基于HPLC指纹图谱及网络药理学的杜仲质量标志物预测分析.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1283-1296基于HPLC指纹图谱及网络药理学的杜仲质量标志物预测分析曾梅，王朝晖1-2,王志辉12,龙雨青，曾娟”，周新茹，周日宝1.2.3，刘湘丹1.2.3*女1湖南中医药大学药学院；湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室；3湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，长沙410 2 0 8摘要：通过建立杜仲不同部位HPLC指纹图谱分析方法，结合网络药理学预测杜仲潜在质量标志物。基于中药质量标志物（Q-Marker）的理论依据，结合指纹图谱和网络药理学对杜仲Q-Marker进行初步预测分析，对6 3批杜仲不同部位样品进行相似度评价，同时分别进行主成分分析（PCA)及偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）；通过网络药理学筛选杜仲相关成分的靶点和通路，构建“成分-靶点-通路”网络图,预测杜仲的Q-Marker。本研究建立了6 3批杜仲不同部位的指纹图谱，相似度均大于0.9 0 0，经筛选得到8 个化合物，17 3个靶点，包括PIK3R1、H R A S、A K T 1、EG FR、SRC等11个核心靶点，涉及氨代谢、癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、癌症蛋白聚糖、PI3K-Akt信号通路、卵巢类固醇生成等主要通路,并构建成分-靶点-通路图。预测绿原酸、芦丁、京尼平苷为杜仲叶潜在Q-Marker,桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷为杜仲皮潜在Q-Marker,京尼平苷酸、京尼平苷、桃叶珊瑚苷为杜仲雄花潜在Q-Marker,将绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷为杜仲果荚潜在Q-Marker。关键词：杜仲不同部位；指纹图谱；网络药理学；质量标志物；靶点；通路中图分类号：R284.1D01:10.16333/j.1001-6880.2023.8.001Predictive analysis of Eucommia ulmoides quality markers based on文献标识码：AHPLC fingerprint and network pharmacology文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)8-12 8 3-14ZENG Mei,WANG Zhao-hui-2,WANG Zhi-hui-2,LONG Yu-qin,ZENG Juan,ZHOU Xin-ru,ZHOU Ri-bao-2.,LIU Xiang.-dan-2.3.College of Pharmacy,Hunan University of Traditional Chinese Medicine;2 Hunan Key Laboratory of Germplasm Resources and Standardized Cultivation of Large and Authentic Medicinal Materials;3 Hunan Provincial Key Laboratory of Modernization of Traditional Chinese Medicine,Colleges and Universities,Changsha 410208,ChinaAbstract:The potential mass markers of Eucommia ulmoides were predicted by establishing an HPLC fingerprint analysismethod for different parts of E.ulmoides combined with network pharmacology.Based on the theoretical basis of traditionalChinese medicine(TCM)quality markers(Q-Marker)combined with fingerprint mapping and network pharmacology for pri-mary prediction analysis of Q-Marker of E.ulmoides,63 batches of samples from different parts of E.ulmoides were evaluatedfor similarity,along with principal component analysis(PCA)and partial least squares discriminant analysis(PLS-DA),re-spectively;Through network pharmacology to screen the targets and pathways of related ingredients in E.ulmoides,a ingredi-ent target pathway network diagram was constructed to predict Q-Marker in E.ulmoides.In this study,we established 63 bat-ches of fingerprints from different parts of E.ulmoides with similarity scores greater than 0.900,which were screened to obtaineight compounds and 173 targets,including 11 core targets including PIK3R1,HRAS,AKT1,EGFR,SRC,and other majorpathways involved in ammonia metabolism,cancer pathways,lipids and atherosclerosis,cancer proteoglycans,PI3K Akt signa-ling pathway,and ovarian steroidogenesis,and constructed component target pathway maps.Chlorogenic acid,rutin and geni-收稿日期:2 0 2 3-0 2-0 1基金项目：国家现代农业产业技术体系资助（CARS-21）；湖南省中医药管理局科研项目D2022131（A 2 0 2 2 0 0 5-9）;2 0 2 0 年湖南省一流专业建设点：中药资源与开发（2 0 2 0-2 48）；湖南中医药大学中药学一流学科项目（2 0 18-3）*通信作者Tel:86-731-88458233;E-mail:,paeonia_接受日期:2 0 2 3-0 5-311284poside were predicted to be potential Q-Marker for E.ulmoides leaves,aucubin,geniposidic acid and pinoresinol diglucoside werepredicted to be potential Q-Marker for E.ulmoides bark,geniposidic acid,geniposide and aucubin were predicted to be potential Q-Marker for E.ulmoides male flower,chlorogenic acid,geniposidic acid,aucubin were identified as potential Q-Marker for E.ulmoidespods.Key words:different parts of Eucommia ulmoides;fingerprint pattern;network pharmacology;Q-Marker;targets;pathways杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）为杜仲科（Eu-commiaceae）杜仲属（Eucommia）植物，单属单种，主产陕西省、四川省、河南省、湖南省、湖北省、重庆市、贵州省、山东省、甘肃省、江苏省和山西省等地,其中湖南慈利为杜仲之乡,杜仲资源丰富。杜仲传统以树皮入药,在我国有两千多年的用药历史,其味甘、性温,有补肝肾、强筋骨、安胎等功效 。杜仲叶于2015年新收录入中华人民共和国药典，现为药食同源试点品种,市场常见有杜仲茶等产品。杜仲雄花在杜仲产地也常作茶用；杜仲果荚一般作为胶的提取原料。市场杜仲产品质量参差不齐，2 0 2 0 年版中华人民共和国药典中杜仲皮、叶含量测定项下仅对松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸进行控制,杜仲化学成分种类较为复杂，制定合理的杜仲质量标准、保障杜仲质量，是呕待解决的问题，刘昌孝院士于2 0 16 年提出了中药质量标志物（Q-M a r k e r)概念 2 ,后有专家将质量标志物归纳为“五原则”3，为中药质量控制提供了科学依据。网络药理学是基于系统生物学理论，借助统计学、复杂网络等数学手段，强调对生物系统的网络分析以及反映中药药效成分的理化和生物学性质,在分子水平上诠释中药多成分与机体的网络作用关系，为探索中药复杂作用模式提供了新的视角 4；指纹图谱是目前较为成熟的发现不同批次产品共有成分的方法。基于此,本研究采用高效液相色谱（HPLC)法建立杜仲（皮、叶、果荚、雄花）的指纹图谱，再利用产地采收时间样品编号品种PlaceHarvestingSample No.Varietyof originS1湖南慈利华仲5号S2湖南慈利华仲8 号S3湖南慈利华仲10 号S4湖南慈利华仲12 号S5湖南慈利密叶杜仲天然产物研究与开发网络药理学方法对杜仲成分、靶点、通路进行整理分析方法预测杜仲不同部位潜在的Q-Marker,从而建立杜仲（皮、叶、果荚、雄花）的质量控制研究方法，以期为杜仲（皮、叶、果荚、雄花)的质量控制以及作用机制研究提供参考。1材料与方法1.1仪器高效液相色谱仪（Agilent1260二极管阵列检测器，德国安捷伦公司）；ZORBAXEclipsePlusCi：色谱柱(2 50 mm 4.6 mm,5 m)。1.2材料对照品桃叶珊瑚苷（批号19 12 2 40 4，质量分数98%）、京尼平苷酸（批号19 10 140 2，质量分数98%）、绿原酸（批号19 10 140 2，质量分数9 8%）、京尼平苷（批号2 10 9 2 7 0 8，质量分数9 8%）、松脂醇二葡萄糖苷（批号2 0 0 1140 1，质量分数9 8%）、芦丁（批号18 0 7 19 0 7，质量分数9 8%）、紫云英苷（批号2 0 12 16 0 2，质量分数9 8%）、皮素（批号21032401,质量分数9 8%）,均购于成都普菲德生物科技公司；磷酸（天津市恒心化学试剂制造有限公司，分析纯）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；乙腈（色谱纯）。28批不同品种、不同产地杜仲叶样品、15批不同产地及采收期杜仲皮样品、10 批不同产地杜仲果荚样品、10 批不同产地及采收时间杜仲雄花样品，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为杜仲（Eucom-miaulmoidesOliv.）的不同部位。样品具体信息见表1。表1杜仲不同部位样品信息表Table 1 Sample information of different parts of E.ulmoides采收部位site叶叶叶叶叶Vol.35采收部位采收时间样品编号产地HarvestSample No.time2021.06.202021.06.202021.06.202021.06.202021.06.20品种Place of originVarietyS33湖南慈利江垭S34湖南慈利零阳镇地方种S35湖南慈利三合镇地方种S36湖南慈利象市镇地方种S37湖南慈利溪口镇地方种Harvestingsite地方种树皮2021.05树皮2021.06树皮2021.05树皮2021.05树皮2021.04HarvesttimeVol.35续表 1(Continued Tab.1)样品编号Sample No.S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20S21S22S23S24S25S26S27S28S29S30S31S32曾梅等：基于HPLC指纹图谱及网络药理学的杜仲质量标志物预测分析产地采收部位品种PlaceHarvestingVarietyof origin湖南慈利华仲5号湖南慈利华仲8 号湖南慈利华仲10 号湖南慈利华仲12 号湖南慈利密叶杜仲湖南慈利地方种湖南长沙芙蓉区地方种湖南怀化沅陵地方种湖南邵阳洞口地方种湖南邵阳小沙江地方种湖南郴州桂东地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南长沙岳麓区地方种湖南宜冲桥乡地方种湖南慈利苗市地方种树皮湖南慈利景龙桥地方种树皮湖南通津铺乡地方种1285采收时间采收部位采收时间样品编号产地HarvestSample No.sitetime叶2021.09.08叶2021.09.08叶2021.09.08叶2021.09.08叶2021.09.08叶2021.04.18叶2021.06.30叶2021.07.18叶2021.07.05叶2021.07叶2021.08.13叶2021.07.01叶2021.07.15叶2021.08.01 叶2021.08.15叶2021.09.01叶2021.09.15叶2021.10.01叶2021.10.15叶2021.11.01 叶2021.12.01叶2021.12.15叶2021.12.30树皮2021.06.01 2021.06.202021.06树皮品种Place of originVarietyS38湖南慈利龙潭河S39湖南安化S40福芝堂S41中华药材行S42湖南郴州桂东S43湖南安化S44湖南长沙芙蓉区地方种S45湖南怀化沅陵S46湖南长沙岳麓区地方种S47湖南郴州桂东S48湖南张家界S49湖南张家界S50湖南张家界S51湖南张家界S52湖南长沙岳麓区地方种S53湖南张家界S54湖南慈利县S55湖南慈利县S56湖南慈利县S57湖南长沙岳麓区地方种S58湖南慈利县S59湖南慈利县S60湖南慈利三合口乡地方种S61湖南慈利江垭S62湖南慈利阳和乡S63湖南慈利2021.06Harvestingsite地方种树皮2021.05地方种树皮地方种树皮地方种树皮2021.07地方种树皮2021.08地方种树皮2021.01果英2021.06.30地方种果英2021.07.18果英2021.07.21地方种果英2021.08.13地方种果英2021.09.22华仲8 号果英2022.08华仲10 号果英2022.08密叶杜仲果英2022.08果英2022.08地方种果英2022.08地方种1雄花2021.06地方种1雄花2022.04地方种2雄花2022.04雄花2022.04华仲5号雄花2022.04华仲12 号雄花2022.04雄花2022.04地方种雄花2022.04地方种雄花2022.04地方种3雄花2022.05Harvesttime2021.072021.071.3杜仲不同部位指纹图谱研究1.3.1对照品溶液制备精密称取对照品适量，用甲醇溶解分别制得浓度为0.0 2 40 mg/mL桃叶珊瑚苷溶液，0.0 7 50 mg/mL京尼平苷酸溶液,0.2 0 50 mg/mL绿原酸溶液，0.0024mg/mL京尼平苷溶液,0.0 10 6 mg/mL松脂醇二葡萄糖苷溶液,0.0 139 mg/mL芦丁溶液，0.0055mg/mL紫云英苷溶液,0.0 0 30 mg/mL皮素溶液,经0.45m微孔滤膜过滤，密封,低温避光保存，备用。1.3.21供试品溶液的制备收集新鲜杜仲叶、皮、果荚、雄花样品，烘干，粉碎,精密称取样品粉末（过8 0 目筛)0.5g置10 0 mL锥形瓶中,精密加人甲醇12 mL后称重,超声提取30min后取出,冷却、称重,损失的质量用甲醇补足后摇匀,滤过。取滤液在离心机中以40 0 0 r/min离心5min,取上清液过0.45m滤膜，密封，低温避光保存，备用1.3.3指纹图谱色谱条件采用 Supersil ODS-B100A 色谱柱（4.6 mm 250mm,5m）;流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液(B）,采用梯度洗脱（0 12 min,5%A8%A;12 17 min,8%A11%A;17 25 min,11%A13%A;25 28 min,13%A14%A;28 40 min,14%A-14.5%A;40 41 min,85.5%A14.5%A;41 56 min,20%A30%A;56 65 min,30%A24%A;65 66 min,76%A95%A;66 67min,5%A5%A);体积流量为1.0 mL/min;柱温128630;进样量10 L;检测波长(0 8 min,207 nm;930 min,237 nm;31 40 min,207 nm;41 57min,320 nm;58 67 min,360 nm)。1.4基于网络药理学预测杜仲不同部位潜在Q-Marker1.4.1杜仲不同部位潜在质量标志物来源定位通过文献查阅，定位杜仲不同部位潜在质量标志物。1.4.2候选化合物靶点预测通过数据库对8 个目标化合物筛选，合并筛选出的靶点蛋白并去除重复靶点,得到与8 个化合物相关的17 3个靶点蛋白。1.4.3靶点蛋白与蛋白互作(PPI)网络分析将筛选出的靶点导人STRING11.0（h t t p s:/string-db.org/cgi/input.pl）数据库后做PPI分析，设置物种为“Homo sapiens”,隐藏网络中无联系的节点,其余参数设置不变,获得核心靶点PPI网络图，并将得出的结果导人Cytoscape 3.9.1软件,然后用NetworkAnalyze进行网络拓扑学分析，计算度值（d e g r e e）介数中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）等参数对蛋白相互作用进行可视化处理。1.4.4功能富集分析与通路分析基因本体（gene ontology,GO）功能富集分析主要用于描述基因靶点的功能,包括分子功能(molec-ular function，M F）、生物过程（biological process，BP）细胞组分（cellular component,CC）三个部分。京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia ofgenes and genomes,KEGG）富集分析可以得到潜在靶点所富集的信号通路。将筛选得到的靶点导入Metascape 数据库（http:/metascape.org/）进行 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,P 0.9,说明不同部位杜仲样品之间相似度良好。杜仲不同部位色谱叠加见图1,杜仲不同部位对照特征图谱见图2（标出的峰为共有峰），不同部位样品相似度评价结果见表2。Vol.35Vol.352.1.6进一步确认杜仲样品特征峰的化学信息,采用HPLC对杜仲叶样品对照特征图谱中共有峰中的8曾梅等：基于HPLC指纹图谱及网络药理学的杜仲质量标志物预测分析部分特征峰指认1287个色谱峰进行了指认,通过与对照品对照,分别鉴定为桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、紫云英苷、皮素,结果见图3。S21S20S19S18S17S16S15S14S13S12S1S1oS7S6S5S453S2S1101214 161820222426283032mriTime(min)B1036220222426283032403638404250 52545658464850 52626466R843S42S41S40S.39S38S37S36$35$34S33S32S31S30S29565860626466R$53$52S51S50S49S48$47S46S45$4410161820 22242628303234363840424446485052时fiTime(min)56586466DS63562S61S60559S58S57S56S55S5410Fig.1HPLC fingerprints of different parts of E.ulmoides注：A-叶;B-皮;C-果荚;D-雄花。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.20 22242628 3032343638时Time(min)图1杜仲不同部位HPLC指纹图谱5458606264661288天然产物研究与开发Vol.35CD6B8A24681012141618202224262830323436384042444648505254565860626466时间Time(min)图2杜仲不同部位对照特征图谱Fig.2Control fingerprint of different parts of E.ulmoides注：A-叶;B-皮;C-果荚;D-雄花。1-桃叶珊瑚苷;2-京尼平苷酸;3-绿原酸;4-京尼平苷;5-松脂醇二葡萄糖苷;6-芦丁;7-紫云英苷;8-皮素(图 3 同)。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.1-Aucubin;2-Geniposidic acid;3-Chlorogenic acid;4-Geniposide;5-Pinoresinoldiglucoside;6-Rutin;7-Astragalin;8-Quercetin(Same as Fig.3).A28681012141618202224262830323436384042444648505254565860626466时间Time(min)B56人68101214161820222426283032/3436384042444648505254 56 586062 6466506264时间Time(min)图3杜仲叶S12样品（A）和混合对照品(B)的HPLC图Fig.3HPLC chromatograms of E.ulmoides leaf S12 sample(A)8and the mixed control(B)Vol.35曾梅等：基于HPLC指纹图谱及网络药理学的杜仲质量标志物预测分析1289表2 样品相似度评价结果Table 2Sample similarity evaluation results样品相似度SampleSimilarityS10.979S20.988S30.956S40.985S50.996S60.999S70.999S80.921S90.985S100.988S110.92S120.922S130.991S140.961S150.977S160.924S170.97S180.922S190.955S200.958S210.992样品SampleS22S23S24S25S26S27S28S29S30S31S32S33S34S35S36S37S38S39S40S41S42相似度Similarity0.9910.9880.9920.9870.9940.9860.9870.9810.9230.9930.9940.9480.9970.9980.9840.9950.9460.9540.980.9720.998样品SampleS43S44S45S46S47S48S49S505152S5354S5556S5758S59S60S61S62S63相似度Similarity0.9780.9990.9910.9790.9280.9820.9870.9980.9380.9580.9760.9940.9970.9590.9990.9880.9980.9920.9970.9590.9972.1.7聚类分析(HCA)以杜仲叶、皮、雄花、果荚共有峰峰面积为变量运用SPSS22数据统计软件,采用组间聚类方法,欧氏距离平方法测量样品间距离进行系统聚类分析。结果表明,以距离小于5为标准,将2 8 份杜仲叶样品分为3类,S4、S9 分别聚为一类,其余样品为一类;15批杜仲皮样品聚为4类，S29、S31、S34、S35、S36、S41、S42、S43聚为第一类,S30、S32、S39、S40 聚为第二类,S33、S38 聚为第三类,S37单独聚为第四类;10 批杜仲果荚样品聚为3类,S45、S50 聚为第一类,S44、S46、S51 聚为第二类,S47、S48、S49、S52、S53聚为第三类;10 批杜仲雄花样品聚为2 类，S55、S57、S58、S6 0、S6 2、S6 3 聚为第一类,S59、S6 1、S54、S56聚为第二类（结果如图4）。不同品种杜仲叶、雄花、果荚不聚为一类,说明不同品种的杜仲样品质量有一定差异,不同产地杜仲叶、皮、雄花、果荚聚为一类，说明不同产地的杜仲不同部位样品质量较为均一,没有明显地域性，2.1.8主成分分析和正交偏最小二乘判别分析主成分分析法（principal component analysis,PCA)是一种通过降维技术把多个变量化为少数几个主成分（综合变量)的统计分析方法。将杜仲不同共有峰峰面积导人SPSS22数据统计软件,以特定的特征值与累计贡献率作为判定依据,对杜仲不同部位样品进行主成分分析。以特征值 1为提取标准,2 8 份杜仲叶样本有3个主成分，其特征值入1=6.9 9 9,入2=1.7 7 8,入3=1.344,特征值入1的贡献率为53.8 41%，入2 的贡献率为13.678%，入3的贡献率为10.340%，累积贡献率为77.859%；15份杜仲皮样本有4个主成分，其特征值入1=6.2 7 5,入2=1.58 9,入3=1.36 6,入4=1.138，特征值入1 的贡献率为52.2 9 3%，入2 的贡献1290A0S27S28S20S21FS26S24HS17S23S14hS13S19S2S25S15S18S12S16S22S5S11S6S8S7S10S1S3S4S9CS47S52S49S48S53S44S51S46S45S50天然产物研究与开发510510Vol.35152015202525B0S29S36S35S43S41S34S31S42S39S40S32S30S33S38S37DS58S63S57S60S55S62S54S59S56S6151010151520202525图4杜仲不同部位聚类分析图Fig.4Cluster analysis of dfferent parts of E.ulmoides注：叶;B-皮;C-果荚;D-雄花。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.率为13,2 39%，入3的贡献率为11.38 3%，入4 的贡献率为9.48 7%，累积贡献率为8 6.40 1%；10 份杜仲果荚样本筛选出3个主成分，其特征值入1=3.625,入2=1.9 54,入3=1.2 6 8,特征值入1的贡献率为45.316%，特征值入2 的贡献率为24.425%，特征值入3的贡献率为15.8 49%，累积贡献率为8 5.59%；10 份杜仲雄花样本筛选出2 个主成分，其特征值入1=7.2 15，入2 =1.8 3，特征值入1的贡献率为7 2.151%，特征入2 的贡献率为18.2 9 8%，累积贡献率9 0.449%。筛选出的杜仲不同部位的主成分具有良好代表性，可以反映出杜仲不同部位的综合质量。以选取的主成分方差贡献率为权重系数，对杜仲不同部位样品主成分得分、综合得分进行分析，并对得分结果进行排序。得分情况反映各批杜仲样本质量情况,质量越好,则分数越高。本研究中,湖南慈利华仲12 号杜仲叶药材、慈利江垭杜仲皮药材、华仲10 号杜仲果荚、华仲12 号雄花样本分别在不同部位样品仲得分最高，质量较好。将杜仲不同部位样品中共有峰峰面积导人SIMCA多元变量统计软件，得到OPLS-DA得分图和VIP图,结果见图5。R代表模型的解释能力，Q代表模型的预测能力,模型中R和Q均大于0.5。结果表明，采用PCA-X和OPLS-DA来观察不同部位杜仲样品的自然聚集，2 8 份杜仲叶样品聚为3类，18 份杜仲皮样品聚为4类，10 份杜仲果荚样品聚为3类,10 份杜仲雄花样品聚为两类，且分离更加显著,与HCA结果基本一致。Vol.35曾梅等：基于HPLC指纹图谱及网络药理学的杜仲质量标志物预测分析1291A21.510.50-0.58107943513Var ID(Primary)B2O+O+EldIN1.510.50-0.518269VarID(Primary)C2.520+1+dIA1.510.50-0.5-1D21.50+O+LldIA10.50-0.5121112710313646141226VarID(Primary)52VarID(Primary)51158194310787图5杜仲不同部位的重要性变量Fig.5Importance variables of different parts of E.ulmoides注：叶;B-皮;C-果荚;D-雄花。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.1292为明确不同部位杜仲样品质量差异的物质，结合变量重要性投影法,以VIP值大于1为标准,杜仲叶筛选出贡献较大的6 个变量，杜仲皮筛选出贡献较大的6 个变量，杜仲果荚筛选出贡献较大的4个变量,杜仲雄花筛选出贡献较大的5个变量。一般VIP值 1的变量为组间样本的主要差异变量,且VIP值越大，表明该成分对组间差异的贡献越大。根据对照品指认结果，杜仲叶样品中共有峰3、4、9号峰,分别对应绿原酸、京尼平苷、芦丁；杜仲皮样品中共有峰1、2、6 号峰,分别对应桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷；杜仲果荚样品中共有峰3、2、1,分别对应绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷；杜仲雄花样品中共有峰2、4、1号峰,分别对应京尼平苷酸、京尼平苷、桃叶珊瑚苷。其中杜仲叶7、8、10号峰，杜仲皮7、8、9 号峰，杜仲雄花及果荚中5、6号峰VIP值均大于1，但由于未做液质实验，未能识别出,在接下来的实验中,将会进行该方面研究。说明这些成分在区分不同批次杜仲不同部位样品时起到重要作用,是杜仲的主要标志性成分。2.2基于网络药理学预测杜仲不同部位潜在Q-Marker2.2.1杜仲不同部位潜在质量标志物来源定位多项杜仲现代药理研究表明，杜仲中的化学成分主要包括木脂素类、黄酮类、环烯醚类、类和MYLKMMP2ALOX5MMPSPRKCACAMK2BHRL2PARPPRKCEAKR1CEMAPTF2CLCASFPTGS2CCNALGALSKDRTTRINSRMMPSCYP1BFFLTNEKCASPH5D1782OASPOSPABHSD17B1CASP2THKALKAKRIBT天然产物研究与开发甾体类、酚酸类、多糖类等。Ma等 5 在研究中将京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷作为杜仲平压片质量评价标准;Liu等 6 测定不同部位化学成分含量时提议将桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷作为杜仲雄花、皮的质量控制指标成分;Tu等 7 在杜仲叶抗氧化活性研究中以紫云英苷等8 种化学成分作为杜仲叶的加工方式筛选、质控标准。结合HPLC色谱分析结果,最终确定桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、紫云英苷、皮素8种成分作为杜仲不同部位质量标志物的潜在来源范围进行分析2.2.2候选化合物靶点预测通过数据库对8 个目标化合物筛选，合并筛选出的靶点蛋白并去除重复靶点,得到与8 个化合物相关的17 3个靶点蛋白。2.2.3靶点蛋白与蛋白互作(PPI)网络分析PPI可视化网络图结果见图6,将度值大于2 倍中位数值且 degree10 作为筛选条件,筛选得到11个重要核心靶点，具体包括SRC（d e g r e e=2 1）、HRASdegree=17）、PIK 3R 1（d e g r e e =16）、CD K 1（d e g r e e =14）、CA SP3（d e g r e e =13）、CCNB1（d e g r e e=12)、A K T 1（d e g r e e =11)、CCNA 2（d e g r e e =11）、CCNB2(degree=11）、EG FR（d e g r e e =11）、PT K 2(degree=10)。ESRRAPASC1AKR1C1ALOXISTNF3CCOK5R1TERTCDK6AURKBEGFRCDKPIK3RHIE1AOP2AOCNBPTK2OASP3HRASKR1C3CCNA2CK2EDNRAVol.35SYKCDKSGF1RTOPSROPLK1APPAKTOCNB2CASPBYP1OA1METPIM1TOPAKRIBtOALALOX12CNB3CAAPEX1GSK3BACHE图6 蛋白-蛋白互作网络可视化图Fig.6 Visualization of protein-protein interaction network2.2.4功能富集分析与通路分析GO功能分析中一共获得17 6 7 个条目,其中包括148 7 个生物过程（biological process,BP）,18 6 个分子功能（molecular function，M F）,9 3个细胞组成（c e l l u l a r c o m p o n e n t,CC），G O 分析结果提示BP主要集中在蛋白质磷酸化、激酶活性的调节、对无机物Vol.35的反应、正向调节转移酶活性等功能;MF主要富集在碳酸脱水酶的活动、醇基为受体的磷酸转移酶活性、蛋白激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激曾梅等：基于HPLC指纹图谱及网络药理学的杜仲质量标志物预测分析BPCCMF20-1293酶活性、激酶活性等功能;CC 主要涉及周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体、蛋白激酶复合体等,分析结果见图7。1510npiasdtaaadBiological processKEGG富集分析得到16 8 条通路，选择前15条主要的通路进行展示，主要涉及氮代谢、癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、癌症蛋白聚糖、PI3K-Akt信Pathways in cancerPI3K-Akt signaling pathwayLipid and atherosclerosisChemical carcinogenesis-reactive oxygen speciesAlzheimerdiseaseProteoglycans in cancerProgesterone-mediatedoocytematurationNitrogenmetabolismHepatitis BHIF-I signaling pathwayEGFRtyrosinekinase inhibitorresistanceC-type lectin receptor signaling pathwayEndocrineresistanceOvarian steroidogenesisCentralcarbonmetabolism in cancer-5图8靶标信号通路富集分析气泡图Fig.8Bubble map of target signal path enrichment analysisCellularcomponent图 7 GO功能注释柱状图Fig.7Bar chart of GO functi