甘肃省甲基丙二酸血症发病率及基因突变分析.pdf

甘肃省甲基丙二酸血症发病率及基因突变分析王 兴，刘芙蓉，张 钏，陈 雪，郝胜菊，李修晶甘肃省妇幼保健院 甘肃省出生缺陷防控研究重点实验室，甘肃 兰州 730050收稿日期：2023-03-13基金项目：甘肃省科技计划资助项目-民生科技专项-社会发展专题（20CX4FA003）；甘肃省卫生健康行业科研资助项目（GSWSKY2020-39）作者简介：李修晶，女，主治医师，研究方向为新生儿疾病，e-mail:，通信作者摘要：目的目的 研究甘肃省甲基丙二酸血症的发病率及致病基因突变谱。方法方法 回顾性分析2018年1月-2021年12月甘肃省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心对各地州市送检新生儿样本遗传代谢病筛查、诊断的结果，得出甘肃省甲基丙二酸血症发病率；根据新生儿疾病筛查中心和临床儿科确诊甲基丙二酸血症患儿的基因检测结果，探索甘肃省甲基丙二酸血症的临床分型及基因突变位点。结果结果 甘肃省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心2018年1月-2021年12月共筛查213 786例新生儿干血斑样本，确诊甲基丙二酸患儿22例，发病率为1/9 718；对25例甲基丙二酸患儿（新生儿疾病筛查中心20例、临床儿科 5 例）进行基因检测，共鉴定出 MMUT、MMAA 和 MMACHC 3 个基因 31 个突变位点。MMUT 基因c.323G A（9.09%）、c.917C T（9.09%）、c.494A G（9.09%）和c.984delC（9.09%）突变以及MMACHC基因c.609G A（46.15%）、c.567dupT（11.54%）、c.80A G（7.69%）和c.394C T（7.69%）突变较为常见；单纯型12例（48%），合并型13例（52%）。结论结论 甲基丙二酸血症在甘肃省新生儿群体中有较高的发病率、病死率；合并型甲基丙二酸血症占比略高；MMUT、MMAA和MMACHC基因突变位点的发现，可为甘肃省后续开展遗传代谢病基因筛查、遗传咨询及产前诊断提供理论基础。关键词：新生儿疾病筛查；遗传代谢病；甲基丙二酸血症；基因分型中图分类号：R394文献标识码：Adoi：10.13885/j.issn.1000-2812.2023.06.012Incidence rate and gene mutation analysis ofmethylmalonic acid in Gansu ProvinceWang Xing,Liu Furong,Zhang Chuan,Chen Xue,Hao Shengju,Li XiujingGansu Provincial Key Laboratory of Birth Defect Prevention and Control,Gansu Province Maternal and Child Health Care Hospital,Lanzhou 730050,ChinaAbstract：Objective To investigate the incidence,gene mutation spectrum and prognosis of methylmalonic acidemia in Gansu Province.Methods Retrospective analysis of the screening and diagnostic results of genetic and metabolic diseases of newborn samples submitted by the Neonatal Disease Screening Center of Gansu Provincial Maternal and Child Health Care Hospital from January 2018 to December 2021 in various regions,states and cities indicated that the incidence rate of methylmalonic acid in Gansu Province.According to the genetic testing results of children with methylmalonic acid confirmed by the Neonatal Disease Screening Center and Clinical Pediatrics,the clinical typing and gene mutation sites of methylmalonic acid in Gansu Province were explored.Results In the past 4 years,a total of 213 786 samples of neonatal dry blood spots were screened by the Neonatal Disease Screening Center,and 22 cases were diagnosed with methylmalonic acid,with an incidence rate of 1/9 718.A total of 31 mutation sites of MMUT,MMAA and MMACHC genes were identified by genetic testing in 25 children with methylmalonic acid(20 cases in Neonatal Disease Screening Center and 5 in Clinical Pediatrics).MMUT gene c.323G A(9.09%),c.917C T(9.09%),c.494A G(9.09%)文章编号：1000-2812(2023)06-0072-05第49卷 第6期2023年6月兰州大学学报（医 学 版）Journal of Lanzhou University（Medical Sciences）Vol.49 No.6June.2023甲基丙二酸血症（methylmalonic academia,MMA）是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶或其辅酶钴胺素代谢缺陷，导致甲基丙二酸、甲基枸橼酸、3-羟基丙酸等代谢产物在体内异常蓄积的一种遗传代谢病。患儿可出现喂养困难、呕吐、昏迷、酸中毒、生长发育迟滞等临床表现，因缺乏临床特异性，容易漏诊或误诊，延误治疗可导致多器官不可逆损伤甚至死亡1。应用串联质谱技术筛查新生儿群体和临床高危儿，后续通过尿气相质谱或基因测序技术进行疾病鉴别诊断，是早发现、早诊断、早治疗、降低疾病伤害的有效途2。MMA 在全球的发病率为 1/48 0001/250 0003，中国总体发病率为1/28 0004，但不同地区发病率存在明显差异性，呈现北方地区高于南方地区的特点。根据患儿是否伴有血同型半胱氨酸水平升高，可分为单纯型 MMA 和合并型 MMA。单纯型MMA 可 由 MMUT、MMAA、MMAB、MCEE、MMADHC 基因变异引起，合并型 MMA 可由MMACHC、MMADHC 及 LMBRD1 基 因 变 异 引起5。本研究回顾性分析2018年1月-2021年12月在甘肃省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心进行遗传代谢病筛查的新生儿MMA发病率，以及新生儿疾病筛查中心和临床儿科MMA患儿的基因诊断数据，探讨甘肃省MMA的发病率、临床分型和基因突变谱。1研究对象研究对象2018年1月-2021年12月，甘肃省各地州市送往甘肃省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心符合新生儿疾病筛查技术规范要求的213 786例新生儿样本进行串联质谱筛查，22例确诊为MMA，对其中20例及5例甘肃省妇幼保健院临床儿科确诊的MMA患儿进行基因诊断。本研究经甘肃省妇 幼 保 健 院 伦 理 委 员 会 批 准（批 件 文 号：2021GSFY伦审22号），征得所有家系成员同意，签署知情同意书。2研究方法研究方法2.1 仪器与试剂串联质谱检测系统，Waters TQD 串联质谱仪、Waters 2777C 自动进样器、Waters 1525 u 高效液相色谱仪泵购自美国Waters 公司；尿气相质谱检测系统，GC-MS QP 2010气相色谱-质谱联用仪购自日本岛津公司。串联质谱-非衍生化试剂盒购自芬兰PerKin Elmer公司，尿气相质谱检测试剂盒购自深圳爱湾医学检验实验室。血细胞基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。2.2 样本采集与保存 串联质谱检测样本，使用新生儿疾病筛查S&S903滤纸片采集新生儿足跟血，收集3个直径大于 8 mm的血斑，室温下自然晾干，26 C保存。气相质谱检测样本，使用15 mL无菌试管收集患儿510 mL尿液样本，-20 C保存。基因检测样本，使用EDTA抗凝管采集患儿及其父母外周血样本23 mL，DNA提取后-20 C保存。2.3 串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱用打孔器取 3.2 mm 直径干血斑样本和质控品置于 96孔板内，每孔加 100 L 按照试剂盒说明书配置的萃取工作液，在恒温震荡器内45 C、700 r/min萃取45 min后移板上机检测包括乙酰肉碱（C2）、丙酰肉碱（C3）在内的11种氨基酸和31种酰基肉碱浓度。2.4 气相质谱检测有机酸按照深圳爱湾医学检验实验室提供的操作流程，根据尿液样本肌酐浓度取不同体积尿液，尿素酶处理后加内标17烷酸、24烷酸和托品酸并定and c.984delC(9.09%),and MMACHC gene c.609G A(46.15%),c.567dupT(11.54%),c.8 0A G(7.69%)and c.394C T(7.69%)were common.There were 12 cases(48%)of simple type and 13(52%)of compli-cated type.Conclusion Methylmalonic acidemia has a high incidence and fatality rate in newborn population in Gansu Province.The proportion of combined methylmalonic acidemia was slightly higher.The discovery of MMUT,MMAA and MMACHC gene mutation sites can provide a theoretical basis for genetic screening,genetic counseling and prenatal diagnosis of genetic metabolic diseases in Gansu Province.Keywords:neonatal disease screening;genetic metabolic disease;methylmalonic acidemia;genotyping第6期王 兴，等：甘肃省甲基丙二酸血症发病率及基因突变分析73第49卷兰州大学学报（医 学 版）容至2 mL，经盐酸羟胺、氢氧化钠和盐酸处理，乙酸乙酯萃取2次，甲基硅烷化衍生后上机检测包括甲基丙二酸在内的有机酸浓度。2.5 基因检测患儿及其父母外周血DNA样本送北京迈基诺基因科技股份有限公司，采用高通量测序Panel法进行遗传代谢病相关基因检测以明确致病变异，测序平均深度为200，大于20的靶向基因序列测序达97%以上。2.6 基因数据分析高通量测序得到的结果与参考基因组（GRCh37/hg19）比对得到所有变异的文件，筛选检测到的碱基变异，应用PolyPhen2（http:/genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）和 PROVEAN（https:/provean.jcvi.org/index.php）软件对新变异进行蛋白功能预测，新变异致病性判读依据美国医学遗传学与基因组学会2015版指南。2.7 筛查、诊断标准及随访串联质谱结果 C3 5.00 mol/L 或 C3 3.00 mol/L 且 C3/C2 0.27 为筛查阳性；筛查阳性患儿召回后，遗传代谢病专科医生根据基因检测报告或气相质谱检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸、3-羟基丙酸及常规生化检验、患儿临床表现诊断疾病。确诊患儿纳入新生儿疾病筛查管理系统，定期随访。3 结果结果3.1 新生儿群体MMA的筛查、诊断结果2018年1月-2021年12月，甘肃省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心对各地州市送检的干血斑样本进行串联质谱筛查和初筛，阳性患儿召回诊断，确诊22例MMA患儿，其中20例进行了基因诊断，2 例经气相质谱及生化检验诊断。筛查、诊断详情见表1。年份2018201920202021合计筛查量/例61 94887 88235 99027 966213 786阳性/n（%）591（0.95）1 220（1.39）441（1.23）505（1.81）2 757（1.29）确诊/例 7 8 3 422发病率1.13/10 0000.91/10 0000.83/10 0001.43/10 0001.03/10 000表1 新生儿MMA筛查、诊断情况 3.2 MMA患儿致病基因突变位点和临床分型甘肃省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心及临床儿科确诊MMA患儿中有25例进行了基因检测，均检测到致病基因的复合杂合突变或纯合突变。11例患儿检测到 MMUT基因突变，检出 18种突变（表2），包括3种无义突变、11种错义突变、4突变序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718碱基改变c.323GAc.917CTc.494AGc.984delCc.103CTc.2008GAc.914TCc.319ATc.1280GAc.2179CTc.2000AGc.1663GAc.613GAc.1106GAc.1630_1631delGGinsTAc.1038_1040delTCTc.301_302insTAc.729_730insTT氨基酸改变p.R108Hp.S306Fp.D165Gp.W329Gfs*4p.Q35Xp.G670Sp.L305Sp.I107Fp.G427Dp.Arg727Terp.H667Rp.A555Tp.E205Kp.R369Hp.G544Xp.346_347delp.T101Ifs*80p.D244Lfs*39变异类型错义突变错义突变错义突变移码突变无义突变错义突变错义突变错义突变错义突变无义突变错义突变错义突变错义突变错义突变无义突变移码突变移码突变移码突变频数222211111111111111突变频率/%9.099.099.099.094.554.554.554.554.554.554.554.554.554.554.554.554.554.55表2 MMUT致病基因突变位点情况74种移码突变。常见突变有c.323G A、c.917C T、c.494A G和c.984delC，携带频率均为9.09%；13例患儿检测到MMACHC基因突变，检出11种突变（表3），包括4种无义突变、4种错义突变、3种移码突变。常见突变有c.609G A、c.567dupT；1 例 患 儿 检 测 到 MMAA 基 因 复 合 杂 合 突 变，c.988C T（p.R330X）的无义突变，c.734-7A G（IVS4-7 A G）的 剪 接 突 变。按 照 MMUT、MMAA基因突变导致单纯型MMA，MMACHC基因突变导致合并型MMA进行临床分型，25例确诊 病 例 中 单 纯 型 12 例（48%），合 并 型 13 例（52%）。突变序号1234567891011碱基改变c.609GAc.567dupTc.80AGc.394CTc.616CTc.445TCc.298GTc.1AGc.90GAc.658_660delAAGc.624_625delTG氨基酸改变p.W203Xp.I190Yfs*13p.Q27Rp.R132Xp.R206Wp.C149Rp.E100Xp.M1Vp.Trp30Terp.K220delp.V209Dfs*35变异类型无义突变移码突变错义突变无义突变错义突变错义突变无义突变错义突变无义突变移码突变移码突变频数123221111111突变频率/%46.1511.547.697.693.853.853.853.853.853.853.85表3 MMACHC致病基因突变位点情况3.3 随访结果确诊MMA患儿的临床追踪和随访结果显示，12例单纯型 MMA患儿中死亡 8例（均为 MMUT基因突变），死亡率为66.67%；13例合并型MMA患儿中死亡4例，死亡率为30.77%。13例存活患儿均出现不同程度生长发育迟滞。4 讨论讨论MMA 是一种常见的遗传代谢病，近年来，随着串联质谱技术的快速推广，多地相继报道新生儿MMA发病率。本研究统计甘肃省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心送检的 213 786例新生儿样本MMA筛查、诊断结果，得出甘肃省新生儿群体MMA发病率明显高于浙江省（1/46 500）6和中国台湾地区（1/101 625）7，略低于河南省（1/4 714）8，与同属西北地区的陕西省相近（1/6 960）9。进一步证明中国北方 MMA 发病率高于南方。黄倬等10、刘怡等11对临床确诊MMA患者进行临床分型得出合并型是中国MMA主要发病亚型；浙江省6、河南省8新生儿疾病筛查中确诊MMA患儿临床分型研究也得到相同结论。本研究25例MMA患儿检出MMUT、MMAA、MMACHC 3个致病基因，基因致病类型分别为甲基丙二酰辅酶A变位酶、cbIA、cbIC型。根据致病基因不同进行临床分型，甘肃省 MMA 单纯型（48%）与合并型（52%）占比较接近，这与大多数报道不同，但与合并型 MMA 患儿中以 MMACHC 基因c.609G A和c.567dupT为主要突变位点的结果相符。单纯型 MMA患儿除 1例为 MMAA致病基因突变导致外，其余12例为MMUT致病基因突变，检测出18种MMUT基因突变类型，其中c.323G A、c.917C T、c.494A G和c.984delC携带频率均为 9.09%，而之前报道12MMUT 基因最常见的突变位点c.729_730insTT在本研究病例中出现频率仅为4.55%，未检测出甘肃省MMUT基因明显的热点突变位点。本研究进行基因检测的25例患儿仅检出3种致病基因，更多的致病基因未出现在病例中。可能与MMA总体发病率低、甘肃省新生儿群体串联质谱筛查普及率低，导致确诊病例较少有关，无法准确反应当地人群的所有致病第6期王 兴，等：甘肃省甲基丙二酸血症发病率及基因突变分析75基因种类及其突变频率，但也不排除不同地域人群遗传背景的影响。在检出的29个变异位点中，MMUT基因c.2000A G、MMACHC基因c.298G T 和 MMAA 基因 c.734-7A G 变异为新变异位点13。随访结果显示，单纯型MMA患儿病死率高于合并型MMA患儿。这是由于MMUT基因突变导致MCM缺陷是单纯型MMA的主要发病机制，根据患者对钴胺素治疗的直接反应和对丙酸的间接反应，分为酶活性完全缺失型（MUT0）和酶活性部分缺失型（MUT-），研究14显示MUT0型患儿对钴胺素治疗无效，起病急、病情严重且进展迅速、死亡率高。而 MMACHC基因突变导致胞浆内甲基钴胺素合成缺陷引发的合并型MMA，绝大多数使用钴胺素治疗有效，所以通过及时干预治疗，预后较好。目前，对MMA急性期的治疗以对症治疗、及时补液、纠正酸中毒和电解质紊乱为主；长期治疗，钴胺素治疗无效性型或部分有效型的单纯型MMA患者以饮食治疗为主。肝肾移植能部分纠正MMA代谢缺陷，但其长期预后及移植存活率仍不确定15。基因治疗是未来的发展方向，但其安全性和有效性有待进一步研究16。甘肃省是MMA的高发地区，有必要在当地新生儿群体中普及串联质谱筛查；临床分型及致病基因突变谱的研究，可为后续开展MMA的基因筛查、遗传咨询和产前诊断提供理论支持。参 考 文 献1 余紫楠,张玉,黄新文.欧洲甲基丙二酸血症与丙酸血症诊治指南J.中华急诊医学杂志,2019,28(5):560-562.2 尚世强,杨建滨.新生儿疾病筛查和诊断的发展及存在的问题与思考J.中华检验医学杂志,2015,38(4):217-219.3 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