枯草芽孢杆菌BSNK-5合成γ-聚谷氨酸发酵工艺优化.pdf

Food and Fermentation Science&Food and Fermentation Science&TechnologyTechnology收稿日期：2022-10-27作者简介：李淑英（1979-），女，博士，副研究员。研究方向：食品微生物与功能性食品研究。*通信作者：范蓓（1981-），女，博士，研究员。研究方向：食药同源产品质量安全与品质评价；王凤忠（1972-），男，博士，研究员。研究方向：食品功能因子挖掘与功能性食品。引用格式：李淑英，侯丽真，高雅鑫，等.枯草芽孢杆菌BSNK-5合成-聚谷氨酸发酵工艺优化 J.食品与发酵科技，2023，59（4）：14-1950.枯草芽孢杆菌BSNK-5合成-聚谷氨酸发酵工艺优化李淑英，侯丽真，高雅鑫，李丹枫，田志良，文伟，范蓓*，王凤忠*（中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）摘要：基于-聚谷氨酸（-PGA）广泛的产业应用前景和微生物发酵产-PGA的潜力和优势，本研究对枯草芽孢杆菌BSNK-5合成-PGA的能力进行了探索。以BSNK-5为出发菌株进行摇瓶发酵，通过单因素实验和正交实验，优化BSNK-5发酵产-PGA的培养基成分和发酵条件。最终确定BSNK-5高产-PGA的最适发酵工艺：蔗糖25.0 g/L、氯化铵5.0 g/L、L-谷氨酸30.0 g/L、MgSO47H2O 0.5 g/L、K2HPO41.0 g/L、MnSO40.1 g/L、CaCl20.1 g/L、初始pH 7.5、接种量3.5%、发酵温度37、发酵时间48 h，在此条件下-PGA产量为1.617g/L，与未优化前（0.47g/L）相比产量增加了2.44倍。本研究为BSNK-5在-PGA的产业化应用提供了理论参考。关键词：-聚谷氨酸；枯草芽孢杆菌；发酵工艺；单因素实验；正交实验中图分类号：TS201.3文献标识码：A文章编号：1674-506X（2023）04-0014-0007Optimization of the Fermentation Process of-polyglutamicAcid Produced by Bacillus subtilis BSNK-5LI Shuying，HOU Lizhen，GAO Yaxin，LI Danfeng，TIAN Zhiliang，WEN Wei，FAN Bei*，WANG Fengzhong*（Key Laboratory of Agro-products Processing，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Food Science andTechnology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）Abstract：Based on the wide industrial application prospects of-polyglutamic acid（-PGA）and the potentialand advantages of microbial fermentation for-PGA production，this study was conducted to explore the abilityof Bacillus subtilis BSNK-5 to synthesize-PGA.BSNK-5 was used as the starting strain for shake flaskfermentation，and the medium composition and fermentation conditions for-PGA production by BSNK-5fermentation were optimized by single-factor test and orthogonal test.The optimal fermentation process for high-PGA production by BSNK-5 was finally determined as follows：sucrose 25.0 g/L，NH4Cl 5.0 g/L，L-glutamicacid 30.0 g/L，MgSO4 7H2O 0.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，MnSO40.1 g/L，CaCl20.1 g/L，initial pH 7.5，inoculationrate 3.5%，fermentation temperature 37，fermentation time 48 h.Under these conditions，the production of-PGA was 1.617 g/L，which increased 2.44 times compared with 0.47 g/L before optimization.This study providesgood theoretical reference for the industrial application of this strain BSNK-5 in-PGA.Keywords：-polyglutamic acid；Bacillus subtilis；fermentation process；single-factor experiments；orthogonalexperimentsdoi：10.3969/j.issn.1674-506X.2023.04-003李淑英等：枯草芽孢杆菌BSNK-5合成-聚谷氨酸发酵工艺优化第59卷（总第236期）李淑英等：枯草芽孢杆菌BSNK-5合成-聚谷氨酸发酵工艺优化-聚谷氨酸（-polyglutamic acid，-PGA）是两种不同构型的谷氨酸单体经过-酰胺键聚合而成的天然多肽分子1。-PGA拥有增稠、乳化、成膜、保湿等多种功能特征，且无毒、水溶、生物可降解2，其用途涉及食品3-4、化妆品5、生物医学68和环境保护9等领域，具有良好的应用前景和市场价值。-PGA常见的生产方式包括化学合成、酶转化和微生物发酵10。其中，微生物发酵具有易于控制、环境污染小、产量稳定、纯度高等特点，是目前我国生产-PGA工艺中应用最广泛的一种。-PGA生产菌大多为芽孢杆菌11-12，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）。目前，针对微生物合成-PGA的研究主要集中于提高表达量，具体措施包括优势菌种的选育、发酵条件等。学者们通过诱变、优化发酵菌株的发酵工艺等手段，显著提高了-PGA产量13-14。然而，我国微生物发酵制备-PGA的研究中仍然存在产量低、成本高等不足，限制了产业化推广15-16。因此，高产菌种的选育和工艺过程的优化仍然是今后-PGA大规模生产中提高产量和降低成本的主要焦点。实验室前期研究获得一株发酵性能优良，且高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌BSNK-5，但该菌株产-PGA方面的能力尚未进行探索。本文拟通过单因素实验和正交实验对BSNK-5产-PGA的发酵工艺进行优化，以确定关键影响因素并获得最佳工艺组合，以期最大可能地挖掘BSNK-5表达-PGA的能力，同时提升发酵原料的转化效率进而降低生产成本，为拓宽BSNK-5在-PGA工业化领域的应用奠定理论基础。1材料与方法1.1材料与试剂枯草芽孢杆菌BSNK-5，由实验室分离获得。-PGA，上海源叶生物科技有限公司；蔗糖、酵母粉、无水乙醇等试剂，国药集团化学试剂有限公司。1.2仪器与设备PHSJ-6L pH计，沐源（上海）环保科技有限公司；GR60DR 高压灭菌锅，美国 ZEALWAY 公司；HCB-900V洁净工作台，北京盛科信德科技有限公司；BLY-170WH恒温摇床，上海丙林电子科技有限公司；MGL-16MT离心机，美瑞克仪器（上海）有限公司；FD-1F-50T冷冻干燥机，上海舜制仪器制造有限公司；HM-SY96A酶标仪，山东恒美电子科技有限公司。1.3实验方法1.3.1发酵基础条件考虑到菌株的个体差异，本实验参考文献17-20 确定了基础发酵条件，种子培养基为Luria-Bertani（LB）培养基，发酵培养基为葡萄糖30.0 g/L、酵母粉7.0g/L、L-谷氨酸30.0g/L、MgSO47H20 0.5g/L、MnSO40.1 g/L、K2HPO41.0 g/L、CaCl20.1 g/L、初始pH 7.0。1.3.2菌株培养方法（1）初次活化：采用固体种子培养基活化菌株，37培养过夜。（2）二次活化：挑取活化好的单菌落至1020mL液体种子培养基内，37培养68h。（3）接种培养：将菌液以5500r/min离心15min，收集菌体，记录菌体重量，用无菌水将菌体溶解为0.1g/mL菌悬液，接种量3.0%，接入50mL发酵培养基，37培养48h。1.3.3-PGA提取工艺（1）去除菌体：将上述菌液调pH值至3左右，6500r/min离心20min，去除菌体，收集上清液，再将pH值调至7.0左右；（2）醇沉：在所得上清液中加入无水乙醇（1 2，v/v），室温静置2h或4过夜沉降；（3）粗品：沉降液12000r/min离心20min，收集沉淀；（4）二次醇沉：上述步骤中得到的粗品用一定体积的纯水进行溶解，加入无水乙醇（1 2，v/v），室温静置2h，再次离心收集沉淀；（5）-PGA样品：醇沉后的沉淀进行冷冻干燥，干燥后的物质即为-PGA样品。1.3.4-PGA产量测定采用CTAB比浊法21测定-PGA产量。称取样品10 mg，溶解并定容至10 mL，适当稀释后，准确加入 100 L 浓度为 6 g/L CTAB 溶液，反应 3 min，在 250 nm 条件下测定吸光度。以 10、20、40、60、80、100g/mL-PGA标准溶液绘制标准曲线，得到Y594.51X7.623 6，相关系数为 0.997 2，Y 表示-PGA浓度（g/mL），X代表吸光值。1.3.5单因素实验设计1.3.5.1最佳碳源及其最适浓度筛选参照基础发酵培养基配方，选取包括葡萄糖在内的四种碳源，分别为葡萄糖、柠檬酸、甘油、蔗糖，152023年第4期浓度为30.0 g/L，其他条件按“1.3.1”和“1.3.2”操作，每组实验3个平行。根据-PGA产量，确定最佳碳源。选择最佳碳源，设置浓度分别为 20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0g/L，其他条件不变，每组实验3个平行，以-PGA产量为评估标准，确定最佳碳源的最适浓度。1.3.5.2最佳氮源及其最适浓度筛选参照基础发酵培养基配方，以蔗糖作为最佳碳源，其他条件按“1.3.1”和“1.3.2”操作，选取氮源种类为酵母粉、大豆蛋白胨、氯化铵、蛋白胨，浓度为7.0 g/L，每组实验3个平行，根据-PGA产量，确定最佳氮源。选择最佳氮源，设置浓度分别为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0g/L，其他条件不变，每组实验3个平行，以-PGA产量为评估标准，确定最佳氮源的最适浓度。1.3.5.3最适初始pH值的筛选在明确最佳碳、氮源及其最适浓度的基础上，采用最佳培养基配方，其他条件按“1.3.1”和“1.3.2”操作，对合成-PGA的初始pH进行优化，初始pH分别为6、7、8、9、10，每组实验3个平行，以-PGA产量为评价标准，确定合成-PGA最适pH值。1.3.5.4最适培养温度的筛选以上述得到的最佳培养基配方及最适初始pH值为基础，对合成-PGA 的培养温度进行优化。设置温度分别为30、35、37、40，每组实验3个平行，以-PGA产量为评估标准，确定合成-PGA最适温度。1.3.5.5最适接种量的筛选以上述得到的最佳培养基配方及培养条件为基础，对合成-PGA的接种量进行优化，菌悬液活菌数在1.01061.0107CFU/mL范围内。接种量分别设置为2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，每组实验3个平行，以-PGA产量为评估标准，确定合成-PGA最适接种量。1.3.5.6最适发酵时间的筛选基于以上实验，对发酵时间进行优化，设置6个时间分别为12、24、36、48、60、72h，每个实验3个平行，以-PGA产量为评估标准，确定合成-PGA最适时间。1.3.6正交实验设计在上述实验的基础上，根据-PGA产量选择影响-PGA产量较大的前4个因素（蔗糖浓度、氯化铵浓度、接种量和初始pH值）进行4因素3水平的正交实验，以期获得最佳因素组合。每组实验3个平行。具体实验设计如表1所示。表1正交实验设计表Tab.1Orthogonal experimental design table因素水平123A 蔗糖浓度/（g/L）22.525.027.5B 氯化铵浓度/（g/L）4.55.05.5C 接种量/%3.54.04.5D 初始pH7.58.08.52结果与分析2.1BSNK-5合成-PGA的最佳工艺条件筛选2.1.1最佳碳源及其最适浓度筛选如图1a所示，以葡萄糖、柠檬酸、甘油、蔗糖为碳源时，BSNK-5发酵得到-PGA产量分别为0.47、0.48、0.98、1.12g/L。可见，以蔗糖为碳源时，发酵得到的-PGA产量最高，相比对照组葡萄糖为碳源时，显著提高了1.38倍（P0.05）。因此，选择蔗糖图1不同碳源（a）和不同蔗糖浓度（b）对BSNK-5合成-PGA产量的影响Fig.1Effect of different carbon source and different sucrose content on the synthesis of-PGA by BSNK-5注：不同小写字母表示差异显著（P0.05），下同。bbaa1.51.00.50.0聚谷氨酸产量/（g/L）葡萄糖柠檬酸甘油蔗糖碳源a1.01.21.41.61.8聚谷氨酸产量/（g/L）b10.020.030.040.050.0蔗糖浓度/（g/L）bacbccb16第59卷（总第236期）李淑英等：枯草芽孢杆菌BSNK-5合成-聚谷氨酸发酵工艺优化为BSNK-5发酵合成-PGA的最佳碳源。如图 1b 所示，蔗糖浓度的增加，引起其产量先增后降，然后趋于稳定的现象，其中，蔗糖浓度为 25.0 g/L 时，BSNK-5 合成-PGA 产量显著高于其他浓度（P0.05），达到1.50 g/L，相比对照浓度（30.0g/L），提升了0.34倍（P0.05），可能过高浓度的蔗糖引起了高渗透压，影响了BSNK-5菌株的生长22。因此，25.0g/L蔗糖是发酵培养基中最佳碳源及最适浓度。2.1.2最佳氮源及其最适浓度筛选以质量浓度为25.0g/L蔗糖为最适碳源，以酵母粉、大豆蛋白胨、氯化铵、蛋白胨为不同氮源探索其对-PGA产量的影响，如图2a所示，BSNK-5发酵得到-PGA产量分别为0.17、0.34、1.46、1.79g/L，蛋白胨为氮源时-PGA产量最大，其次是氯化铵，两者在产量方面无显著性差异（P0.05）。考虑到后续大规模产业化生产时，发酵原料的成本问题，最终选取无机氮源，即氯化铵为BSNK-5发酵产-PGA的最佳氮源。如图2b所示，随着氯化铵浓度的增加，其产量呈先降低后上升再趋于稳定的趋势，氯化铵浓度为5.0g/L时，BSNK-5合成-PGA产量最高，也显著高于对照浓度（7.0 g/L）的产量（P0.05），提高了0.20倍左右，高浓度的氮源可能超过了BSNK-5生长和-PGA合成所需的营养，抑制了菌株的生长代谢，引起了-PGA产量下降15。因此，选择5.0g/L为发酵培养基中氯化铵的最适浓度。2.1.3最适初始pH筛选如图 3a 所示，pH 值为 6、7、8、9 时，相对应的-PGA产量分别是1.10、0.97、1.38、0.87 g/L。可见初始pH值为8时，BSNK-5合成-PGA产量最高，与对照pH为7相比，显著升高了0.42倍（P0.05），所以确定最适初始pH值为8。2.1.4最适培养温度筛选如图3b所示，30、35、37、40 所对应的-PGA产量分别为0.66、1.13、1.54、1.62g/L。可见，随着温度的升高，BSNK-5合成-PGA产量呈上升趋势，但37、40条件下，-PGA产量差异不显著（P0.05）。综合考虑，最适培养温度仍旧保持在37。2.1.5最适接种量筛选如图3c所示，接种量2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，对应-PGA 产量分别为 1.01、1.07、1.41、1.12 g/L。可见，接种量为4.0%时，-PGA产量显著高于其他接种量（P0.05），与接种量3.0%相比，BSNK-5合成-PGA产量增加了0.32倍，因此将最适接种量确定为4.0%。2.1.6最适发酵时间筛选如图3d所示，发酵12、24、36、48、60、72 h对应的-PGA 产量分别为 0.36、0.60、1.05、1.61、1.19、1.12 g/L。可见，发酵时间为 48 h 时 BSNK-5 合成-PGA产量最高，且差异显著（P0.05），故仍旧选择48h为最适发酵时间。2.2BSNK-5合成-PGA的最佳工艺组合优化2.2.1正交实验优化最佳参数组合单因素实验结果表明，对-PGA产量影响较大的因素分别为蔗糖浓度、氯化铵浓度、接种量和初始pH，选择上述4个单因素设计3水平正交实验，确定BSNK-5发酵产-PGA的最佳参数组合。如表2所示，4个因素对-PGA产量的影响顺序依次为蔗糖浓度接种量氯化铵浓度初始pH。根据表中k值大小，得出最优条件组合为A2B2C1D1。根据实验结果，确定最佳条件组合为第五组，即A2B2C3D1。图2不同氮源（a）和不同氯化铵浓度（b）对BSNK-5合成-PGA产量的影响Fig.2Effect of different nitrogen source and different NH4Cl content on the synthesis of-PGA by BSNK-50.00.51.01.52.02.5聚谷氨酸产量/（g/L）酵母粉大豆蛋白胨氯化铵蛋白胨氮源cbaaa4.05.06.07.08.09.010.0氯化铵浓度/（g/L）1.31.41.51.61.71.81.9聚谷氨酸产量/（g/L）baaabb172023年第4期二者之间存在差异，需进行验证实验。2.2.2最佳参数组合验证按照A2B2C1D1与A2B2C3D1方案进行验证实验，比较两组方案中BSNK-5合成-PGA产量。结果如图4所示，A2B2C1D1组所得-PGA产量为1.617 g/L，略高于A2B2C3D1组（1.503 g/L），但两者之间无显著性差异（P0.05）。因此，确定BSNK-5制备-PGA最优参数组合为A2B2C1D1，即蔗糖25.0 g/L、氯化铵5.0g/L、接种量3.5%、初始pH 7.5。3讨论微生物法合成-PGA 因具有工艺简单、条件温和、环境友好等优点在产业应用方面显示了极大的潜力，然而-PGA产量偏低是其关键限速步骤，这也是近年来科研工作者集中发力的焦点。选育优异菌种和发酵工艺优化是领域内研究人员常实验号123456789k1k2k3RA1112223330.9330.9900.9110.079B1231231230.9270.9660.9420.039C1232313120.9750.9040.9560.071D1233122310.9600.9410.9330.027-PGA产量/（g/L）0.9600.9100.9300.9201.0371.0140.9000.9500.883表2正交实验结果与分析Tab.2The results and analysis of orthogonal experiment图3培养条件对BSNK-5合成-PGA产量的影响Fig.3Effect of culture conditions on the synthesis of-PGA by BSNK-5注：a.初始pH；b.发酵温度；c.接种量；d.发酵时间。2.01.51.00.50.0聚谷氨酸产量/（g/L）d122436486072发酵时间/hccbbba聚谷氨酸产量/（g/L）0.00.51.01.52.0a6789初始pHbbba聚谷氨酸产量/（g/L）0.00.51.01.52.0b30353740发酵温度/cbaa聚谷氨酸产量/（g/L）0.00.51.01.52.0c2.03.04.05.0接种量/%bbba图4正交实验验证结果Fig.4Verification results of orthogonal experimentA2B2C1D1A2B2C3D10.00.51.01.52.0聚谷氨酸产量/（g/L）aa18第59卷（总第236期）李淑英等：枯草芽孢杆菌BSNK-5合成-聚谷氨酸发酵工艺优化用的手段。基于微生物不同菌种和个体间的遗传背景差异，需要精准了解每个生产菌种的个性化营养需求和培养环境。本研究为探明BSNK-5合成-PGA的能力和挖掘其产业开发潜力，以-PGA产量为评价标准，对BSNK-5发酵合成-PGA需要的碳、氮源、初始pH值、接种量、培养时间等进行了系统优化。碳源是微生物生长代谢的首要能量源泉，也是限制微生物产业转化的主要成本要素。在微生物合成-PGA的碳源优化过程中，多位学者选取葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、麦芽糖、果糖、甘油、可溶性淀粉等作为碳源，均证实葡萄糖为唯一碳源时，高产-PGA20，23-24。本研究也对BSNK-5合成-PGA发酵培养基的最佳碳源进行了筛选，结果证实蔗糖是确保BSNK-5高产-PGA最佳碳源，而非葡萄糖。这也进一步印证了不同菌种之间的个体差异，导致其营养和代谢的个性化需求。氮源既能为微生物的代谢提供能量，又能作为含氮代谢物的必要前体物质来源，如氨基酸、核苷酸等。微生物的个体差异导致对有机和无机氮源利用能力的差异，有机氮源往往因成分复杂、营养多样而在微生物的生长代谢过程中显示了绝对优势。如王振强等25通过对培养基氮源的筛选，最终确定蛋白胨为合成-PGA的最佳氮源；而李海军等26对发酵氮源进行研究时发现，玉米浆、硫酸铵也可提高-PGA产量。本研究也分别选取了几种实验中常用的有机氮源和无机氮源对BSNK-5合成-PGA产量进行了筛选验证，从-PGA产量和成本综合考虑，最终确定氯化铵为BSNK-5合成-PGA发酵培养基的最佳氮源。除了微生物的个性化营养需求之外，培养条件也是影响其发酵合成-PGA的关键环节。常规因素包括培养基的初始pH、接种量、培养温度、发酵时间等。朱丹等27研究证实，发酵培养基初始pH为6.5时，枯草芽孢杆菌可高产-PGA；刘常金等28研究显示，初始pH 7.5、接种量2%、37培养48h，枯草芽孢杆菌合成-PGA 产量最高。本研究也对BSNK-5发酵生产-PGA的培养条件进行了筛选，最终确定初始pH 7.5、接种量3.5%、培养温度37、发酵时间48h时，-PGA产量最高，为1.617g/L。精准掌握微生物的个性化营养需求和代谢变化规律，是决定微生物快速生长和高效表达特征产物的关键环节，也是大规模产业化应用过程中高效生产和节能降耗的关键影响因素。除了本研究中关注的常规基础培养基成分和培养条件外，BSNK-5发酵生产-PGA还有很多需要探索研究的地方，如BSNK-5合成-PGA的过程中对农产品加工副产物的利用情况。此外，除了-PGA产量外，-PGA的高效富集、分子量的分级和产业用途的细分也是后期需要关注的重点。4结论本研究以实验室分离的高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌BSNK-5为出发菌株，通过单因素和正交实验，明确了碳源、氮源、初始pH和发酵时间是影响-PGA产量的主要因素；并进一步确定了BSNK-5高产-PGA最佳工艺参数组合：蔗糖 25.0g/L、氯化铵5.0 g/L、L-谷氨酸30.0 g/L、MgSO47H2O 0.5 g/L、K2HPO41.0 g/L、MnSO40.1 g/L、CaCl20.1 g/L、初始pH 7.5、温度37、接种量3.5%、发酵时间48 h，在此条件下，BSNK-5合成-PGA产量高达1.617g/L，相较优化前工艺（即单因素实验中以葡萄糖为碳源时的产量0.47g/L），产量提升了2.44倍，表明BSNK-5在-PGA领域具有良好的应用潜力。参考文献1 耿鹏，吴坤，蔡亚慧，等.-聚谷氨酸的合成及应用 J.许昌学院学报，2019，38（5）：92-95.2 刘宁.枯草芽孢杆菌发酵产聚谷氨酸及其分离纯化的研究 D.芜湖：安徽工程大学，2019.3 吴依莎，郦丹妮，周夏，等.-聚谷氨酸/淀粉复合膜对樱桃保鲜效果的影响 J.现代食品，2019（23）：168-172.4 李天密，屈思佳，韩俊华.壳聚糖/姜黄素/-聚谷氨酸可食性复合膜的制备及对培根和火腿的保鲜效果 J.食品科学，2019，40（17）：270-276.5 于林艳.聚谷氨酸降解、交联及在化妆品中应用研究 D.济南：山东大学，2016.6 张少飞.聚谷氨酸肽类树状大分子的制备及其溶血栓应用研究 D.兰州：兰州大学，2018.7 MA J，ZHANG J P，CHI L，et al.Preparation 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