含氢化诺卜基的季铵盐化合物的抑菌活性及其机理研究.pdf

第 43 卷第 4 期2023 年 8 月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol.43 No.4Aug.2023 收稿日期:2022-04-08 基金项目:江西省重 点 研 发 计 划 资 助 项 目(20192ACB60011);江 西 省“千 人 计 划”首 批 培 养 类 科 技 创 新 高 端 人 才 项 目(JXSQ2019201016);江西省重大科技研发专项(20203ABC28W016)作者简介:丁清颖(1999),女,江西九江人,硕士生,研究方向:芳香植物精油的利用 通讯作者:陈尚钘,教授,博士,博士生导师,研究领域为芳香植物精油;E-mail:。doi:10.3969/j.issn.0253-2417.2023.04.004含氢化诺卜基的季铵盐化合物的抑菌活性及其机理研究DING Qingying丁清颖1,昌家宇1,肖转泉2,范国荣1,王宗德1,陈尚钘1(1.江西农业大学 林学院;国家林业草原木本香料(华东)工程技术研究中心;国家林业草原/江西省樟树工程技术研究中心,江西 南昌 330045;2.江西师范大学 化学化工学院,江西 南昌 330022)摘 要:以松节油主要成分之一的-蒎烯为原料合成得到含单氢化诺卜基的单季铵盐(1 13)、含双氢化诺卜基的单季铵盐(14 18)及含双氢化诺卜基的对称型双子季铵盐(19 36)共 36 个季铵盐类化合物,采用 96 孔板法,以刃天青作显色剂,以硫酸卡那霉素为阳性对照,测试了化合物对大肠杆菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等 4 种有害细菌的最小抑菌浓度(MIC 值)。结果表明:36 个季铵盐化合物的抑菌活性都明显优于原料-蒎烯和关键中间体氢化诺卜醇;分子中含有氢化诺卜基与长碳链烷基的单季铵盐(10 11)、含有双氢化诺卜基的单季铵盐(14 18)以及含有双氢化诺卜基的对称型双子季铵盐(19 36)的抑菌活性均较高,但大多数化合物的 MIC 值都高于硫酸卡那霉素的 MIC 值(对恶臭假单胞菌的 MIC 值为10 mg/L,对另3 种菌的 MIC 值为 5 mg/L);而双氢化诺卜基二甲基溴化铵(14)对恶臭假单胞菌的 MIC 值为 1.25 mg/L、对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的 MIC值均为 2.5 mg/L,双氢化诺卜基二乙基溴化铵(16)对恶臭假单胞菌的 MIC 值为 2.5 mg/L,均低于阳性对照硫酸卡那霉素的 MIC 值。此外,初步的抗菌机理研究显示:化合物14 可以增加恶臭假单胞菌的细胞膜通透性,使相对电导率明显增加;同时抑制其 ATP 酶活性,这些氢化诺卜基季铵盐类化合物有望作为潜在的抗菌剂。关键词:氢化诺卜基;季铵盐;细菌;抑菌活性;抑菌机理中图分类号:TQ35;TQ465 文献标志码:A 文章编号:0253-2417(2023)04-0025-06引文格式:丁清颖,昌家宇,肖转泉,等.含氢化诺卜基的季铵盐化合物的抑菌活性及其机理研究J.林产化学与工业,2023,43(4):25-30.The Antibacterial Activity and Mechanism of HydronopylQuaternary Ammonium CompoundsDING Qingying1,CHANG Jiayu1,XIAO Zhuanquan2,FAN Guorong1,WANG Zongde1,CHEN Shangxing1(1.College of Forestry,Jiangxi Agricultural University;East China Woody Fragrance and Flavor Engineering ResearchCenter of National Forestry and Grassland Administration;Camphor Engineering Research Center of NFGA/JiangxiProvince,Nanchang 330045,China;2.College of Chemical,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China)Abstract:In this work,we adopted-pinene,which was one of the main components of turpentine oil,to synthesize 36quaternary ammonium compounds including hydronopyl monoquaternary ammonium salts(1-13),dihydronopyl monoquaternaryammonium salts(14-18)and symmetric dihydronopyl bis-quaternary ammonium salts(19-36).The minimum inhibitoryconcentrations(MIC)of these compounds against four harmful bacteria such as Escherichia coli,Pseudomonas putida,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were tested by 96-well microtiter plates,using resazurin as chromogenic agent andkanamycin sulfate as the positive control.The results showed that the antibacterial activities of the synthesized quaternaryammonium compounds were significantly higher than that of the starting material-pinene and the critical intermediate hydronol.26 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷The monoquaternary ammonium salts with hydronopyl and long carbon chain alkyl(10-11),the monoquaternary ammonium saltswith dihydronopyl(14-18),and the symmetric dihydronopyl bis-quaternary ammonium salts(19-36)had high antibacterialactivity,while the MIC values of most quaternary ammonium compounds were higher than those of kanamycin sulfate(the MICvalues against P.putida and the other three bacteria are 10 mg/L and 5 mg/L,respectively).The MIC values of dihydronobuyldimethyl ammonium bromide(14)against P.putida,S.aureus and B.subtilis were 1.25 mg/L,2.5 mg/L,2.5 mg/L,respectively,and the MIC value of dihydronobuyl diethyl ammonium bromide(16)against P.putida was 2.5 mg/L,which waslower than the MIC value of the positive control kanamycin sulfate.Furthermore,the preliminary antibacterial mechanism studiesrevealed that compound 14 increased the permeability of P.putida cell membranes,resulting in a significant increase in relativeconductivity,and at the same time,inhibiting its ATP activity.These hydronopyl quaternary ammonium compounds wereexpected to be used as potential antimicrobial agents.Key word:hydronopyl;quaternary ammonium salt;bacteria;antibacterial activity;antibacterial mechanism季铵盐类化合物是一类性能优良的阳离子表面活性剂,具有化学性能稳定、表面活性强、分散及缓蚀作用较好、高效低毒、广谱抗菌和使用方便等优良性能1-2。作者所在的研究团队近年来以产量丰富、价格低廉的天然资源松节油为初始原料,从-蒎烯经过化学加工合成了氢化诺卜醇3、氢化诺卜基卤代物4、氢化诺卜基叔胺5等中间体,并进一步合成了多个系列的含氢化诺卜基的季铵盐类化合物,包括氢化诺卜基二甲(乙)基烷基卤化胺6-7、含双氢化诺卜基的单季铵盐8,以及含氢化诺卜基的对称型双子季铵盐9-11,并采用菌丝生长速率法12对10 多种植物病原真菌的生长进行了抑制性能测试,结果表明这些含氢化诺卜基的季铵盐类化合物对植物病原真菌都具有一定的抑制活性,其中有许多化合物的抑菌活性还大大超过常用的农药杀菌剂百菌清。致病细菌历来是人类的主要病原体,并且仍然是人类疾病的牵连细菌13。化学杀菌剂和抗生素是过去几十年来应对这些致病细菌的主要工具,但这些药剂的滥用不仅会使细菌产生抗药性,对人体器官造成损害,甚至还会造成双重感染。因此,开发安全和生态友好的替代品显得尤其重要。季铵盐类化合物性能优良,早在 20 世纪 30 年代研究人员就合成了烷基二甲基苄基氯化铵14,并将其用于外科手术中的消毒。本研究采用 96 孔板法,用刃天青作为显色剂,以链霉素和硫酸卡那霉素为阳性对照,测试了36 个含氢化诺卜基的季铵盐化合物对大肠杆菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC 值),并选择其中抑菌效果较好的化合物进行初步抑菌机理试验,以期为含氢化诺卜基的季铵盐化合物的实际应用提供实验数据。1 材料与方法1.1 菌种、试剂与仪器金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),均由江西农业大学植物天然产物与林产化工研究所提供。链霉素与硫酸卡那霉素均为标准品,HPLC 纯度98%。LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;SW-CJ-10 无菌超净工作台,苏州净化设备有限公司;CHP-250 智能培养箱,上海三发科学仪器有限公司;UV-5500 紫外分光光度计,上海元析仪器有限公司;DDS-307 电导率仪,上海精密科学仪器有限公司;ATP 酶试剂盒,南京建成生物工程研究所。1.2 季铵盐化合物结构、化学名称、编号13 个含单氢化诺卜基的单季铵盐(1 13),由氢化诺卜基二烷基叔胺和卤代烃反应合成得到;5 个含双氢化诺卜基的单季铵盐(14 18),由氢化诺卜基卤代物和含氢化诺卜基的叔胺反应合成得到;18 个含双氢化诺卜基的双子季铵盐(19 36),由氢化诺卜基二烷基叔胺和,-二卤代烷反应合成得到。36 个季铵盐化合物均由江西农业大学植物天然产物与林产化工研究所提供,具体结构、化学名称和编号参见文献15。1.3 化合物抑菌活性测定以 0.1%的刃天青为指示剂,硫酸卡那霉素和链霉素为阳性对照,采用 96 孔板法16-18测定季铵盐第 4 期丁清颖,等:含氢化诺卜基的季铵盐化合物的抑菌活性及其机理研究27 化合物对 2 种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和 2 种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、恶臭假单胞菌)的 MIC 值。将化合物用无菌水配制成质量浓度为10 240、5 120、2 560、1 280、640、320、160、80、40、20 和 10 mg/L 或者 640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 和 0.625 6 mg/L 的药液(实验首选第一浓度梯度,当未检测出 MIC 值时,选用第二浓度梯度重复实验),依次加入到第 1 11 孔中,每孔 50 mm,第12 孔加入100 L 0.9%生理盐水作为阴性对照。在1 12 孔各加入100 L 肉汤,50 L菌液(菌液浓度为0.5 麦氏,即1.5 108CFU/mL 的菌液浓度,D625nm=0.08 0.10)以及20 L 质量浓度为50 mg/L 的刃天青指示剂。37 培养 24 h 后观察颜色是否发生变化,若颜色由蓝色变为粉红色为有细菌存活,呈现蓝色的最低浓度即为 MIC 值。1.4 化合物抑菌机理探究实验1.4.1 细胞膜通透性测定 将恶臭假单胞菌接种于100 mL 液体培养基中,培养至对数生长期,通过离心获得菌株。用 0.01 mol/L PBS 缓冲液洗涤 3 次并重悬,在菌悬液中加入质量浓度为 MIC 的化合物药液,混匀后立即取出 5 mL,离心取上清液,稀释10 倍,选用电导率仪测量0 180 min 时药液处理菌株的电导率,其中未被药液处理时的电导率为 E0,药液处理 20 180 min 时的电导率为 E1,并测量药液处理180 min 后经煮沸冷却后的电导率(E2)。以无菌水处理作为空白对照,每组样品重复测定 3 次,以相对电导率()来表示细胞膜通透性19,计算公式如下:=(E1-E0)/(E2-E0)100%1.4.2 ATP 酶活性测定 采用 ATP 酶试剂盒测定细胞内 ATP 酶活性,恶臭假单胞菌菌株获取同 1.4.1节。在菌株对数生长期时,将质量浓度为 MIC 的化合物药液加入液体培养基中共同培养 6 h,通过离心获得菌株,用0.01 mol/L PBS 缓冲液洗涤3 次并重悬,将重悬后的菌体以8 000 r/min 的转速离心10 min,取上清液,稀释 10 倍,以无菌水处理作为空白对照,每组样品重复测定 3 次,用 ATP 试剂盒测定样品的ATP 酶活性20。2 结果与讨论2.1 化合物对 4 种供试细菌的抑制作用各系列含氢化诺卜基的季铵盐化合物对 4 种供试细菌的最小抑制浓度(MIC)数据列于表 1。由表中数据可以看出,这些含氢化诺卜基的季铵盐化合物对 4 种供试细菌均表现出一定的抑菌活性,抑菌活性都远高于合成这些化合物的原料-蒎烯和中间体氢化诺卜醇。阳性对照物硫酸卡那霉素抑菌效果明显强于链霉素,故下面用硫酸卡那霉素作对照来讨论各季铵盐化合物的抑菌活性。从表 1 可以看出,含 1 个氢化诺卜基的单季铵盐化合物(1 13)中,化合物 10 和 11 对 4 种细菌的MIC 值均较低,其中化合物 11 的 MIC 值均为 10 mg/L,对恶臭假单胞菌的抑制活性等同于硫酸卡那霉素,对另外 3 种细菌的抑制活性也较接近硫酸卡那霉素(MIC 值为 5 mg/L)。含双氢化诺卜基的单季铵盐化合物(14 18)对 4 种细菌的抑制作用较强,尤其是化合物 14(双氢化诺卜基二甲基溴化铵),对大肠杆菌的 MIC 值为 5 mg/L,与硫酸卡那霉素相同,对其他 3 种细菌的 MIC 值分别为 1.25、2.5 和2.5 mg/L,比阳性对照更低,表明其对 4 种细菌的抑制活性更强。化合物 16(双氢化诺卜基二乙基溴化铵)对恶臭假单胞菌的 MIC 值(2.5 mg/L)低于硫酸卡那霉素,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC 值均为 5 mg/L,与阳性对照相当。化合物 18(N,N-双氢化诺卜基溴化哌啶)对金黄色葡萄球菌、化合物 15(双氢化诺卜基二甲基碘化胺)对枯草芽孢杆菌的 MIC 值也为 5 mg/L,都相当于阳性对照。含双氢化诺卜基的双子季铵盐化合物(19 36)中,在全部 72 个 MIC 值数据中,仅 2 个数据为 320 mg/L,4 个数据为 160 mg/L;有 32 个数据20 mg/L,其中以化合物 31,33 数值较低,接近或等同于阳性对照硫酸卡那霉素。从分子结构比较来看,含双氢化诺卜基的单季铵盐(14 18)与含双氢化诺卜基的双子季铵盐(19 36),对供试的 4 种细菌普遍具有较好的抑制作用,有几个化合物的抑菌效果甚至强于硫酸卡那霉素。含单氢化诺卜基的单季铵盐(1 13)中,分子中连有较长烷基链的化合物,如氢化诺卜基二乙基28 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷正癸基溴化铵(11),对4 种细菌的抑制作用也较强(MIC 值均为10 mg/L)。其中,含双氢化诺卜基的单季铵盐对恶臭假单胞菌的抑制效果明显,因此选择了其中效果最好的化合物 14,从细胞膜通透性以及ATP 酶活性两个方面来初步探究其对恶臭假单胞菌的抑菌机理。表 1 化合物对 4 种供试细菌的最小抑制浓度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration(MIC)of the compounds against four tested bacteriamg/L化合物compound大肠杆菌E.coli恶臭假单胞菌P.putida金黄色葡萄球菌S.aureus枯草芽孢杆菌B.subtilis1320 320 640 640232032064032031608040160416016016032052 56064016064066401 2801 28032072 5601 2802 5606408160640320640964032032032010101010801110101010121 2803203201 280136401601603201451.252.52.515208080516102.5551780808080182020540194020404020160401052132080803202216040208023802010802480160808025404020202620202020272020804028404040402980204040304040404031202010103220202020335101053420208080358020408036101080160-蒎烯-pinene氢化诺卜醇 hydronol10 2402 56010 2402 560链霉素 streptomycin3202 5601 2802 560硫酸卡那霉素 kanamycin sulfate510552.2 化合物 14 对恶臭假单胞菌的抑菌机理研究2.2.1 细胞膜通透性 化合物 14 对恶臭假单胞菌细胞膜通透性的作用结果见图 1。由图 1 可知,与空白对照相比,用化合物 14 处理的菌株悬浮液的相对电导率明显提高,并随时间的推移而增加。当处第 4 期丁清颖,等:含氢化诺卜基的季铵盐化合物的抑菌活性及其机理研究29 图 1 化合物 14 处理后恶臭假单胞菌的细胞膜相对电导率Fig.1 The relative conductivity of the cellmembrane of P.putida after treatmentwith compound 14理时间为 20 min 时,实验组的相对电导率(3.11%)是空白对照组(0.90%)的 3 倍多;随着处理时间延长,实验组与空白对照组的相对电导率的差值趋于稳定。因此,从上述结果可以推断出,化合物 14 破坏了细胞膜的完整性,使细胞膜通透性增加,从而导致菌株的死亡。2.2.2 ATP 酶活性 为了进一步研究化合物 14 对恶臭假单胞菌能量代谢的影响,对细胞内三磷酸腺苷(ATP)活性进行了检测。与空白对照组(10.681 U/mg)相比,用化合物 14 处理的菌株的细胞内 ATP 酶活性(2.435 U/mg)明显下降。因此,可以推测,用化合物 14 处理的恶臭假单胞菌的 ATP 酶活性被明显抑制。综上所述,化合物14 不仅可以破坏细胞膜的完整性,还可以影响细菌的能量代谢。这可以部分解释化合物 14 的抑菌机制。化合物 14 的结构修饰及其具体的作用机制和安全性还需要进一步探索。3 结 论3.1 以松节油主要成分之一的-蒎烯为原料合成得到的含氢化诺卜基的单季铵盐与对称型双子季铵盐共 36 个化合物,采用 96 孔板法,用刃天青作显色剂,以硫酸卡那霉素为阳性对照测试了化合物对大肠杆菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等 4 种有害细菌的最小抑菌浓度(MIC 值)。结果表明:双氢化诺卜基二甲基溴化铵(14)、双氢化诺卜基二甲基碘化胺(16)等双氢化诺卜基单季铵盐化合物与含有长链烷基的单季铵盐氢化诺卜基二乙基正癸基溴化铵(11)对 4 种细菌的抑制效果接近甚至优于硫酸卡那霉素。含双氢化诺卜基的对称型双子季铵盐对 4 种细菌的抑制效果普遍较好,其中化合物 33 接近或等同硫酸卡那霉素。3.2 从细胞膜通透性以及 ATP 酶活性两个方面初步探究了化合物 14 对恶臭假单胞菌的抑制机理,结果表明:用化合物 14 处理的恶臭假单胞菌的相对电导率明显高于空白对照组,说明细胞膜的完整性被破坏,细胞通透性增加;ATP 酶活性下降,表明化合物 14 可以破坏其能量代谢。因此,破坏细菌的细胞膜和能量代谢可能是 36 个化合物的主要抑菌机制之一,特别是化合物 14。本研究初步探索化合物 14对恶臭假单胞菌的抑菌机理,后续可从核酸、蛋白质等方面进行深入探究。这些化合物可以作为进一步开发的线索,并有望作为潜在的抗菌剂使用。参考文献:1聂瑧,姚占力,牛自得,等.油田注水用杀菌剂在我国的应用及发展J.石油与天然气化工,1999,28(4):304-308.NIE Z,YAO Z L,ZHU Z D,et al.Application and development of biocide water injection fungicide in ChinaJ.Petroleum and Natural GasChemical Industry,1999,28(4):304-308.2张跃军,赵晓雷.季铵盐杀生剂杀生性能与机理研究进展J.精细化工,2010,27(12):1145-1151,1227.ZHANG Y J,ZHAO X L.Research progress in the biocidal performance and mechanism of quaternary ammonium salt biocideJ.FineChemical Industry,2010,27(12):1145-1151,1227.3赵玲华,肖转泉,陈金珠,等.氢化诺卜醇及其烷基醚的合成与表征J.化学研究与应用,2012,24(1):123-126.ZHAO L H,XIAO Z Q,CHEN J Z,et al.Synthesis and identification of hydronol and its alkyl ethersJ.Chemical Research and Application,2012,24(1):123-126.4赵玲华,肖转泉,陈金珠,等.氢化诺卜醇及其卤代物的合成与结构分析J.林产化学与工业,2012,32(1):39-42.ZHAO L H,XIAO Z Q,CHEN J Z,et al.Synthesis and structural analysis of hydronol and its halidesJ.Chemistry and Industry of ForestProducts,2012,32(1):39-42.5陈金珠,肖转泉,徐丽峰,等.含氢化诺卜基的叔胺类化合物的合成与结构分析J.江西师范大学学报:自然科学版,2016,40(2):179-182.30 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷CHEN J Z,XIAO Z Q,XU L F,et al.The synthesis and structural analysis of hydronopyl tertiary amine compoundsJ.Journal of JiangxiNormal University:Natural Science,2016,40(2):179-182.6冯雪贞,肖转泉,卢平英,等.氢化诺卜基二甲基烷基卤化铵的合成与抑菌活性J.林产化学与工业,2019,39(1):35-40.FENG X Z,XIAO Z Q,LU P Y,et al.Synthesis and antibacterial activity of hydronopyl dimethyl alkyl ammonium halideJ.Chemistry andIndustry of Forest Products,2019,39(1):35-40.7FENG X Z,XIAO Z Q,WANG Z D,et al.Antifungal activity of-pinene-based hydronopyl quaternary ammonium salts against phytopathogenicfungiJ.Natural Product Communication,2020,15(8):1-6.8 FENG X Z,XIAO Z Q,YANG Y L,et al.-pinene derived products with enhanced in vitro antimicrobial activityJ.Natural ProductCommunication,2021,16(2):1-8.9冯雪贞,肖转泉,王宗德,等.对称型含氢化诺卜基的对称型双子季铵盐的合成与抑菌活性J.化学研究与应用,2020,32(7):1249-1254.FENG X Z,XIAO Z Q,WANG Z D,et al.Synthesis and antifungal activity of symmetrical hydronopyl gemini quaternary ammonium saltsJ.Chemical Research and Application,2020,32(7):1249-1254.10冯雪贞,肖转泉,范国荣,等.刚性氢化诺卜基对称型双子季铵盐的合成与抗菌作用J.林产化学与工业,2020,40(6):77-84.FENG X Z,XIAO Z Q,FAN G R,et al.Synthesis and antifungal activity of rigid hydronopyl gemini quaternary ammonium saltsJ.Chemistryand Industry of Forest Products,2020,40(6):77-84.11冯雪贞,肖转泉,范国荣,等.氢化诺卜基对称型双子季铵盐的合成及抑菌活性J.生物质化学工程,2021,55(2):45-49.FENG X Z,XIAO Z Q,FAN G R,et al.Synthesis and antifungal activity of hydronopyl gemini quaternary ammonium saltsJ.BiomassChemical Engineering,2021,55(2):45-49.12吴文君.植物化学保护实验技术导论M.西安:陕西科学技术出版社,1988:333.WU W J.Introduction to Experimental Techniques of Phytochemical ProtectionM.Xian:Shaanxi Science and Technology Press,1988:333.13ASGHAR M A,ZAHIR E,SHAHID S M,et al.Iron,copper and silver nanoparticles:Green synthesis using green and black tea leaves extractsand evaluation of antibacterial,antifungal and aflatoxin B-1 adsorption activityJ.LWT-Food Science and Technology,2018,90:98-107.14卓祥奋,赵章楣.季铵盐杀菌灭藻剂J.日用化学工业,1988(3):33-35.ZHUO X F,ZHAO Z M.Quaternary ammonium salt bactericidal algaecidesJ.China Surfactant Detergent&Cosmetics,1988(3):33-35.15昌家宇,丁清颖,肖转泉,等.含氢化诺卜基的季铵盐类化合物对松枯梢病原菌的抑制作用及其机理研究J.林产化学与工业,2022,42(4):88-94.CHANG J Y,DING Q Y,XIAO Z Q,et al.Inhibitory effect and mechanism of quaternary ammonium salts containing hydrogenated nobyl onSphaeropsis sapineaJ.Chemistry and Industry of Forest Products,2022,42(4):88-94.16GUO H Q,DONG Y G,ZHOU X L,et al.Synthesis and bacteriostatic activities of modified flutriafol derivativesJ.ACS Omega,2019,4(1):9-14.17KHORRAMIA S,KAMALIB F,ZARRABIC A.Bacteriostatic activity of aquatic extract of black peel pomegranate and silver nanoparticlesbiosynthesized by using the extractJ/OL.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology,2020,25:1016202022-03-10.https:doi.org/10.1016/j.bcab.2020.101620.18ZHANG J,TAO M T,HUANG Z Y,et al.Significant effects of two pesticides on the bacteriostatic activity and antioxidant ability of green teapolyphenolsJ.RSC Advances,2020,10(43):25662-25668.19吕飞.天然植物精油的抑菌活性及其作用机理研究D.北京:北京化工大学,2011.LYU F.Study on the antibacterial activity and mechanism of natural plant essential oil D.Beijing:Beijing University of ChemicalTechnology,2011.20郭俸钰,陈文学,陈海明,等.芳樟醇对大肠杆菌的抑菌作用机制J.现代食品科技,2020,36(4):113-118.GUO F Y,CHEN W X,CHEN H M,et al.Antibacterial mechanism of linalool against Escherichia coliJ.Modern Food Science andTechnology,2020,36(4):113-118.