奶牛胚胎移植技术.doc

奶牛胚胎移植技术上海交通大学农业与生物学院朱淑文一、概述牛胚胎移植的商业化应用开始于七十年代初期。当时，必须通过手术方法才能采集胚胎，由于奶牛的乳房影响手术的顺利进行，手术后往往还会影响奶牛以后的繁殖性能，因此，胚胎移植主要在肉牛中应用。1976年，一些研究小组报道了应用导管高效采集胚胎的非手术方法。随后，胚胎移植在奶牛中的应用得到了飞速发展。1974年，第一头胚胎移植登记荷斯坦奶牛在美国出生。七十年代后期，胚胎移植（ET）登记荷斯坦奶牛的数量每年以100%以上的速度增长，1980年达到8298头年。进入80年代后，随着非手术采胚法和移植技术的改进以及胚胎冷冻保存技术的发展，每年（ET）登记奶牛的数量在稳步增长，至1990年达到18727头年。截止1991年，美国登记的胚胎移植荷斯坦奶牛总数量已达到142598头。目前，44%的荷斯坦优秀种公牛是由胚胎移植培育的。九十年代以来，胚胎移植在发达国家中的增长速度有所减缓，但是技术含量越来越高，例如体外受精胚胎生产技术、转基因技术以及克隆技术的应用和研究得到加强。近几年来，胚胎移植在亚洲和南美一些国家中增长速度很快。从整个世界范围来看，牛胚胎移植的增长速度仍然很快。二、胚胎移植技术（一）体内受精胚的移植1 超数排卵在常规胚胎移植技术中，获得大量可用胚胎的主要途径是超数排卵（简称超排），因此，高效率的超排技术是胚胎移植技术能否在生产中推广应用的关键。应用于奶牛的超排激素主要有PMSG（孕马血清促性腺激素）和FSH（促卵胞素）。PMSG尽管只需一次性注射，省时省力，但是半衰期过长，可以导致卵巢的过度刺激以及对排卵、受精和随后的胚胎发育产生不利的影响，因此现在一般已不采用PMSG对奶牛进行超排处理。目前广泛应用于母牛的超排激素是FSH。用于奶牛超排的商品FSH均是从屠宰家畜的脑垂体中提取的，脑垂体不但能够分泌FSH，而且还能分泌LH，因此商品FSH制剂中都含较高水平的LH，不同厂家或同一厂家不同批次FSH制剂中的LH含量差异很大，所以商品FSH制剂的超排效果很不稳定。从理论上讲，在卵泡发育的早期，只有FSH对卵泡生长起启动和刺激作用，LH不起作用。只有在卵泡发育的晚期，卵泡颗粒细胞才开始出现LH受体，此时LH和FSH才起协同作用，共同促进卵泡的进一步生长和类固醇激素的合成。LH和FSH的协同促卵泡生长作用必须有一个合适的比例，LH含量过高可以导致生长卵泡的闭锁或黄体化。这一机理就是商品FSH制剂超排效果不理想的重要原因之一，国内外的许多报道事例已经证明了这一点。目前，加拿大生产的超纯度FSH（商品名Follrtropin）是世界公认的最理想的牛用超排药物。用Follrtropin进行的大规模商业超排处理结果显示，平均A、B级胚胎数为8.8/枚头次，我们利用中科院动物所提纯生产的FSH，在北京十三个奶牛育种场进行了大规模超排试验，试验结果表明：该激素的超排效果有些批次的效果很好；有些批次效果不理想。另据报道，牛的超排效果和摄入的营养水平有很大关系。奶牛为产奶目的而饲喂的日粮一般为高蛋白低能量日粮，即蛋白水平一般为17%；但这种日粮不利于奶牛多出胚胎。为了使奶牛多出胚胎，应降低日粮的蛋白水平，增加能量水平，最理想的办法是在超排处理前两周时，将蛋白水平降至12%，同时补饲大麦、玉米等高能量饲料。此外，在超排前适当补充复合维生素制剂也有利于提高牛的超排效果。超数排卵方法 超数排卵（超排）的目的时为了增加有活力卵子的数量。通常在供体牛发情周期的功能性黄体期，一般在母牛发情周期的914天，肌肉注射PMSG或者FSH，以刺激卵巢产生额外的卵泡。待处理后供体牛再次发情时静脉注射LH或者HCG，以诱导卵泡排卵。但对成年母牛一般不需要外源LH或者HCG。 近年来，由于前列腺素F2及其类似物如前列烯醇在超排方法上的应用，增加了超排处理的机动性，可在供体母牛发情周期的功能性黄体期的任何一天处理，而且增加了可用胚胎的比例。母牛在PG注射后的23天大多出现发情。 对超排处理的供体牛输精需23次，间隔12h，每次的输精量要大于正常的输精量，应保证有足够的有效精子。2供体和受体牛的准备 供体牛选择的首要条件是其遗传学价值及其健康和繁殖情况，所以，确定供体前需作必要的检查，经确定后要加强饲养管理，观察发情，确定正确的发情周期。每头供体牛需要准备5头受体牛，两者的发情开始时间前后相差不超过一天。 在一般情况下，不易找出若干头自然发情与供体牛发情时间相同的受体牛，所以在胚胎移植时往往采用对供体与受体牛进行同期发情处理。同时对供体牛进行超数排卵处理。3 胚胎移植 在胚胎移植中，胚胎最终必须移植到合适的受体牛中才能受胎妊娠，产下优秀后代，因此受体牛的准备非常重要。在准备受体牛时，除了无繁殖疾病等一般要求外，重点应该考虑发情同期性问题。一般来说，受体牛与供体牛发情同期差在4!天内时，即发情后第563天的受体牛受胎效果比较理想。许多研究结果证明，发情时间早于供体牛的受体牛，其移植受胎率高于发情时间晚于供体的受体牛，如发情后第3天的受体牛，其移植受胎率高于发情后第5天的受体牛。其原因可能是发情后第3天的受体牛，其黄体功能更完善。综上所述，要提高胚胎移植受胎率必须人同期性上选择合适的受体牛。此外，对于发情时间稍晚于供体胚胎日龄的受体（即不到发情后第七天的受体），注射孕酮有利于受胎。4 妊娠诊断（1）直肠检查法通常在移植后1.53.0个月进行直肠检查,此时子宫继续增大，落入腹腔，可感觉到胎儿的浮动，子宫角出现孕脉,子宫壁可以触到子叶。（2） 超声波诊断一般可在移植天后检查,利用探头通过直肠轻轻的在子宫角上滑动，在荧光屏上可观察到中间灰白色周围黑色的图象胎儿。（3） 妊娠后的饲养管理在移植后7090天对受体牛进行妊娠检查，对已妊娠的受体要加强饲养管理,避免应激反应。妊娠受体在产前3个月要补充足量的维生素、微量元素，适当限制能量摄入，既要保证胎儿的正常发育，又要避免难产。根据当地的疾病发生情况，有目的地注射一些疫苗，以防胎儿流产或传染病发生。 （二）体外受精胚的移植1 卵母细胞采集和体外成熟培养将屠宰后的奶牛卵巢用灭菌生理盐水将卵巢洗涤3-5次，除去表面血迹，盛于大烧杯中。用吸水纸将表面擦干。然后用吸有少量采卵液的5ml一次性注射器和18号针头，从卵巢表面26mm的卵泡内抽吸卵泡液及卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs），注意不要将血液混入卵泡液中，以免影响卵母细胞的体外成熟和受精。将抽取的卵泡液和COCs注入灭菌试管内，于38.5恒温水浴锅内静置15min，弃取上清液，将下层液体倒入直径690mm的灭菌培养皿内，在体视显微镜下采卵。2体外受精和胚胎发育将冷冻精液在38恒温水浴锅中溶解，用灭菌吸水纸擦干精液管外水分，置于10ml灭菌离心管中，缓慢加获能液至8ml，用2000转/分速度离心5min，去除上清。重复定容离心一次，弃去上清，留置1ml，用血球计数板检测精子浓度，用受精液将精子浓度稀释至57105个/ml。观察精子活力，并制成0.4ml的浮游小滴。将体外成熟的卵母细胞，在受精液中洗2次，每个受精小滴中移入20-25枚卵母细胞，在CO2培养箱中（38.5，5%CO2，95%空气）体外受精5h后。用成熟培养液将受精卵洗2次，然后将受精卵转移含卵丘细胞的成熟培养基中，继续培养（38.5，5% CO2，95%空气）43h。观察卵裂率，继续培养至囊胚，用于移植或冷冻。三、 开展牛胚胎移植需要做的准备工作和效益1 胚胎移植人员的准备：在牛的胚胎移植中, 供体的超数排卵、采胚、受体的选择、同期发情、发情鉴定、非手术移植、胚胎的冷冻和解冻、胚胎的质量评定和分级等, 都需要实践的积累, 尤其是直肠检查等需靠手感觉的技术。培养一个熟的技术人员需要2-3年的时间。本项技术的操作对卫生和无菌要求也较高。由于技术环节多,环环相连,一个环节的失误将导致整个操作过程的效率下降和失败。操作过程中的质量控制和技术把关十分重要。2 胚胎移植的环境问题：要有一个能满足胚胎离体条件下短时间内不被污染和生活能力不受影响的环境条件,配备相应的仪器设备,适宜而稳定的温度条件等。这些条件虽然不甚复杂,投入也不算大,但必须按要求认真设计,购置和安排。3 胚胎来源：胚胎移植产业化中,最关键的条件之一是要有稳定的胚胎来源。目前, 国外平匀每次每头供体可生产可用胚6-8枚, 国内一般在6枚左右。只有建立或确定相应的供体群才能保证胚胎的供应。其次，可利用胚胎切割和其他胚胎生物技术, 如胚胎卵裂球和分离培养、性别鉴定等, 增加胚胎的利用率和扩大胚胎的来源。4 受体母牛选择的策略：受体牛与供体牛在遗传和生产性能上相差越大，在牛改良上意义越大，两者市场价格相差越大,牛胚胎移植技术的经济汇报越好。在选择受体母牛时，我们还需要考虑总体效益。利用当地土杂种母牛作受体，一代换种，改良效果显著，在农牧区农户饲养时，成本低,投入少，但是如果是舍饲集中饲养，则成本较高。受体牛必须健康,有正常的繁殖力和发情周期，并且发情天数与供体牛或胚龄相同。在我国农牧区的条件下，由于营养状况和饲养管理条件的影响，利用当地黄牛作受体,受胎率通常低约5-10%。5 有效的组织工作： 胚胎移植要求各环节的时间及处理程序十分严格，在产业化的实际操作中组织工作非常重要，在某种程度上讲,往往组织工作比技术工作的难度更大，不重视这个问题很可能是事倍功半或前功尽弃。工作条件和组织工作，从技术实施的角度来说，开展胚胎移植工作只要有供体母牛制作好的胚胎，一定数量的受体母畜，技术人员和设备即可。目前多数地方的组织工作并不理想，工作点分散，可用牛只少，工作效率低，非完善不可。6 利用胚胎移植技术，提高土种牛养殖的经济效益：胚胎移植可最大限度地发挥良种母牛的繁殖潜力。母犊卵巢上约有12万个原始卵泡以上，10岁左右的母牛卵巢上仍有约25000个卵泡。牛的繁殖周期较长,依靠自然繁殖，无论多么优秀的母牛，一生只能产10头左右。利用胚胎移植技术优秀母牛每年可获得516头后代， 技术水平高者可获得30-50头后代，超过它一生的繁殖成绩，迅速扩大良种的数量。用胚胎移植技术可以扩繁良种牛。从国外或国内购买优秀良种胚胎，直接移植给本地黄牛，每枚胚胎的价格约1500元左右，以50% 的成功率计算，每出生一头良种，胚胎费用为3000元，母牛饲养费和犊牛饲养费用约为2000元，总成本约为5000元，而到一岁左右的良种牛市场售价约在2万元左右。如果把母牛犊继续培养至18月年龄,进行超数排卵生产胚胎,每年可生产胚胎10-20枚,收入约在2万元左右。从国内外购进成年优秀良种肉牛，通过超数排卵生产胚胎，移植给本地黄牛，购买成年良种肉牛母牛约需3万元，每牛可生产膈胎10-20枚,收入约为2万元左右。利用胚胎移植技术可大量扩繁奶牛。在我国农区，养牛一般以役用黄牛为主。如果产的牛犊是黄牛犊,一般母牛犊900-1500元，公牛犊约500-1000元。若采用胚胎移植技术,让黄牛怀上奶牛，按目前市场价格小母牛（育成牛）3-8月龄，5000-8000元，母牛8-18月龄，8000-1200元，前三胎经产母牛（带胎3-8个月，带奶），15000元左右。7 利用胚胎移植技术实现“土牛生金牛”的畜牧经济模式：1998年，根据农业部科技司推荐的方法计算，奶用良种胚胎移植后代育成后，平均每头比土种牛增加的年总经济效益为3.5万元左右。现在全国年产犊牛数按5000万头计算，按照每年胚胎移植牛占%计算，年总经济效益将高达175亿元,市场潜力巨大。长期以来,我国养牛以役用为主，奶用为辅，还没有肉用的专用品种，改良牛的比例只占30%，生产性能很低，远远不能满足人民生活水平以及现代农业发展的需要。依靠进口的良种牛改良土种牛，需要大量外汇，而利用国内现有成熟的牛胚胎移植技术，既能节约资金，又能加快繁育改良步伐。数十年来，我国科学家使用传统育种方式，取得了一定的成果，但品种改良速度缓慢，不能使我国牛群品质结构迅速优化，利用胚胎移植技术将大批的黄牛和水牛改良成“奶牛”，将改变数千年来中国黄牛和水牛仅做耕牛的状况，使其既可耕作又可产奶，不仅为广大农民提供了增收新手段，也为中国百姓提供了更有营养的乳产品，实现优质种群的迅速扩繁，真正实现“土牛生金牛”的愿望。