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口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 211 基于RNA测序的SHED体外连续扩增后差异表达基因的研究王慧慧1，吴 情1，赵玉梅2（1.复旦大学附属上海市第五人民医院口腔科，上海200240；2.同济大学口腔医学院，同济大学 附属口腔医院儿童口腔科，上海牙组织修复与再生工程技术中心，上海200072）摘要 目的：利用 RNA 测序（RNA sequencing，RNA-seq）技术研究人脱落乳牙干细胞（stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth，SHED）体外长时期扩增至 20 代（P20）后基因表达的差异，初步探讨其体外扩增衰老相关的信号通路。方法：从健康儿童脱落的乳牙中分离牙髓干细胞，在常规条件下将其扩增培养至 20 代，利用 RNA-seq 筛选出差异表达的基因，并对其进行相关生物学信息分析，寻找 SHED 体外连续扩增衰老相关的信号通路。结果：RNA-seq结果显示，SHED 第 4 代（P4）和 P20 代差异表达的基因共有 1 884 个，其中上调表达的基因有 575 个，下调表达基因 1 309 个，这些差异表达的基因分布在生物过程（biological progress，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）等生物学过程中。早、晚期代次的 SHED 差异基因及相关蛋白之间的作用主要富集在剪接体、核糖体、细胞周期、p53 通路相关的信号通路上。结论：本研究揭示了 SHED 体外连续扩增培养至第 20 代后基因表达谱的改变，为后续进一步研究其细胞体外衰老机制指明了方向。关键词人脱落乳牙干细胞；体外连续扩增培养；RNA 测序；细胞衰老中图分类号 R782;R788 文献标志码 ADOI：10.12439/kqhm.1005-4979.2023.04.002Differentially expressed genes of SHED based on RNA-seq analysis after long-term expansion in vitroWANG Huihui1,WU Qing1,ZHAO Yumei2(1.Department of Stomatology,Shanghai Fifth Peoples Hospital,Fudan University,Shanghai 200240;2.Department of Pediatric Dentistry,Stomatological Hospital and Dental School of Tongji University,Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration,Shanghai 200072,China)Abstract Objective:To investigate the differences in gene expression of stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth(SHED)after long-term continuous subculture to passage 20(P20)in vitro by RNA sequencing(RNA-seq)analysis technolo-gy,and to preliminarily explore their signaling pathways related to in vitro expansion and aging.Methods:SHED were isolated from deciduous teeth of healthy children in mixed dentition stage and subculture to P20 under the standard condition.RNA-seq was performed to identify the differentially expressed genes among different cell passages,then the relevant biological information was analyzed to explore the senescence related signal pathway of continuous amplification of SHED in vitro.Results:RNA-seq re-sults showed that a total of 1 884 genes were differentially expressed in SHED at passage 4(P4)and P20,including 575 up-regulated genes and 1 309 down-regulated genes.Gene ontology analysis indicated that the differentially expressed genes were distributed in biological processes(BP),cell composition(CC)and molecular function(MF).Moreover,the pathways most enriched for differentially genes and related proteins were mainly concentrated in the spliceosome,ribosome,cell cycle and p53 pathway related signaling pathways.Conclusion:This study revealed that the changes of gene expression profile of SHED after continuous amplification culture to the 20th generation in vitro,which indicated the direction for the further study of in vitro senescence mechanism of SHED.Keywordsstem cells derived from human exfoliated deciduous teeth;long-term expansion in vitro;RNA sequencing;cell senescence收稿日期：2022-11-07接受日期：2022-12-09基金项目：上海市闵行区自然科学研究课题（2020MHZ030）作者简介：王慧慧，住院医师.E-mail：通信作者：赵玉梅，主任医师.E-mail：基础研究口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 212 Miura 等1于 2003 年从人脱落乳牙牙髓中分离培养出一群具有自我更新、多向分化能力的人脱落乳牙干细胞（SHED）。因其来源广、易于获得、对患者无损伤等优点，近年来在组织工程和干细胞治疗领域中广受关注。然而原代培养获得的 SHED 数量有限，难以满足组织工程和干细胞治疗的需求，因此必须在体外对其进行连续扩增培养。课题组前期研究2表明，SHED 在体外扩增培养至 20 代后会出现复制性衰老现象：细胞增殖速率下降、多向分化潜能改变、凋亡细胞及 SA-gal 阳性的细胞数增多等，从而使其后续应用受到了很大阻碍。有研究3发现，人脐带间充质干细胞在体外扩增培养过程中逐渐衰老，细胞形态和表型均发生变化，基因表达谱也出现了明显的改变，其差异基因涉及多条信号通路，如 DNA 修复、G1/S 信号通路等，这些变化限制了人脐带间充质干细胞的临床应用，但目前关于 SHED 体外扩增培养后基因表达谱的变化及体外衰老相关的信号通路未有研究报道。因此，探究 SHED 体外衰老机制，探索 SHED 体外扩增衰老过程中关键因子及信号通路，对增强 SHED在组织工程和细胞治疗中的应用，降低临床应用风险具有重要意义；另一方面，也能为研究其他类型的间充质干细胞体外衰老提供良好的实验基础和参考依据。随着生物信息学的发展，转录组测序技术，即RNA 测序（RNA-seq）已逐渐成为当代生物医学研究中主要的深度测序技术。它的研究对象为某一细胞在特定的功能状态下所转录出的全部 RNA的总和，包括 mRNA、非编码 RNA 及小 RNA，通过高通量检测，从而实现对某一物种的特定组织或器官所有转录组序列进行细致、全面的分析4。利用 RNA-seq 技术获得样本的原始序列，然后对测序数据进行处理、生物信息学分析以获取各样本之间差异表达的基因，再通过差异表达基因的基因本体（gene ontology，GO）功能分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析，从而能够寻找到关联的信号通路5-6。本实验在前述研究的基础上，通过对 SHED 在体外连续传代前后的转录组进行测序，探讨 SHED体外复制性衰老的相关信号通路，为进一步探索SHED 体外衰老机制提供理论基础。1材料和方法1.1实验标本、试剂和仪器1.1.1实验标本本实验选用的乳牙来自就诊于同济大学附属口腔医院儿童口腔科因乳下中切牙度松动需要拔除的患者（在患者及监护人知情同意下）。1.1.2主要试剂和仪器DMEM/F12 培养液（Gibco公司，美国）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；双抗（100 U/mL 青霉素，100 g/mL 链霉素）（Gibco 公司，美国）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美国）；磷酸盐缓 冲 液（phosphate buffered saline，PBS)（Gibco 公 司，美 国）；人间充质干细胞鉴定试剂盒（BD 公司，美 国）；TRIzol（Sigma 公 司，美 国）；氯 仿、异 丙 醇、无 水 乙 醇（国 药 集 团，中 国）；焦 碳 酸 二 乙 酯（diethyl-pyrocarbonate，DEPC）水（博士德公司，中 国）；TransScript RT reagent Kit with gDNA Ereaser试剂 盒（TaKaRa 公 司，日 本）；SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa 公司，日本)；流式细胞仪（BD 公司，美国）；-80 超低温冰箱（Thermo 公司，美国）；NanoDrop 2000 超微量分光光度计（Thermo 公司，美国）。1.2细胞培养和鉴定收集的乳牙用 PBS 冲洗后取出冠根髓，剪成0.51.0 mm3大小的组织块，并将其转移至培养皿内，静置 30 min 左右，待组织块贴壁后，向培养皿中缓慢加入适量培养液，标记为原代细胞（P0），置于 37、5%CO2恒温培养箱中培养。每3天换液1次，倒置相 差显微镜下观察、监测，待细胞汇合至 80%90%时进行传代。参照试剂盒说明书：常规胰蛋白酶消化收集 SHED 第 4、20 代（P4、P20）细胞，用滤网过滤，制备单细胞悬液，调整细胞密度至 1107个/mL。标记流式细胞管并分别加入相应荧光标记的抗体：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的小鼠抗人 CD90 抗体（5 L）；藻红蛋白（phy-coerythrin，PE）标记的小鼠抗人 CD44 抗体（5 L）；串联染料标记的小鼠抗人 CD105 抗体（5 L）；别藻青蛋白标记的小鼠抗人 CD73 抗体（5 L）；人间充质干细胞同型阳性对照（20 L）、藻红蛋白标记的人间充质干细胞同型阴性对照（20 L）；人间充质干细胞阳性对照(20 L)、藻红蛋白标记的口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 213 选出差异表达基因富集的具体通路。2结果2.1SHED 的分离培养和鉴定P4 代 SHED 呈梭形的成纤维细胞样，细胞生长具有极性，呈螺旋状、集落状生长（图 1A）；P20 代 SHED 体积增大，形态不均一，胞内颗粒增多（图 1B）。流式细胞仪检测培养至 P4 和 P20 代的 SHED，结果显示，P4（图 1C）和 P20 代（图 1D）SHED 均高表达间充质干细胞阳性标志（95%）：CD44、CD90、CD73 和 CD105；低 表 达 阴 性 标 志（2%）：CD11b、CD19、CD34、CD45 和 HLA-DR，符合国际干细胞治疗协会规定的间充质干细胞表面抗原标志物表达的标准7。这些结果表明，P4 和P20 代 SHED 具有间充质干细胞的免疫表型特征。P4 和 P20 代 SHED 增殖能力、多向分化能力检测相关结果参见课题组前期研究2。2.2测序质量控制为了保证测序数据质量，要在数据分析之前对得到的原始数据进行质量控制。通过 Illumina HiSeq 2000 测序技术得到各样本（共 6 个）总原始数据序列（raw reads）和原始碱基数（raw bases）后，对原始数据进行预处理，将原始数据中低质量、带有接头的序列过滤出去，得到有效序列数（clean reads）和碱基数（clean bases）。94%95%的碱基序列能够比对到基因组和转录组，平均序列长度（mean read length）为 150 bp，各样本测序获得的碱基中，大于等于 Q30（Q30：测序错误率 0.1%的碱基数目比例）所占的百分比均在 89%以上。通过对测序数据进行评估（表 1），结果显示，转录组测序数据质量良好，满足分析要求。2.3主成分分析（principal component analysis，PCA）和系统树图聚类分析对质量合格的各样本测序数据进行 PCA，以揭示样本之间的联系。转录组测序中基因表达量水平主要依靠 FPKM（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）来衡量，即每百万个片断中映射到外显子的每千个碱基上的片断数。然而，FPKM 是一个高维矩阵，无法直接判断其空间分布。通过 PCA，能够找到几个主要的变量，最大限度地解释原始数据中的大部分变异，从而达到降维的目的。我们选取解释方差最大的 2 个成分，绘制二维人间充质干细胞阴性对照（20 L）。向各流式细胞管内加入 100 L 上述细胞悬液。避光条件下冰上孵育 30 min，PBS 洗 2 次后重悬至 500 L，用流式细胞仪进行检测。1.3SHED RNA 的提取和定量采用 TRIzol 法分别提取 SHED P4 和 P20 代细胞（每组 3 个样本；样本编号：SHED P4-1、SHED P4-2、SHED P4-3、SHED P20-1、SHED P20-2、SHED P20-3）的总 RNA。弃去 P4 和 P20 代 SHED 培养液，用 PBS轻轻漂洗，分别加入 1 mL TRIzol，将培养皿水平放置片刻，用枪头轻轻吹打培养皿底部至细胞全部脱落。将上述含细胞的裂解液转移至 1.5 mL 不含 RNA 酶的 Eppendorf（EP）离心管中，用枪头反复吹吸使细胞完全裂解，冰上静置 5 min。加入 200 L 氯仿，盖上管盖，剧烈振荡混匀，冰上静置10 min。于4 条件下，以 12 000 r/min 离心 10 min，转移上层清液到新的EP管内。向EP管内加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，冰上静置 10 min，于 4 条件下，以 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液。加入 500 L 75%乙醇（DEPC-ddH2O和无水乙醇配制），于 4 条件下，以 12 000 r/min 离心 5 min，清洗 RNA 沉淀。超净台内风干 RNA 沉淀后，加入 20 L 不含 RNA 酶的 ddH2O 溶解 RNA。在NanoDrop 2000 上检测 RNA 浓度和纯度，配制 1%的琼脂糖凝胶电泳以检测抽提出的 RNA 的完整性。1.4cDNA 文库构建在提取到的样本总 RNA 中分别加入裂解液将mRNA 打断成较短的片段。然后，以 mRNA 为模板，使用六碱基随机引物合成 cDNA 的第一条单链。依次加入脱氧核糖核苷酸三磷酸、核糖核酸酶 H、DNA 聚合酶和缓冲液合成第二条 cDNA 链。经过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒纯化双链 cDNA 后，加入 EB 缓冲液洗脱，随后对其进行末端修复，加碱基 A 并连接测序接头，进行 PCR 扩增，建立测序 cDNA 文库。1.5SHED RNA-seq上述 cDNA 文库构建完成后，进行定量、检测，确保 cDNA 文库质量合格。然后利用 Illumina HiSeq 2000 测序技术对上述细胞的转录组序列进行测序，结合加权基因共表达网络构建（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）的方法，分别比较 P4 和 P20 代 SHED 的基因表达谱数据，寻找体外复制性衰老相关信号通路和关键调控基因，筛口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 214 表 1各样本转录组测序数据统计Table 1Transcriptome sequencing data of each sample样本编号原始数据序列数有效序列数有效序列/%平均序列长度/bp 碱基 Q30/%SHED P4-142 477 43040 504 09795.3515090.70SHED P4-246 054 15244 034 07895.6115091.25SHED P4-342 583 27240 407 75994.8915089.53SHED P20-145 591 45243 509 35995.4315090.62SHED P20-243 272 98841 310 85395.4715091.08SHED P20-353 988 11051 611 76995.6015090.90?-?-?A.P4 代 SHED 的形态（100）；B.P20 代 SHED 的形态（100）；C.流式细胞仪检测 P4 代 SHED 的表面标志物；D.流式细胞仪检测 P20 代 SHED的表面标志物。图 1SHED 的形态特征和表面标志物Figure 1The morphological characteristics and cell surface markers of SHED散点图，基因表达模式相似的样本会成簇聚集在一起（图 2A）。接下来，再利用 Clustal 软件（都柏林大学，爱尔兰）对各样本测序数据进行系统树图聚类分析，分别对 P4 与 P20 代 SHED 进行聚类，发现它们各自聚为 2 类（图 2B）。2.4差异表达基因分析差异表达基因分析的目的是分别找出 SHED同种细胞早、晚期不同代次之间差异表达的基因。将用来衡量基因表达量水平的 FPKM 值绘制 SHED差异基因表达热图（图 3），其中，绿色表示低表达，红色表示高表达，从中筛选出每比较组差异表达（上调和下调）的基因（表 2）。2.5差异基因功能富集分析对上述筛选出的差异基因进行 GO 功能分析、KEGG 通路富集分析和 PPI 网络分析（图 4）。GO功能分析主要分为生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）3 个部分。GO 分析可见 P4 和P20 代 SHED 差异基因在 BP、CC、MF 条目上均有富集（图 4A）。通过 KEGG 通路分析，寻找 SHED 不同代次引起的差异基因表达主要与哪些细胞通路的改变有关，结果发现，P4 和 P20 代 SHED 的大部分差异基因主要富集在剪接体、核糖体、细胞周期、p53通路相关的信号通路上（图 4B）。通过 PPI 分析，我们可以看到在显著富集通路上蛋白与蛋白之间的口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 215?-?-?-?-?-?-?-?-?-?-?-?-?-?-?-?A.转录组数据 PCA；B.转录组数据系统树图聚类分析。图 2P4 和 P20 代 SHED PCA 和系统树图聚类分析Figure 2PCA and system tree cluster analysis of SHED at passage 4 and passage 20?-?-?-?-?-?-?-?-?图 3P4 和 P20 代 SHED 差异表达的基因热图Figure 3Heatmap shows the different expression genes of SHED at P4 and P20表 2P4 和 P20 代 SHED 差异基因表达数目统计Table 2Statistics of the different expression genes of SHED at P4 and P20样本总差异基因数上调基因数下调基因数SHED P20/SHED P41 8845751 309增、多向分化等方面显示出良好的优势。另外，由于SHED 容易获得，对机体无损伤，且伦理压力小，是组织工程和干细胞治疗中相对优越的种子细胞8。研究9-10表明，间充质干细胞在体外连续扩增培养后会出现复制性衰老和一些生物学特性的改变，比如细胞增殖速率下降、恶性转化、端粒长度变短、多向分化能力改变、干细胞特性丧失等，这些性能的改变使间充质干细胞应用于临床受到很大程度上的阻碍，也增加了其临床应用的风险。间充质干细胞衰老与 DNA 损伤、端粒长度缩减、线粒体功能障碍等息息相关。目前有许多研究11试图了解其衰老机制，但仍不清楚。SHED 作为一种未成熟关系。P4 和 P20 代 SHED（图 4C）之间差异基因编码的蛋白之间的相互作用主要集中在剪接体、核糖体、细胞周期、p53 通路相关的信号通路上，在蛋白水平方面验证了 KEGG 富集分析的结果。3讨论SHED 来源于儿童替牙期的乳牙，被认为是一种未成熟的间充质干细胞，其在细胞增殖、群体倍口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 216?-?-?-?-?-?-?A.差异表达基因的 GO 分析；B.KEGG 通路富集分析；C.PPI 网络分析。图 4P4 和 P20 代 SHED 差异表达基因功能富集分析Figure 4Functional enrichment analysis of different expression genes in SHED at P4 and P20口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 217 的间充质干细胞，在临床治疗及科学研究中往往需要大规模培养，涉及细胞长期体外扩增的步骤。然而，长期扩增就会导致复制性衰老，从而改变细胞的供给、表型和功能。课题组前期实验2表明，体外长扩增培养至第 20 代的 SHED 虽然仍具有间充质干细胞特异性表面标志物，但其生长能力停滞，分化能力明显减弱，凋亡细胞数增多，已不适用于干细胞治疗。然而，目前基于 SHED 长时期体外扩增导致复制性衰老的研究极少，体外扩增过程中基因表达谱的改变、衰老相关的信号通路及相关的调控因子均不明确。因此，了解 SHED 体外长期扩增后衰老的特征、潜在的机制及调控因子至关重要。RNA-seq 是近年来迅速发展起来的转录组定量分析技术。本研究通过 RNA-seq 测序获得的原始数据序列经过预处理后，各样本测序获得的碱基中，大于等于 Q30 所占的百分比均在 89%以上，数据质量合格，可用于后续的生物信息学分析。实验结果表明，第 4 和 20 代 SHED 差异表达的基因共有 1 884 个，其中上调表达的基因有 575 个，下调表达基因 1 309 个，这些差异表达的基因分布在 BP、CC 和 MF 等生物学过程中。然后，我们通过基因富集和蛋白质相互作用分析发现，早、晚期代次的 SHED 差异基因及相关联的蛋白之间的作用主要富集在剪接体、核糖体、细胞周期、DNA 复制、p53 等信号通路上。Yi 等12的研究阐明了人牙髓干细胞衰老后，其增殖、分化能力均受到损伤，并且发现调控细胞周期、RNA 转运等功能的信号通路可能与牙髓干细胞衰老相关，这与本实验的结果是一致的。细胞周期、DNA 复制与细胞衰老后的表征密切相关，已有实验10,13表明，间充质干细胞发生复制性衰老后，会出现 DNA 复制减弱、DNA 损伤加剧、细胞周期停滞等现象。剪接体是 RNA 剪接时形成的多组分的复合物，主要由小分子的核 RNA 和蛋白质组成。目前关于剪接体与细胞衰老之间的关系研究相对较少。2016 年，有学者14用全基因组剪接分析技术发现随着年龄的增长，组织细胞中选择性剪接基因随之增多，于是提出选择性剪接在细胞衰老过程中起着重要作用。研究15表明，核糖体 RNA 基因重复序列的不稳定性可加速细胞衰老，从而影响细胞寿命。这些研究结论与本实验研究结果相似。p53 信号通路是目前普遍公认的与细胞衰老相关的信号通路。研究16表明，无论是在应激、损伤状态下引起的衰老，还是与发育相关的自然衰老过程中，p53/p21 通路都发挥着重要的作用。目前，p53、p21 和 p16 已广泛地用于研究衰老相关分子标志物。衰老细胞细胞周期阻滞信号主要集中在 p53-CDKN1A(p21)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)-CDKN2A(p16)通路上17。细胞周期 G1/S 期阻滞就是由于 p53、p21 和 p16 水平升高，从而抑制细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的形成而导致的18。这也与课题组前期研究19在分子水平得出的 p53/p21 通路可能与 SHED 体外扩增引起的复制性衰老密切相关的结论是一致的。本实验结果表明，SHED 体外复制性衰老是一个复杂的过程，剪接体、核糖体、细胞周期相关的通路及 p53 信号通路均可能参与到这一过程中，但具体的机制仍需要进一步研究验证。这些结果加深了我们对 SHED 体外长时期扩增后细胞衰老相关机制的认识，为今后我们进一步研究细胞体外衰老相关机制提供了方向。未来的研究我们不仅要明确衰老相关差异表达基因背后的分子机制及调控因子，更要进一步确定延缓 SHED 体外扩增衰老的潜在机制，开发可行策略，保留其细胞特性，以期将SHED 更好地应用于基础科学研究和临床治疗中。参考文献：1 Miura M,Gronthos S,Zhao MR,et al.SHED:Stem cells from human exfoliated deciduous teethJ.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(10):5807-5812.2 王慧慧,赵玉梅.体外连续扩增对乳牙源牙髓干细胞生物学特性的影响 J.口腔颌面外科杂志,2017,27(3):172-178.3 宁雪,李栋,汪大琨,等.脐带间充质干细胞体外衰老过程中生物学特性及基因表达谱的变化 J.中国实验血液学杂志,2012,20(2):458-465.4 Wang Z,Gerstein M,Snyder M.RNA-Seq:A revolutionary tool for transcriptomicsJ.Nat Rev Genet,2009,10(1):57-63.5 Ashburner M,Ball CA,Blake JA,et al.Gene ontology:Tool for the unification of biology.The Gene Ontology ConsortiumJ.Nat Genet,2000,25(1):25-29.6 Kanehisa M,Furumichi M,Tanabe M,et al.KEGG:New perspectives on genomes,pathways,diseases and drugs J.Nucleic Acids Res,2017,45(D1):D353-D361.7 Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria 口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 218 for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement J.Cytotherapy,2006,8(4):315-317.8 Kashyap R.SHED-basic structure for stem cell research J.J Clin Diagn Res,2015,9(3):ZE07-ZE09.9 Rsland GV,Svendsen A,Torsvik A,et al.Long-term cultures of bone marrowderived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformationJ.Cancer Res,2009,69(13):5331-5339.10 Bonab MM,Alimoghaddam K,Talebian F,et al.Aging of mesenchymal stem cell in vitroJ.BMC Cell Biol,2006,7:14.11 郭旬会,魏文娟,关心,等.微环境调控间充质干细胞复制性衰老的研究进展 J.生理学报,2022,74(3):469-478.12 Yi QA,Liu OS,Yan F,et al.Analysis of senescence-related differentiation potentials and gene expression profiles in human dental pulp stem cellsJ.Cells Tissues Organs,2016,203(1):1-11.13 Wagner W,Horn P,Castoldi M,et al.Replicative senescence of mesenchymal stem cells:A continuous and organized processJ.PLoS One,2008,3(5):e2213.14 Rodrguez SA,Grochov D,McKenna T,et al.Global genome splicing analysis reveals an increased number of alternatively spliced genes with agingJ.Aging Cell,2016,15(2):267-278.15 Kobayashi T.Ribosomal RNA gene repeats,their stability and cellular senescenceJ.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci,2014,90(4):119-129.16 Muoz-Espn D,Serrano M.Cellular senescence:From physiology to pathologyJ.Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(7):482-496.17 Martnez-Zamudio RI,Robinson L,Roux PF,et al.SnapShot:Cellular senescence pathwaysJ.Cell,2017,170(4):816-816.e1.18 Childs BG,Gluscevic M,Baker DJ,et al.Senescent cells:An emerging target for diseases of ageingJ.Nat Rev Drug Discov,2017,16(10):718-735.19 Wang HH,Zhong Q,Yang TS,et al.Comparative charac-terization of SHED and DPSCs during extended cultivation in vitroJ.Mol Med Rep,2018,17(5):6551-6559