于作物秸秆降解菌的筛选研究越来越多 对于表 复合菌群 的滤纸酶活力极差分析表项水平接种量 值温度/值 值 最佳水平 水平数量每水平重复数 紫花苜蓿秸秆降解菌的筛选研究较为缺乏 因此本试验筛选对提高紫花苜蓿秸秆降解有促进作用的高效降解菌 探索其最佳的产酶条件 在纤维素降解过程中 单独菌株具有底物抑制作用 从而使其降解效率和水平降低 而微生物复合菌系形成具有多种酶及酶活力高的生物降解体系 对降解纤维素的效率和活性要高于单独菌株 孟建宇等试验也证明 复合菌系滤纸酶活性高于复合菌系中的单独菌株 倍 宋雨等将复合菌系与单菌株比较 在分解秸秆纤维素方面复合菌系具有互补能力 对秸秆降解有促进作用本试验产酶条件优化研究方法与宫春杰相同将复合菌群接种于培养基培养后测定其羧甲基纤维素酶及滤纸酶活力 通过对培养温度、值、接种量 因素 水平正交试验发酵条件优化 确定复合菌群最佳产酶条件 宁露佳研究结果与本文试验结果相似 同一个菌株羧甲基纤维素酶和滤纸酶产酶最佳水平出现差异 通过分析正交试验结果的极差排序可以得出 本试验对于复合菌群 产羧甲基纤维素酶影响最大的因素是培养温度 其次是 值、接种量 对滤纸酶影响最大的因素是 值 其次是接种量、培 农业科学 农业与技术 养温度 影响羧甲基纤维素酶活极差顺序与滤纸酶活不同 但羧甲基纤维素酶活培养温度极差大于滤纸酶活 对羧甲基纤维素酶活影响较大 滤纸酶活 值极差大于羧甲基纤维素酶活 对滤纸酶影响较大 因而复合菌群 的羧甲基纤维素酶产酶能力最佳水平为 值 接种量 滤纸酶产酶能力最佳水平为 值 接种量 综合以上极差分析确定复合菌群 的产酶能力最佳水平为 值 接种量 复合菌群 同理 将酶活力主要影响因素极差分析作为确定复合菌群最佳产酶条件参考依据韩月颖采用单因素和响应面法优化菌株产酶条件 当 温度 时降解菌酶活力最高董雪丽等优化了纤维素降解菌发酵产酶条件 确定菌株最优产酶条件为 、接种量 于素素单因素试验结果初步确定复合菌系最佳产酶条件为接种量、郝建宇等采用响应面法对发酵温度、发酵时间和接种总量 个因素进行了研究设计 结果表明混合菌系最优参数是发酵温度、发酵时间 本试验与已有产酶条件优化研究结果相似 发酵培养 结果表明 值、培养温度、接种量影响复合菌群酶活力高低 结论本试验筛选出高效降解紫花苜蓿秸秆的复合菌群(细疣篮状菌 加青霉菌 )和复合菌群 (子囊菌属 加黄孢原毛平革菌 )培养温度对复合菌群的羧甲基纤维素酶产酶能力影响最大 值对复合菌群的滤纸酶产酶能力影响最大复合菌群 的产酶能力最佳水平为 值 接种量 复合菌群 的产酶能力最佳水平为 值 接种量参考文献 吕卓呈 李廷亮 谢英荷 等.夏闲期种植翻压绿肥作物对麦田土壤细菌多样性的影响.山西农业科学 ():.崔欣雨 李荣荣 蔡瑞 等.苜蓿青贮中乳酸降解菌的分离、鉴定及降解性能研究.生物技术通报 ():.().(.).祁娟 师尚礼 姚拓 等.复合菌肥与化肥配施对寒旱区苜蓿生长特性及土壤养分的影响.草原与草坪 ():.祁娟 姚拓 白小明 等.复合菌肥替代部分磷肥对苜蓿草地生产力及土壤肥力的影响.草业学报 ():.孟建宇 冀锦华 郭慧琴 等.常温纤维素降解细菌的筛选及其复合系的构建.生物学杂志 ():.宋雨 白红娟 胡锦俊 等.秸秆纤维素降解菌的分离筛选、复合菌系构建及产酶条件优化.中国酿造 ():.宫春杰.一株纤维素降解细菌的生物学特性研究.长春:东北师范大学.宁露佳.酒糟纤维素降解菌的筛选、发酵条件优化及应用.保定:河北大学.韩月颖.低温木质素降解菌的筛选、代谢产物分析及秸秆降解效果评价.长春:吉林农业大学.董雪丽 季静 张松皓 等.一株耐低温纤维素降解菌的发酵条件优化和秸秆降解研究.农业生物技术学报 ():.于素素.低温玉米秸秆降解菌的筛选及其复合菌系产酶条件优化.沈阳:沈阳农业大学.郝建宇 郑渊洁 侯红萍.降解玉米秸秆混合菌系的筛选及发酵工艺优化.纤维素科学与技术 ():.(责任编辑 常佳琪)