基于高效指纹图谱和网络药理学的琥珀消石颗粒质量标志物预测.pdf

基金项目：国家自然科学基金面上项目（）；中华中医药学会青年求实项目（）作者简介：赵琦（），男，博士研究生在读，研究方向：中西医结合治疗泌尿男科疾病研究，：通信作者：李曰庆（），男，本科，主任医师，研究方向：中西医结合治疗泌尿男科疾病研究，：中药研究基于高效指纹图谱和网络药理学的琥珀消石颗粒质量标志物预测赵琦李海松闫菲王继升米新宝赵聪张华南李曰庆（北京中医药大学东直门医院男科，北京，；北京中医药大学东直门医院皮科，北京，）摘要目的：基于高效指纹图谱和网络药理学预测琥珀消石颗粒（）中质量标志物（）。方法：构建 的高效液相色谱（）指纹图谱检测手段，指认共有峰和归属；应用网络药理学技术构建 的“成分 靶点 通路”网络图，预测其潜在 。结果：的指纹图谱结果共指认出 个共有峰；网络药理学确定了 种关键组成、个潜在核心靶点和 条重要通路，初步预测槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷、蜕皮甾酮、槲皮素、山柰素为 潜在的 。结论：通过高效指纹图谱和网络药理学分析预测了 中的 ，方法科学并且可重复，为 的质量标准提供依据，也为今后系统研究其作用机制提供研究基础。关键词琥珀消石颗粒；高效指纹图谱；网络药理学；质量标志物；槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷；蜕皮甾酮；抗炎；抗氧化 ，（，；，）：（）（）：（）“”：，（），：，；（）；中图分类号：；文献标识码：琥珀消石颗粒（，）主要成分有琥珀、海金沙、金钱草、牛膝、郁金等，主要具有清热利湿、通淋消石之疗效。临床中用于石淋、血淋湿热瘀结证者 。目前，被收录于 卫生部药品标准中药成方制剂第十八册，然而标准中仅使用薄层色谱方法进行质量控制，方法可重复性低，且不能很好地进行全面质控。现有的临床研究已经证明 在泌尿系感染及泌尿系结石方面有较好疗效，但是其作用机制仍不够全面，这也为 上市后再评价及药效学等研究提出了新的挑战。众所周知，中药有“多成分 多靶点”的特性，仅对单一化合物的检测很难全面代表全方药效，而且中药成分的复杂性更严重影响了复方质量标准控制，因而在 年刘昌孝院士提出了质量标志物（，）的概念，是中药材质控的全新方法 。近年来，中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的鉴定方法，能更详细了解中药中所包世界中医药 年 月第 卷第 期括的化合物质，专门用于中药质量控制，是研究中药复方药效组成的关键方法 。网络药理学建立在高通量测序、系统生物学的基础上，通过搭建“药物靶点 疾病”立体生物学网络，能够更好地了解药物和药物、药物和靶点之间作用关系，从而更加全面了解中药药效特性，阐释复方临床应用的科学内涵 。因此，本研究将联合高效液相色谱（，）指纹图谱与网络药理学技术，从“多成分 多靶点”角度，更加系统、科学地对 进行质量控制，预测其发挥药效的 ，为今后 的质控和分子机制研究提供前期依据。仪器与试药 仪器液相色谱仪（日本株式会社岛津制作所，日本，型号：）；电子天平（梅特勒 托利多仪器有限公司，瑞士，型号：）；电子天平（梅特勒 托利多仪器有限公司，瑞士，型号：）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：）。试剂乙腈（色谱纯，公司，美国，货号：）；甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，货号：）；甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，货号：）；磷酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，货号：）；三氟乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，货号：）。分析样品对照品槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷（批号：），购自成都克洛玛生物科技有限公司；对照品山柰酚 芸香糖苷（批号：）、蜕皮甾酮（批号：）、槲皮素（批号：）、山柰酚（批号：），均购自中国食品药品检定研究院。批（批号：、）样品，由北京中医药大学东直门医院提供。方法与结果 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长为 ，柱温；进样量 ；流动相为 三氟乙酸（）乙腈（）。梯度洗脱：，；，；，；，；，；，；，。对照品溶液的制备分别取槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷、蜕皮甾酮、槲皮素、山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每 含槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷 、山柰酚 芸香糖苷 、蜕皮甾酮 、槲皮素 、山柰素 的混合对照品溶液。供试品溶液的制备取 适量，除去包衣，研细，取约 ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 甲醇 ，称重，超声处理（，），取出，放冷，再称定重量，用 甲醇补足减失的重量，放冷，滤过，即得 供试品溶液。方法学考察 精密度试验取同一供试品溶液，连续进样次，记录色谱图，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（，）；将所得的色谱图进行相似度分析，结果显示其相似度大于 ，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱研究要求。供试品溶液稳定性试验取同一供试品溶液，分别在 、进样，记录色谱图，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 ；将所得的色谱图进行相似度分析，结果显示其相似度大于 ，表明 内供试品溶液稳定性良好，符合指纹图谱研究要求。重复性试验取同一批样品，按照上述方法制备 份供试品溶液，分别进样，记录色谱图，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 ；将所得的色谱图进行相似度分析，结果显示其相似度大于 ，表明方法重复性良好，符合指纹图谱研究要求。指纹图谱的建立取 批 按以上初步筛选确定的琥珀消石颗粒指纹图谱测定方法测定，记录色谱峰，得到 批次 高效液相色谱图。见图 。将 批 色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（版），得到 批 在 波长下的指纹图谱。见图。设 为参照图谱，采用中位数法，时间窗为 ，经过峰谱多点校正，标记峰匹配后生成共有模式的对照指纹图谱，并计算 批琥珀消石颗粒中共有峰的相似度。，图 标准指纹图谱图 琥珀消石颗粒 指纹图谱共有模式注：为 批琥珀消石颗粒指纹图谱；为琥珀消石颗粒指纹图谱对照图谱 共有峰指认分别制备琥珀消石颗粒样品、各个单味药饮片的供试品溶液及混合对照品溶液，分别采集指纹图谱。将琥珀消石颗粒样品色谱图中各共有峰与药材饮片、混合对照品的色谱峰进行比对，共指认 个共有峰，分别是 号峰槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、号峰山柰酚 芸香糖苷、号峰 蜕皮甾酮、号峰槲皮素、号峰山柰素。相似性分析对 批琥珀消石颗粒的高效液相色谱图进行分析，以 号峰 蜕皮甾酮为参照峰，以参照峰的保留时间和峰面积为 ，分别计算各共有峰的保留时间相对值和峰面积相对值，采用“中药色谱指纹图谱相似性评价系统”（版）对指纹图谱数据进行分析，计算 批琥珀消石颗粒与对照指纹图谱之间的相似性。批琥珀消石颗粒与对照指纹图谱之间的相似性在 ，各批次与对照指纹图谱之间的相似性均 。见表 。由此可见，批琥珀消石颗粒总体相似性较高，说明本实验使用的 批琥珀消石颗粒质量较为稳定。表 批 共有峰保留时间相对值编号 世界中医药 年 月第 卷第 期续表 批 共有峰保留时间相对值编号 平均值 （）表 批 共有峰峰面积相对值编号 平均值 （）表 批 相似性分析结果编号相似性编号相似性 网络药理学预测 预测方法 化合物 靶点预测检索中药系统药理学分析平台及相关数据库，包括中药系统药理学数据库与分析平台（，）、中药分子机制生物信息学分析工具（，）、中槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷、蜕皮甾酮、槲皮素、山柰素相关靶点，建立化合物 靶点数据集。网络构建将靶点数据集导入 数据库（：，）中进行蛋白质 蛋白质相互作用（，）分析。筛选条件选择为“”，选择最小 分值为 ，构建 网络。将 结果导入 软件进行网络图展示，网络中靶点用“节点”表示，节点与节点间关系用“边”表示。富集分析为全面了解筛选靶点作用机制，将 上 述 靶 点 导 入 数 据 库（：）进行基因本体（，）富集分析和京都基因与基因组百科全书（，）富集分析。富集分析主要可注释靶点的功能和定位，包括生物过程（，）、细胞组分（，）和分子功能（，）。可获得候选靶点所富集的信号通路，筛选关键信号通路，建立“成分 靶点 通路”网络。预测结果 活性成分 靶点预测共检索到槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷、蜕皮甾酮、槲皮素、山柰素对应的 个靶点。网络构建 网络图中共获得 个节点，个边，根据“度”值可获得靶点重要性排 ，序，其中前 位靶点为信号转导及转录激活因子（，）、白细胞介素 （，）、肿瘤坏死因子（，）、白细胞介素 （，）、转录因子 （，）、白细胞介素 （，）、基质金属蛋白酶 （，）、转录因子 （，）、白细胞介素 （，）、趋化因子配体 （，）。见图 。图 核心靶点 网络 和 富集分析 富集分析结果显示，作用靶点在 上显著富集在氧化应激、脂质代谢、应激反应等过程；主要分布在细胞外空间、膜筏、膜微域、细胞质等部位；主要富集在蛋白结合、调控转录因子、促进激酶结合等。见图。富集分析结果显示，作用靶点显著富集在高级糖基化终产物（，）高级糖基化终产物受体（，）、促分裂原激活蛋白激酶（，）、低氧诱导因子（，）、白 细 胞 介 素 （，）、松弛素（）、磷脂酰肌醇 激酶（，）蛋 白激酶（，）等信号通路。选择 排名前 位条目绘制气泡图进行可视化展示。见图 。图 核心靶点 功能富集分析图 富集通路分析 “活性成分 靶点 通路”网络构建“活性成分 靶点 通路”网络发现槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷、蜕皮甾酮、槲皮素、山柰素 种活性成分连接度（）值均较高，均可能为 发挥药效的活性成分，可作为本品潜在的 ；核因子激活的 细胞的 轻链增强（，）、为 值较高，可能为 治疗的潜在重要靶点；、信号通路 值差异性较小，可能为 的关键信号通路。见图 。讨论泌尿系结石，又叫“尿石症”，属于中医学“石淋”“腰痛”等范畴，是中医外科常见病、多发病。临床应用于本病治疗，方中组成金钱草、赤小豆、当归、海金沙、琥珀、鸡内金、牛膝、蒲黄、郁金。本方以琥珀、赤小豆为君药，琥珀为金石重镇之品，配伍赤小豆化瘀通淋效果更佳。琥珀化石通淋多在古籍文献中记载，本草经疏 云：“琥珀，专入血分。世界中医药 年 月第 卷第 期图 “活性成分 靶点 通路”网络心主血，肝藏血，入心入肝，故能消瘀血也。”仁斋直指方 中单用琥珀为散，灯心汤送服治疗泌尿系结石。金钱草、海金沙为君药，清热利湿，通淋排石。鸡内金化瘀止痛，通淋化石，与金钱草、海金沙配伍构成中医化石经典“三金”角药；与当归、郁金、蒲黄共为佐药，活血化瘀，增强化石之力；牛膝为使药，行气活血，引药下行，全方共奏清热利湿、活血化瘀之功，临床疗效较好 。中药复方制剂成分多样，具有多组成、多靶点、多种干预机制等特点，允许中医药能够从多角度干预疾病，这既是中医药优势所在，也为研究中医药科学内涵带来巨大挑战。本研究通过建立 指纹图谱，指认其共有峰，对中药成分进行网络药理学分析，初步筛选 作用的关键靶点和通路，系统分析了 的潜在药理机制，为后续开展实验研究，以及中药质量控制建立重要基础。本实验在优化试供品提取溶媒时，考察了不同比例溶媒（乙醇、甲醇、甲醇），结果表明，以 甲醇为提取溶剂时，色谱峰峰数相对较多、峰面积值大、整体基线好，因此选择此浓度作为提取 溶 媒。对 超 声 提 取 时 间（、）进行考察，个不同超声提取时间对色谱峰的影响无显著差异，最终选择超声提取时间为 。在优化色谱条件时，对样品在 全波长扫描 ，发现检测波长为 时，色谱峰峰数较多，且各色谱峰分离良好，基线平稳，故选择 为检测波长；比较柱温、时色谱图，当柱温为 时，各色谱峰的分离度较好，故确定柱温为 ；考察了甲醇 磷酸溶液、乙腈 甲酸溶液、乙腈 磷酸、乙腈 三氟乙酸等不同溶剂系统 ，结果显示以乙腈 三氟乙酸为流动相进行梯度洗脱时，色谱峰分离效果较好，且基线平稳，各峰形明显改善。通过指纹图谱，本研究初步测定了槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷、蜕皮甾酮、槲皮素、山柰素作为 潜在的 。根据文献研究，测定了槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷为金钱草的重要成分，主要具有抗炎、抗氧化、调节免疫作用 。研究证明槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷对氧化应激造成肾小管损伤具有保护作用，减少了草酸钙晶体对细胞的黏附 。蜕皮甾酮是牛膝的主要成分，具有改善细胞凋亡、抗氧化等作用 。槲皮素和山柰素是金钱草、当归、牛膝的共有组成，具有显著的抗炎、抗氧化作用 。根据可测性和可溯性特点，以上 种成分均可以得到指认，因此将以上 种成分确定为候选化合物。网络药理学分析的结果表明，的 种成分可作用于核因子 ，该蛋白是参与炎症和免疫调控的重要转录因子，能够促进炎症介质 、等的释放，进而参与结石生成 。家族成员包括 、等，主要参与增殖、分化、细胞凋亡、氧化应激等过程 。有研究已经证实微循环中氧化应激反应升高能够促进肾草酸钙结石形成，并伴有 水平升高 。由活化的巨噬细胞产生，介导全身炎症反应，参与结石生成 。通路富集分析表明，主要参与调节免疫、炎症等信号通路。信号通路是机体关键通路，广泛调控细胞增殖、分化 。当受到炎症、缺氧等不利因素刺激时，信号通路会被过度激活，导致细胞增殖异常，组织修复障碍，结石生成 。是应对缺氧而被激活的主要转录因子，在缺氧条件下，与基因组中的缺氧反应元件结合，介导下游细胞凋亡、血管生成等过程 。研究表明，蛋白的激活诱导下游 相互作用蛋白 （，），表达，促进细胞凋亡及结石生成 。可见，网络药理学预测的结果与现有文献研究较一致，表明以上研究结果准确性较高。中的这 种成分可通过作用于多种靶点，干预多条通路进而发挥药效作用，也证明了本次指纹图谱筛选的结果具有一定科学性。综上所述，本研究结合高效指纹图谱和网络药理学初步确定了槲皮素 （鼠李糖基）芸香糖苷、山柰酚 芸香糖苷、蜕皮甾酮、槲皮素、山柰素为 潜在的 ，为中药量化评价与辨识提供了全新的方式，避免了药物质控中仅以单一成分作为复方评价的唯一标准的问题。本研究的局限在于，通过网络药理学发现药理活性成分和靶点是理论预测的结果，应通过实验进行验证，后续研究将集中于使用动物实验和临床研究来验证该假设，以提高临床用药的合理性和科学性。利益冲突声明：无。参考文献 陈静，孙云霞，沈洪，等 琥珀消石颗粒治疗胆石症肝胆湿热、气血瘀滞证的临床研究 中国合理用药探索，（）：徐柳汀，余琴，温晋俭 体外震波碎石术后联合琥珀消石颗粒辅助排石的临床效果研究 世界最新医学信息文摘，（）：，费建功 琥珀消石颗粒配合针灸治疗泌尿系结石临床应用研究 中国校医，（）：曹军，邓汝波 琥珀消石颗粒在 上尿路结石患者中的疗效观察 临床医药文献（连续型电子期刊），（）：白钢，张铁军，刘昌孝 基于监管科学的中药质量评价方法的整合研究思路和发展方向 中草药，（）：李正，杨欢，陈碧莲 基于指纹图谱和网络药理学对舒筋活血片的质量标志物预测分析 中国现代应用药学，（）：帅丽霞，陈旺，袁袁，等 基于指纹图谱和网络药理学对经典名方二冬汤质量标志物（）预测分析 中草药，（）：庄延双，蔡宝昌，张自力 网络药理学在中药研究中的应用进展 南京中医药大学学报，（）：世界中医药学会联合会 网络药理学评价方法指南 世界中医药，（）：刘玉刚，张石军，刘龙，等 琥珀消石颗粒对肾脏草酸钙结石大鼠 通路及炎症应激反应的影响 海南医学，（）：马治中，李志斌 琥珀消石颗粒对肾结石模型大鼠肾组织病理改变及血中炎症因子的影响 医药导报，（）：刘双晶，李建朋，王彦志，等 基于代谢组学的川牛膝治疗膝骨关节炎的作用机制研究 中国中药杂志，（）：唐敏，孙飞，梁生旺，等 基于 的蒲黄指纹图谱和多成分含量测定方法研究 中药材，（）：傅咏梅，黄后楷，张文芳，等 金钱草标准汤剂特征图谱的建立及与混淆品的差异研究 广东药科大学学报，（）：陈云，徐璐娜，王翰华，等 基于 指纹图谱的不同产地金钱草及其地方习用品与混用品的鉴定研究 中草药，（）：曹明明，车琳琳，朱路文 金丝桃苷药理作用及机制研究进展 辽宁中医药大学学报，（）：张文通，李俊，吴玉婷，等 山柰酚 芸香糖苷对血管平滑肌细胞增殖、迁移及 信号通路活化的影响 中国病理生理杂志，（）：，（）：赵立敏，王琦，张勇 蜕皮甾酮应用于心血管疾病的研究进展 世界中医药，（）：傅月朦，余登香，王淑娜，等 山豆根黄酮类成分药理作用及机制研究进展 中草药，（）：李珂如，胡光强，吴安国，等 山柰酚及其衍生物在神经系统疾病中的药理作用研究进展 西南医科大学学报，（）：徐旭红，孙建明，张伦中，等 大蒜素通过抑制 表达和 通路活化对大鼠肾结石形成的作用研究 生物技术进展，（）：，：，：翁雨天，黄茜，杨旭娟，等 通路在脑缺血再灌注损伤中的研究进展 中国实用神经疾病杂志，（）：张曼，戴建业，张齐，等 基于 信号通路探讨大黄灵仙方对胆管细胞炎性反应的影响效果 中华中医药学刊，（）：，后插 贺德华，张华，王以兵，等 汉黄芩素对肾结石大鼠肾损伤修复作用及 信号通路的调节作用研究 中南药学，（）：，：，：万金艳，龙宇，张羽璐，等 信号通路在糖尿病肾病中的作用及中药干预的研究进展 中草药，（）：王瑞，安熠，韩晗，等 基于 通路探讨排石冲剂对草酸钙肾结石大鼠的作用机制 湖北中医药大学学报，（）：田晋帆，宋现涛，贺毅，等 低氧诱导因子 在微循环障碍中的研究进展 中国医药，（）：屈卫龙，乔楠，张弛，等 疏肝利胆汤治疗急性结石性胆囊炎的疗效及网络药理学机制 中国实验方剂学杂志，（）：（收稿本文编辑：张乐杰）世界中医药 年 月第 卷第 期