副溶血性弧菌特异性核酸适配体筛选.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 612 618Current Biotechnology ISSN 20952341研究论文研究论文Articles副溶血性弧菌特异性核酸适配体筛选李洁1，岳晓禹2，崔丽伟2，许文涛2，3，李相阳1*1.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；2.河南牧业经济学院食品与生物学院，郑州 450046；3.中国农业大学营养与健康系，北京 100083摘 要：副溶血性弧菌是水产品中常见的食源性致病菌，其快速检测方法逐渐被开发，适配体作为一种新兴的特异性识别元件受到广泛关注。以副溶血性弧菌作为靶标菌进行了 12 轮细胞-指数富集配体系统进化技术(cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment,cell-SELEX)，其中包括9轮正向筛选和3轮负向筛选，在每轮正筛中对PCR轮数和Lambada外切酶用量进行优化，筛选完成后进行核酸测序，并通过qPCR和流式细胞术多角度地对测序得到的序列性能进行验证。结果显示，F-28-10表现出较好的结合能力和特异性，且通过对PCR扩增轮数和Lambda外切酶用量优化后的cell-SELEX可以实现微生物特异性适配体的开发。研究结果为食源性致病微生物快速检测技术的开发提供了新的可利用的识别元件。关键词：副溶血性弧菌；适配体；SELEXDOI：10.19586/j.20952341.2023.0041 中图分类号：TS207.4,R155.5 文献标志码：ASELEX of Vibrio parahaemolyticus Specific AptamerLI Jie1，YUE Xiaoyu2，CUI Liwei2，XU Wentao2，3，LI Xiangyang1*1.Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.College of Food and Bioengineering，Henan Institute of Animal Husbandry，Zhengzhou 450046，China；3.Department of Nutrition and Health，Institute of Nutrition and Health，China Agricultural University，Beijing 100083，ChinaAbstract：As a common foodborne pathogenic bacterium in aquatic products，and a variety of rapid detection methods of Vibrio parahaemolyticus have been gradually developed.Aptamers have received widespread attention as an emerging specific identification element.In this study，12 rounds of cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment(cell-SELEX)were performed with Vibrio parahaemolyticus as the target，including 9 rounds of positive selection and 3 rounds of negative selection，and the number of PCR rounds and the dosage of Lambada exonuclease were optimized in each round of positive selection.Nucleic acid sequencing was performed after SELEX，and the obtained sequence performance was verified from multiple angles by qPCR and flow cytometry.The results showed that F-28-10 showed better binding ability and specificity.And the development of aptamers can be achieved by optimizing the number of PCR amplification rounds and the amount of Lambda exonuclease in cell-SELEX.This method provided a new usable identification element for the development of rapid detection technology of foodborne pathogenic microorganisms.Key words：Vibrio parahaemolyticus；aptamer；SELEX副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水产品中常见的食源性致病菌，根据报道，其已超过沙门氏菌成为造成细菌性中毒最主要的微生物1-2。副溶血性弧菌属于革兰氏阴性菌，作为中等嗜盐菌，其在1%9%NaCl溶液中均可以生长繁殖，最佳生长浓度约为3%NaCl，最佳生长温度收稿日期：20230328；接受日期：20230418基金项目：北京市景观休闲农业创新团队项目(BAIC09-2022)。联系方式：李洁E-mail:；*通信作者 李相阳E-mail:李洁，等：副溶血性弧菌特异性核酸适配体筛选3035，低于4时停止生长，因此在温暖的海水中优先生长。根据菌体O型抗原和荚膜K型抗原的不同，副溶血性弧菌可以分为13种O型和71种K型3-4。副溶血性弧菌的爆发不仅会使大量的水产动物快速死亡，造成严重的经济损失，还会使消费者因食用被污染的水产品而引起流行性腹泻，危害消费者的身体健康5-7。因此，针对副溶血性弧菌筛选核酸适配体对于其快检技术的开发具有重要的意义。核酸适配体是目前备受关注的一种识别元件，通过其特异性识别可以将靶标浓度归一化为核酸分子，并进一步与不同的信号输出方式结合实现快速检测8-10。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）获得的一段寡核苷酸序列，可以特异性的识别靶标物质11。1990年首次被开发，此后的三十多年中多种靶标物质的适配体陆续被开发和应用，包括农药、重金属、抗生素和微生物等12-13。本研究利用cell-SELEX技术对副溶血性弧菌的适配体进行了筛选，并对每轮筛选中的PCR轮数和Lambda外切酶使用量进行了优化，以期为副溶血性弧菌的快速检测奠定基础。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验菌种实验使用的副溶血性弧菌ATCC 17802、单增李斯特氏菌CMCC 54002、金黄色 葡 萄 球 菌 ATCC 29213 和 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 CMCC 50115由中国农业大学农业部农业转基因生物安全评估（食品）重点实验室提供。1.1.2实验试剂rTaq 酶、dNTP、100 bp DNA Marker 和核酸染料购自北京天根生化科技有限公司；西班牙琼脂糖购自北京沃比森科技有限公司；qPCR Mix购自北京全式金生物科技有限公司；3%氯化钠碱性蛋白胨水购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。1.1.3试剂配制1BB 缓冲溶液：称取 1.212 g Tris、0.175 4 g NaCl、0.203 3 g MgCl2 6H2O 溶于150 mL去离子水中，调至pH 7.5，加入去离子水补足至200 mL。适 配 体 处 理：将 合 成 的 适 配 体 粉 末 于4 4 000 r min-1离心2 min后加入一定量的超纯水得到100 mol L-1母液，置于-20 储存。每次使用前将 100 mol L-1母液稀释成相应的浓度，置于95、金属浴中10 min，冰上立即冷却10 min以获得变性的核酸适配体，便于适配体与靶标的后续结合。1.1.4实验仪器LineGene 9600plus 荧光定量PCR检测仪购自杭州博日科技有限公司；A300基因扩增仪购自杭州朗基科学仪器有限公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂；凝胶成像仪购自上海勤翔科学仪器有限公司；流式细胞仪购自贝克曼库尔特有限公司；可调式混匀仪旋涡混合器购自北京开源国创科技有限公司；气浴恒温振荡仪购自北京得利特科技有限公司；恒温金属浴购自北京富德安科技有限公司；CF1524R台式高速冷冻离心机购自杭州恒流科技有限公司；Nanodrop 超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司。1.2实验方法1.2.1副溶血性弧菌生长曲线测定取活化好的菌液1 mL加入含30 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水液体培养基的50 mL锥形瓶中，37 200 r min-1下培养。每隔1 h测量一次OD620，绘制生长曲线以确定菌生长的对数期。选取合适培养时间的菌液进行平板计数。1.2.2引物退火温度优化初始文库由35个碱基的核心区域和两端各20个碱基的引物区域组成，即 5-ATCCATTGCCACTGACTACC-N10-AGGTTAAGAGGCGCT-N10-GAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3，用于 PCR扩增的引物分别为上游引物5-ATCCATTGCCACTGACTACC-3，下 游 引 物5-ACTAACGACCGACTGACTTC-3，其中下游引物的5端磷酸化修饰用于单链制备。在实验开始前将引物在5565 之间进行退火温度的优化，扩增后利用4%琼脂糖凝胶电泳进行结果验证。1.2.3适配体筛选过程本筛选过程一共为12轮，包括9轮正向筛选和3轮反向筛选，在反向筛选中选择国标中与副溶血性弧菌出现在同一食品中的微生物作为负筛靶标，包括金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌，负筛靶标的使用可以提高筛选到的适配体特异性。具体筛选中使用的各组分加样量如表1所示，在12轮的筛613生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology选中逐渐减小菌液加样量、减短孵育时间及增加孵育后洗涤次数以增加筛选压力。双链的大量扩增使用 PCR 方法，单链获得采用 Lambda 酶切方法，在每轮扩增中对PCR轮数和Lambda外切酶用量进行优化。次级文库纯化使用醇沉法。12轮筛选完成后送测序公司进行序列测序并对得到的序列进行性能探究，亲和力则利用Saika等15报道的方法进行计算。2结果与分析2.1副溶血性弧菌生长曲线在接菌完成后每小时测量一次 OD620以对副溶血性弧菌生长的对数期进行探究。由图 1可知，经过1 h延滞期副溶血性弧菌进入快速生长阶段，选择培养5 h的菌液进行平板计数得到此时菌落总数约为 109 CFU mL-1，适合用于适配体筛选，因此选用 5 h 作为后续菌液的培养时间。2.2引物退火温度优化合适的退火温度有利于质量更高的 PCR产物产生16。在 5565 之间进行退火温度优化，由图 2 可知，随着退火温度的不断升高非特异性产物条带（图 2 中 75 bp 产物以外部分）越来越明亮，因此选择 55 作为后续实验的退火温度。2.3适配体筛选随着筛选中PCR扩增产生的偏差和Lambda外切酶在单链生产中发生的切割偏差，PCR过程中会产生非特异性产物，因此每轮扩增中需对PCR轮数进行优化，以第4轮筛选的PCR优化为例，随着扩增轮数的增加，非特异性产物越来越多，如果扩增轮数过少则不能产生足够的目标产物，因此，在第 4 轮中选择 28 轮作为扩增轮数（图 3）。PCR产物的不同则需要不同的Lambda外切酶用量，酶切时间过长和酶量使用过多都会造成目标序列的损失，而酶切时间过短和酶量使用过少则会导致目标单链的产量不足，难以有效构建次级图1副溶血性弧菌的生长曲线Fig.1Growth curve of Vibrio parahaemolyticus表1筛选过程中各组分加样量及反应时间Table 1Sample loading and reaction time of each component in the SELEXSELEX轮数123456789101112文库加入量/pmol1 00010050501 000501 00010050菌液加入量/L1 0001 0008006008005005001 0005001 000500400孵育时间/min907060609060509040903030洗涤次数344404505505PCR轮数292926282227262622Lambda外切酶用量/L110.81.51.51.51.51.51BSA加入量/L03690121502002530614李洁，等：副溶血性弧菌特异性核酸适配体筛选文库。以第3轮筛选的酶切优化为例，在45 L双链产物中加入0.8、1.0、1.2、1.5和2 L Lambda外切酶和5 L缓冲液，结果如图4所示，0.8 L产生的单链最多。经过12轮的筛选后进行测序及同源性分析，从中初选了10条序列进行qPCR，当适配体与靶标菌具有较好的结合效果时，同样的菌数可以结合更多的适配体数量，因此产生更小的Ct值，由图5可知，F-3-2和F-28-10在10条序列中更好的结合效果。利用流式细胞术对这2条序列进行适配体结合效果和特异性的进一步探索。如图6所示，2条适配体均表现了较好的特异性，其中F-28-10特异性表现更佳。由图7阴性菌和适配体孵育后的菌体荧光对比可知，2条适配体均具有较好的结合能力且F-28-10表现更佳。因此，F-28-10为筛选得到的效果最佳的适配体，序列为 5-ATCCATT GCCACTGACTACCAATATCACGTAGGTTAAGAGGCGCTCTCCCACCAAGAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3。注：MDL2000 DNA maker。图2退火温度优化结果Fig.2Results of annealing temperature optimization注：MDL2000 DNA maker。图3第4轮筛选PCR轮数优化结果Fig.3Results of PCR cycle optimization in fourth round of SELEX注：M100 bp DNA marker；1PCR扩增后的双链DNA；红色方框中为酶切后产生的单链核酸产物。图4第3轮筛选Lambda外酶切优化结果Fig.4Results of Lambda exonuclease enzyme optimization in third round of SELEX615生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology进一步对 F-28-10的亲和力进行研究，适配体浓度按 10010-4 nmol L-1梯度对 F-28-10 做标准曲线（图8），获得了用于适配体结合浓度计算的回归方程 y=（8.890.30）-（3.730.14）x（R2=图510条候选适配体序列的qPCR结果Fig.5Results of qPCR for 10 candidate aptamer sequences图6适配体与细菌结合的流式细胞术分析Fig.6Flow cytometric analysis of aptamers binding to bacteria图7适配体F-3-2和F-28-10结合效果对比Fig.7Comparison of binding effects of aptamers F-3-2 and F-28-10616李洁，等：副溶血性弧菌特异性核酸适配体筛选0.995）。固定副溶血性弧菌浓度，增加适配体浓度获得适配体-靶标解离饱和曲线。将1、10、50、100、200 nmol L-1浓度的适配体序列与靶标孵育，qPCR后计算结合浓度获得了解离饱和曲线（图9）。Kd值越低证明适配体与靶标结合越好，利 用 Origin 软 件 拟 合 得 到 F-28-10 的 Kd值 为44.3131.46 nmol L-1。3讨论自1950年首次在日本被发现，副溶血性弧菌就成为了全球性的卫生安全问题，并随着我国居民生活水平提升和水产品消费量的不断增长成为我国细菌性中毒事件发生的首要原因。在合适的条件下副溶血性弧菌将在 34 h内快速生长17，因此用于副溶血性弧菌检测的适配体传感器的开发近年来受到广泛关注18-19，然而相比于大肠杆菌等其他常见食源性致病菌，副溶血性弧菌适配体筛选的数量较少，因此本研究通过在12轮的筛选中逐渐增加筛选压力，并对每轮PCR扩增轮数和Lambda外切酶用量进行优化，同时在测序后通过qPCR和流式细胞术技术验证分析得到了一条在特异性和结合能力方面表现最佳的适配体序列F-28-10，研究结果丰富了副溶血性弧菌在适配体传感器开发中识别元件的选择。参 考 文 献 1 JIANG H J,TAN R,JIN M,et al.Visual detection of Vibrio parahaemolyticus using combined CRISPR/Cas12a and recombinase polymerase amplificationJ.Biomed.Environ.Sci.,2022,35(6):518-527.2 赵颖,马琳.20182021年北京市大兴区由副溶血性弧菌引起的食源性疾病病原学特征及其耐药性J.卫生研究,2022,51(4):667-671,679.3 XIE T,YU Q,TANG X,et al.Prevalence,antibiotic susceptibility and characterization of Vibrio 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