核酸质谱技术对辐射相关基因单核苷酸多态性多重检测方法的构建及验证.pdf

5现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023核酸质谱技术对辐射相关基因单核苷酸多态性 多重检测方法的构建及验证郝文霞1，张阳东1，宋丽杰1，高峥2，牛冬梅2，楚瑞雪3（1.火箭军特色医学中心，北京 100088；2.火箭军 96606 部队医院，河南洛阳 471003；3.解放军总医院京中医疗区礼士路门诊部，北京 100820）摘要：目的构建可同时检测多个辐射相关基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的高通量、高分辨率、快速的方法。方法选取 2020 年 4 6 月火箭军特色医学中心 75 例年满 18 周岁的健康男性为研究对象，采集外周血并提取 DNA。文献筛选辐射相关 17 种基因 28 个 SNP，设计多重 PCR 引物和单碱基延伸引物，通过 PCR 扩增和延伸，应用DP-TOF型飞行时间质谱检测系统对SNP位点进行基因分型，并对其中7份样本用Sanger测序法进行验证。结果构建的 28 个 SNP 均分型成功。75 份 DNA 样本 28 个 SNP 的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（martix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）检测结果显示基因分型检出率为 100.0%。7 份 DNA 样本 28 个 SNP 的基因型与 Sanger 测序结果完全符合，其准确度为 100.0%。结论成功构建可同时检测 17种基因 28 个辐射相关 SNP 的核酸质谱检测技术平台，该方法具有高通量、快速准确的优点。关键词：电离辐射；单核苷酸多态性；核酸质谱技术中图分类号：Q503文献标识码：A文章编号：1671-7414（2023）05-005-07doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2023.05.002Establishment and Validation of A Multiple Detection Method for Single Nucleotide Polymorphisms of Genes Associated with Radiation Using Nucleic Acid Mass Spectrometry TechnologyHAO Wenxia1,ZHANG Yangdong1,SONG Lijie1,GAO Zheng2,NIU Dongmei2,CHU Ruixue3（1.the PLA Rocket Force Characteristic Medical Center,Beijing 100088,China;2.Rocket Army 96606 Military Hospital,Henan Luoyang 471003，China;3.Lishilu Clinic,Central Medical Branch of PLA General Hospital,Beijing 100820,China）Abstract:ObjectiveTo establish a high-throughput,high-resolution and fast method that can simultaneously detect multiple single nucleotide polymorphisms(SNPs)of genes associated with radiation.Methods75 healthy males over the age of 18 at the PLA Rocket Force Characteristic Medical Center from April 2020 to June 2020 were selected as the research subjects to collect peripheral blood and extract DNA.17 genes with 28 SNPs were screened from literature.Multiple PCR primers and single base extension primers were designed.Genotypes of SNPs were tested with the DP-TOF time-of-flight mass spectrometry detection system after PCR amplification and extension,and 7 of them were verified by Sanger sequencing method.ResultsThe 28 SNPs constructed were genotyped successfully.28 SNPs in 75 DNA samples detected by(martix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometrym,MALDI-TOF-MS)showed a genotyping detection rate of 100.0%.The genotyped of 28 SNPs from 7 samples were completely consistent with Sangers sequencing results,with an accuracy of 100.0%.ConclusionThe nucleic acid mass-spectrometric detection technology platform which could simultaneously detect 28 SNPs of 17 genes associated with radiation was successfully constructed.It has the advantages of high-throughput,fast and accuracy.Keywords:ionizing radiation；single nucleotide polymorphism；nucleic acid mass spectrometry technology电离辐射可对生物体产生重要影响，但不同机体之间的生物学效应存在差异。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的 DNA 序列多基金项目：军队后勤面上项目（CEP21J009）；中心创新课题（ZXKC19019）。作者简介：郝文霞（1989-），女，硕士研究生，医师，研究方向：基础医学研究，E-mail:。通讯作者：楚瑞雪（1970-），女，本科，副主任医师，研究方向：基础医学研究和健康管理，E-mail:。态性1，可造成不同个体对辐射敏感性的差异。目前国内外有关电离辐射与 SNP 的相关性研究多集中在肿瘤患者对放射性治疗的敏感性和放射损伤风险的研究，并只体现在某种基因单个或几个位点上，6现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.2023也有核工厂工人和医疗机构辐射从业人员的损伤研究，但不同研究中射线的类型不同且判断辐射损伤的标准也不同。因此，构建基于同一实验方法和判断标准的高通量辐射损伤相关 SNP 的检测方法很有必要。核酸质谱法是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ion-ization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术，具有高灵敏度、高精确度和高通量等优势，是当前公认的 SNP 分型的金标准2。本研究根据文献报道，筛选与辐射相关多个基因多个SNP，设计合成引物，应用核酸质谱技术构建高通量、高分辨率、快速的检测方法，为筛选辐射损伤相关标志物、早期发现辐射损伤易感个体及降低辐射损伤风险提供技术平台。1材料和方法1.1研究对象选取 2020 年 4 6 月火箭军特色医学中心 75 例健康官兵为研究对象，纳入标准：年满18周岁，汉族，男性，无恶性血液系统疾病史，三个月内未曾行放疗或化疗，2 周内未曾行 X 线检查。所有受试者均征得知情同意，并且该研究经火箭军特色医学中心伦理委员会批准。1.2仪器与试剂DP-TOF 核酸质谱仪（杭州迪普公司），DNA 提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司，双脱氧核苷酸（TaKaRa Bio 公司），其余 PCR 扩增和单碱基延伸反应所用仪器和试剂参见文献 3。1.3方法1.3.1辐射相关多个基因单核苷酸筛选：检索国内外数据库内辐射敏感基因相关 SNP 的研究，包括：PubMed，中国知网，维普和万方数据库，关键词为“辐射”与“SNP”，检索时间截止 2020年 4 月。根据文献报道，筛选出共济失调性毛细血管扩张症突变基因（ataxia telangiectasia-mutated，ATM），人类 X 线交叉互补修复基因 1（X-ray re-pair cross complementing 1,XRCC1），人类 X 线交叉互补修复基因 3（X-ray repair cross complement-ing 3,XRCC3），人类 X 线交叉互补修复基因 6（X-ray repair cross complementing 6,XRCC6），8-羟基鸟嘌呤糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase,hOGG1）,转化生长因子 1（transforming growth factor beta 1,TGF-1），肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor alpha-like,TNF-），谷胱甘肽 S 转移 酶 P1（glutathione S-transferase pi 1,GSTP-1），4D 磷酸二酯酶（phosphodiesterase 4D,PDE4D），切除修复交叉互补基因 2（ERCC excision repair 2,XPD），切除修复交叉互补基因 5（ERCC excision repair 5,XPG），腺苷酸二磷酸核糖转移酶（adenosine diphosphate ribosyl transferase,ADPRT），DNA 连接酶 4（DNA ligase 4,LIG4），DNA 损伤识别修复因子（DNA damage recognition and repair factor,XPA），补体因子 H（complement factor H,CFH），O-6-甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）和mutS同源蛋白6（mutS homolog 6,MSH6）等 17 种基因 28 个 SNP。1.3.2SNP 多态性分析：静脉采集外周血 5 ml，乙二胺四乙酸抗凝，按照天根全血抽提试剂盒的说明书提取人外周血白细胞 DNA。引物由上海百力格生物技术有限公司合成。多重 PCR 扩增及纯化实验过程参见文献 3。单碱基的延伸反应由依次在反应液中加入 2 l 针对 SNP 位点的特异性单碱基延伸引物、延伸缓冲液、双脱氧核苷酸、DNA 聚合酶和灭菌双蒸水配制的延伸液完成。延伸反应条件：95 30s，进入 40 次循环（95 5s，52 5s），72保温 3min。加入脱盐树脂对延伸产物进行脱盐纯化，脱盐后将样本点在靶板基质上形成共结晶，再应用 DP-TOF 型飞行时间质谱检测系统进行基因分型。根据每种单碱基质量不同而到达分析器的时间不同，智能分析每个位点的基因型。实验相关的基因名称、编码，SNP 编码、突变类型以及多重 PCR 和单碱基延伸引物序列见表 1。表 1 SNP 相关的基因、突变类型和引物序列基因名称（编码）SNP 编码突变类型引物类型引物序列ATM（NM_000051）rs189037G/A上游引物5-ACGTTGGATGTAGGTAGCTGCGTGGCTAAC-3下游引物5-ACGTTGGATGGTCAAAGTAGTATCAACCGC-3延伸引物5-ACTCCTCTCGCCTCCTCCCG-3rs373759C/T上游引物5-ACGTTGGATGAAGTACGTGAGTCTGATAGC-3下游引物5-ACGTTGGATGCTTCCTCTCCAGCTTAAGAC-3延伸引物5-CTCTCCAGCTTAAGACTTTCCTATT-3rs4988044T/C上游引物5-ACGTTGGATGACTCCTTCTGTTACTAACGC-3下游引物5-ACGTTGGATGTTCCAGTCTAGGCCATTACC-37现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023续表 1-1 SNP 相关的基因、突变类型和引物序列基因名称（编码）SNP 编码突变类型引物类型引物序列延伸引物5-TAATGAAACAGAATATTGCTTAC-3rs1801516G/A上游引物5-ACGTTGGATGGTCAGACTGTACTTCCATAC-3下游引物5-ACGTTGGATGGTTTGCGAGAAGTGTCGAAG-3延伸引物5-AGCAGATTTCTCCATGATTCATTTGTAT-3rs228590A/G上游引物5-ACGTTGGATGTCTATAGCAGAGTAAAGCGG-3下游引物5-ACGTTGGATGAGCAGATGGCTCTGATTCTC-3延伸引物5-GTCAGAAGAACCACCAGTGAATAT-3XRCC1（NM_006297）rs2682585A/G上游引物5-ACGTTGGATGTTCTCCCCGTAGGGTGAATG-3下游引物5-ACGTTGGATGGTGTGTGTATCAGCAGTACC-3延伸引物5-AGGAAGCTGAGGAGGGG-3rs25487T/C上游引物5-ACGTTGGATGCAGGATAAGGAGCAGGGTTG-3下游引物5-ACGTTGGATGATCGTGCGTAAGGAGTGGGT-3延伸引物5-ACCGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC-3rs1799782G/A上游引物5-ACGTTGGATGCACCTGGGGATGTCTTGTTGA-3下游引物5-ACGTTGGATGGCCAGCAGCCCACCTATAAT-3延伸引物5-AGATGTCTTGTTGATCC-3XRCC3（NM_001100118）rs861539G/A上游引物5-ACGTTGGATGTGCTCACCTGGTTGATGCAC-3下游引物5-ACGTTGGATGAATTTGACAGCCAGGCCTCC-3延伸引物5-ACAGCTCACGCAGC-3rs1799794T/C上游引物5-ACGTTGGATGATAACAGACTCACCGGTTGG-3下游引物5-ACGTTGGATGAGGAGGTCGTCACTAAACAG-3延伸引物5-CAAGTTCTCAGCAGG-3XRCC6（NM_001288976）rs2267437C/G上游引物5-ACGTTGGATGCGTGAGGATGGTATCTGCGA-3下游引物5-ACGTTGGATGACGTGTACGACCTGTCCAAAG-3延伸引物5-TGGCCCAAGTCTCCCCACCTCGGCCAG-3hOGG1（NM_001354648）rs1052133C/G上游引物5-ACGTTGGATGAGGTGCTGTTCAGTGCCGA-3下游引物5-ACGTTGGATGCCTTTGGAACCCTTTCTGCG-3延伸引物5-CTGTTCAGTGCCGACCTGCGCCAAT-3TGF-1（NM_000660）rs1800469A/G上游引物5-ACGTTGGATGGGAGAAGAGGGTCTGTCAAC-3下游引物5-ACGTTGGATGGAGCAATTCTTACAGGTGTC-3延伸引物5-TCCTGACCCTTCCATCC-3rs1982073T/C上游引物5-ACGTTGGATGCCTACCTTTTGCCGGGAGAC-3下游引物5-ACGTTGGATGTGTCGATAGTCTTGCAGGTGG延伸引物5-AGCGGTAGCAGCAGC-3rs1146634G/A上游引物5-ACGTTGGATGTGGTAAGTGTGAGTTTAGCG-3下游引物5-ACGTTGGATGAGGTGACCAGTGTGCTTAAC-3延伸引物5-CAGTGTGCTTAACCCTACTC-3TNF-（NM_000594）rs1800629G/A上游引物5-ACGTTGGATGGGAGGCAATAGGTTTTGAGG-3下游引物5-ACGTTGGATGTCTGGGCCACTGACTGATTT-3延伸引物5-GTAGGACCCTGGAGGCTGAACCCCGTCC-38现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.2023续表 1-2 SNP 相关的基因、突变类型和引物序列基因名称（编码）SNP 编码突变类型引物类型引物序列GSTP-1（NM_000852）rs1695A/G上游引物5-ACGTTGGATGGTGGACATGGTGAATGACGG-3下游引物5-ACGTTGGATGTGCTCACATAGTTGGTGTAG-3延伸引物5-GGAGGACCTCCGCTGCAAATAC-3PDE4D（NM_001104631）rs966221A/G上游引物5-ACGTTGGATGATCAGATTGGAAGGATCTGC-3下游引物5-ACGTTGGATGTCCTGTATAGGTATGAGTCC-3延伸引物5-ATCTGCTGCTGGATAAACCAC-3XPD（NM_000400）rs13181T/G上游引物5-ACGTTGGATGAGGAACCGTTTATGGCCCC-3下游引物5-ACGTTGGATGAGCCTGGAGCAGCTAGAATC-3延伸引物5-GAGCAGCTAGAATCAGAGGAGACGCTG-3XPG（NM_000123）rs17655G/C上游引物5-ACGTTGGATGACATGCGGTGGATTTTTGGG-3下游引物5-ACGTTGGATGCTGGTTTTTGGCTCTTTCGC-3延伸引物5-AAAGATGAACTTTCAGCAT-3ADPRT（NM_001618）rs1136410A/G上游引物5-ACGTTGGATGAGTTGACATCGATGGGATCCTT-3下游引物5-ACGTTGGATGGTGTTGGACCTTCTCTGCATGT-3延伸引物5-TGTCCAGCAGGTTGTCAAGCATTTCC-3LIG4（NM_001098268）rs1805388G/A上游引物5-ACGTTGGATGCACAAATCTGCAAAAGGAACG-3下游引物5-ACGTTGGATGACGAGAAGATTCATCACCGC-3延伸引物5-AAAAGGAACGTGAGATGCAACA-3XPA（NM_000380）rs3176683A/G上游引物5-ACGTTGGATGCACTAGCAGTCCTAGCCACT-3下游引物5-ACGTTGGATGTCAGAGCAGATCGTCTCAAC-3延伸引物5-GGTGTGCCAAGACGGTGA-3CFH（NM_000186）rs2708896T/G上游引物5-ACGTTGGATGCATGTTGGGCCCATGGTAAA-3下游引物5-ACGTTGGATGTGATGTTATGCCAGGTTTAG-3延伸引物5-GGTTTAGAATACTGGAGTCTCGATCA-3rs10951937A/C上游引物5-ACGTTGGATGCAGTTACAACGCCTCCACGC-3下游引物5-ACGTTGGATGGCCATTTCGTCGGGAGTCAC-3延伸引物5-AGGCCCTCCTCTCCCCAGCAGCTC-3MGMT（NM_002412）rs2296675A/G上游引物5-ACGTTGGATGTGAGACATAGCTGACACCCA-3下游引物5-ACGTTGGATGAGTCAGGGATCTGGACAACG-3延伸引物5-GGATCTGGACAACGAGGTCT-3rs12769288C/T上游引物5-ACGTTGGATGTATGGTTAGTAGTGGGAAGC-3下游引物5-ACGTTGGATGCACTGACACTCCAATCATTC-3延伸引物5-GAAGCCAAGCTGTTTCT-3MSH6（NM_000179）rs1042821G/A上游引物5-ACGTTGGATGGACAGAACGGTTGGGCCTT-3下游引物5-ACGTTGGATGTCCGTTGAGGTTCTTCGCCT-3延伸引物5-CATCCCCGCCTGGGGAAGGAGAGGCC-31.3.2Sanger 测序验证：为检验 MALDI-TOF-MS技术的准确度，筛选其中 7 份样本进行 Sanger 测序验证，测序由杭州尚亚赛生物科技有限公司完成。2结果2.1SNP 分型的检出率通过对 75 份外周血 DNA的 28 个 SNP 进行基因分型，共 2 100 个 SNP 位点的基因分型检出率为 100.0%，检测结果见表 2。以rs25487 和 rs4988044 为例，SNP 的核酸质谱法检测9现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023结果见图 1。2.2SNP 分型的准确度对其中 7 份样本共 196个 SNP 位点的核酸质谱分型结果进行测序验证，两种方法的结果符合率为 100.0%。以 TGF-1 基因 rs1800469 的 AG 基因型为例，核酸质谱法和测序法的检测结果见图 2。3讨论染色体畸变被认为是反映辐射损伤的敏感指标，但同一群体在相同的辐射环境和防护措施下，其染色体损伤情况并不相同。其次，长期接触低剂量射线，染色体损伤程度并无明显加重。随着分子检测技术的发展，研究者发现基因的多态性可造成放射敏感性的差异。DNA 损伤修复能力的差异是决定该个体遗传损伤易感性的一个重要因素。XPG与 XPD 属于同一家族基因，参与 DNA 修复和 DNA重组。国外的研究结果显示 XPD 的 rs13181 GG 基因型和 XPG 的 rs17655 GG 基因型是辐射敏感性的标志物4。XRCC 家族基因是碱基切除修复、单链断裂修复系统中重要的 DNA 修复基因，是 DNA 完整性的关键5-6。王良群等7应用多聚酶链反应-限制性长度多态性分析技术发现 XRCC1 基因多态性可能是辐射致染色体损伤的危险因素。DNA 双螺旋断裂被认为是电离辐射致细胞杀伤、染色体畸变及诱发癌症最严重的损害8。ATM 基因对辐射的敏感性体现在突变或失活后导致的基因功能的不稳定性和 DNA 双链受损修复过程发生障碍。赵君彦等9采用基于荧光标记单碱基延伸分型技术对ATM 基因的 rs373759,rs189037 和 rs4988044 三个位点进行基因分型，发现 rs189037 位点 GA/AA 基因型的个体放射敏感性增加。表 2MALDI-TOF-MS 检测结果（n=75）检测位点野生型突变杂合子突变纯合子rs189037243615rs37375934356rs498804464110rs18015167500rs228590253713rs268258511658rs2548743041rs179978230387rs8615396780rs1799794313014rs226743749242rs1052133104124rs1800469223221rs1982073302322rs11466346960rs180062963120rs169549242rs96622139306rs131816780rs17655193521rs1136410233616rs180538851204rs31766837500rs2708896103233rs1095193738325rs22966759990rs127692887050rs1042821411420图 1SNP 的质谱聚类图本研究根据文献筛选的 17 种基因与氧化应激反应、DNA 损伤修复途径和维持基因组稳定性有关。SNP 是一种遗传变异类型，不同种族的基因型频率不同，目前还未见中国汉族人群多基因多位点间关联性与辐射敏感性之间的交互作用研究。因此，构建一种可同时检测多位点的高通量的实验方法可为早期发现辐射敏感个体提供技术支撑。核酸质谱仪主要由进样系统、基质辅助激光解吸电离离子源(（matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)、飞行时间质量分析器(time of flight mass analyzer,TOF)、检测接收器和配套分析软件共五部分组成。核酸质谱分析 SNP 技术的工作原理见文献 1，其优势在于可满足不同检测量的需求，快速大范围检测的同时还能保证高灵敏10现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.2023度。其次，检测成本低，不需要荧光类试剂。基于高通量、快速、准确的特点，核酸质谱仪已被广泛应用于出生缺陷防控10-12和个性化精准医疗13-15 以及某些疾病的发病机制研究。在传染性疾病诊断领域16-18，核酸质谱检测法有更高的准确度和特异度，可以降低临床漏诊率，对于病原体的快速鉴定具有重要意义。糖尿病和冠心病等非传染性疾病也是当前社会面临的重要健康问题，核酸质谱技术在早期风险因素的筛查中发挥了重要作用19-22，为疾病的预防和控制提供一定的依据。图 2 TGF-1 基因 rs1800469 的 AG 基因型核酸质谱法和测序法结果图本实验通过对 75 份样本共 2 100 个 SNP 位点进行基因分型及对 7 份样本共 196 个 SNP 位点的测序验证，结果显示应用核酸质谱技术构建的检测17 种基因 28 个 SNP 的方法的检出率和准确度均为 100%，该方法具有快速、稳定、高通量、价格低廉且操作简便的优点。根据优化后的实验条件，作者申报的同时检测多个辐射敏感性相关 SNP位点的试剂盒已获授权国家发明专利（专利号：ZL 2020 1 0929474.X）。在后续的研究中，将以染色体畸变等作为辐射损伤的判断指标，应用构建的SNP 检测方法，验证并筛选与辐射损伤敏感性相关显著的 SNP 和标志物，从而实现早期发现辐射易感个体，保护易感人群的健康，达到预防职业病的效果。参考文献：1 张阳东,宋秀军,高峥,等.核酸质谱仪检测单核苷酸多态性的临床应用 J.医疗卫生装备,2023,44（1）：87-92.ZHANG Yangdong,SONG Xiujun,GAO Zheng,et al.Clinical application of nucleic acid mass spectrometer for detection of single nucleotide polymorphismJ.Chinese Medical Equipment Journal,2023,44(1):87-92.2 PANT S,WEINER R,MARTON M J.Navigating the rapids:the development of regulated next-generation sequencing-based clinical trial assays and companion diagnostics J.Frontiers in Oncology,2014,4:78.3 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