60Co-γ射线辐照对月季“蜻蜓”的诱变效应及突变体ISSR分析.pdf

为培育花色独特、栽培品质优良的新型蓝色月季，使用60Co-射线对月季“蜻蜓”进行辐照处理，并设置40，50，60 Gy三个剂量梯度.月季“蜻蜓”辐照产生的诱变效应表现为：（1）辐照处理均会对植株造成一定的损伤和产生抑制生长效应，且高剂量辐照处理的植株在生长过程中，出现生长点或老叶叶尖枯死、新叶生长缓慢、新芽不再萌发、植株根部萎蔫且出现腐烂发黑现象；（2）突变体在花型、花色、花期、花瓣等花部形状上与对照组（CK）存在较大差异，具体表现在突变体的最大花径增大或缩小、花色改变、花期缩短、花瓣数量和花瓣形态改变.采用简单重复序列区间扩增多态（ISSR）分子标记技术及非加权组平均法（UPGMA）对辐照处理的月季“蜻蜓”材料进行遗传多样性和亲缘关系聚类分析，发现月季“蜻蜓”经过辐照诱变之后遗传物质有不同程度的突变.以上结果为培育优质蓝色月季品种奠定了基础.关键词：60Co-射线；物理诱变；简单重复序列区间扩增多态（ISSR）；分子育种；月季中图分类号：Q 94.3 文献标志码：A 文章编号：1000-5137（2023）04-0443-1060Co-mutagenic effect of irradiation on Chinese rose variety Dragonfly and analysis of mutant ISSRXIA Meng1，ZUO You2，YANG Binan1，LI Bowen1，MING Feng1*（1.College of Life Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2.Shenghua Zizhu College，Shanghai 200241，China）Abstract：In order to cultivate a new type of blue rose with unique flower color and excellent cultivation quality，the radiation of 60Co-was used irradiating the Chinese rose variety Dragonfly，and three doses of 40，50 and 60 Gy were set.The study found that the mutagenesis caused by the irradiation of Chinese rose Dragonfly is reflected in：firstly，the irradiation treatment has a certain damage and growth inhibition effect on the plants，and the growth points or old leaf tips of the plants treated with high-DOI：10.3969/J.ISSN.1000-5137.2023.04.007收稿日期：2021-11-27基金项目：上海市花卉产业体系建设项目（沪农科产字（2022）第8号）作者简介：夏 萌（2001），女，本科生.E-mail：*通信作者：明 凤（1971），女，教授，主要从事植物非生物逆境遗传学方面的研究.E-mail：引用格式：夏萌，左悠，杨碧楠，等.60Co-射线辐照对月季“蜻蜓”的诱变效应及突变体ISSR分析 J.上海师范大学学报（自然科学版），2023，52（4）：443452.Citation format：XIA M，ZUO Y，YANG B N，et al.60Co-mutagenic effect of irradiation on Chinese rose variety Dragonfly and analysis of mutant ISSR J.Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2023，52（4）：443452.2023年上海师范大学学报（自然科学版）J.Shanghai Normal Univ.（Nat.Sci.）dose irradiation die during the growth process，the new leaves grow slowly，the new buds do not germinate again，and the plant roots wilt and rot and blacken.Secondly，the mutant has great differences with control check（CK）in flower shape，flower color，flowering period，petal and so on，which is specifically reflected in the increase or decrease of the maximum flower diameter，the change of flower color，the shortening of flowering period，the change of petal number and petal morphological characteristics.The genetic diversity and genetic relationship of irradiated the Dragonfly were analyzed by inter-simple sequence repeat（ISSR）molecular marker and unweighted pair-group method with airthmetic（UPGMA）cluster analysis.It was found that the genetic material of the Dragonfly had different degrees of mutation after mutational irradiations.The results laid a foundation for cultivating high-quality blue rose varieties.Key words：60Co-radiation；physical mutagenesis；inter-simple sequence repeat（ISSR）；molecular breeding；Rosa chinensis Jacq.0 引 言 月季（Rosa chinensis Jacq.）是现代月季的简称，是由蔷薇属内种间的反复杂交和长期选择而育成的四季开花的杂交品种1.月季花期长、花色丰富、株型各异，且具有较高的观赏价值、食用价值和药用价值，再加上其对生态环境的适应性较强，因此在园林造景、切花、盆栽等多个领域占有重要地位2-3.在中国，月季育种源远流长，有1 000多年的历史.月季育种目标一方面集中在改变其外部形态上，如追求较高观赏性而进行的花型、花色、株型以及花香育种；另一方面，育种也关注改善月季的栽培品质，包括其耐寒和耐热性、抗病虫害的能力以及瓶插寿命4.为实现多种多样的育种目标，目前常用的月季有效育种方式主要有杂交、芽变、诱变和分子育种等5.辐照诱变育种具有变异频率高、变异谱大、后代稳定快、育种年限短等特点，不仅可以使植物的形态结构、生理生化等方面发生变异，而且能得到其他育种方法无法产生的新性状6-7.其中，60Co-射线是最常用的辐照射线，其穿透力极强，突变率高，易引起植物形态结构和生理生化的变异，可在较短时间内选育新品种，并且诱变成本低8，目前已经广泛应用于植物的诱变育种9-17.简单重复序列区间扩增多态（ISSR）分子标记技术基于简单重复序列（SSR）的特点，用于检测2个 SSR之间一段DNA序列上的多态性18-20.与其他分子标记相比，ISSR具有操作方便、模板用量少、稳定性高、成本低廉、结果重复性高等优点，在园艺作物遗传结构与遗传多样性分析方面应用广泛，在植物品种鉴定、遗传作图、遗传多样性、系统发育进化等研究领域中是一种有效的研究技术手段21-25.本研究通过用60Co-射线对月季“蜻蜓”进行辐照诱变，探究了60Co-对该月季品种造成的诱变效应，并结合ISSR分子标记技术对产生突变的植株进行聚类分析，以此作为评估材料突变程度的依据，也为月季新品种的培育提供了一定参考.1 材料与方法 1.1材料与试剂植物材料为切花月季“蜻蜓”（栽种于上海师范大学种质资源开发中心塑料大棚内）.生化试剂包括：Taq DNA聚合酶，10PCR buffer，25 mmolL-1 氯化镁（MgCl2，上海Vazyme生物科技有限公司）；dNTPs，ddH2O（上海擎科生物）.1.2仪器与设备Icen-24高速台式离心机，杭州奥盛仪器有限公司；FR-250系列电泳仪，上海复日科技有限公司；GenoSens 1850凝胶成像仪，上海勤翔科学仪器有限公司；Biometra Tone 96G聚合酶链式反应（PCR）反应仪，德国Biometra GmbH/Analytik Jena AG；分光测色仪，深圳市三恩时科技有限公司；游标卡尺，德国美耐特.1.3方 法1.3.1辐照处理选取发育良好、生长一致的月季“蜻蜓”共9株，送至上海农科院束能辐照中心进行辐照处理（图1），选444第4期夏萌，左悠，杨碧楠，等：60Co-射线辐照对月季“蜻蜓”的诱变效应及突变体ISSR分析定40，50，60 Gy三个剂量进行60Co-辐照，辐照剂量率150 Gyh-1，每个辐照梯度处理组含3盆植株，对植株编号（表1）.辐照处理后继续栽种在上海师范大学种质资源开发中心塑料大棚内进行培养与观察.1.3.2理化指标的测定（1）植株花期测定：参照MA等26对月季开花阶段的划分，记录植株开花的5个阶段：未开的花蕾（S1）、半开的花蕾（S2）、全开的花蕾（S3）、初开的花朵（S4）、盛开的花朵（S5），统计开花植株由S1S5花期的长短.（2）植株花瓣光谱三刺激（CIE）值测定：使用分光测色仪，取开花阶段为S5的第二轮花瓣，光源观察者参数取D65/10，测定花瓣CIE值.（3）植株最大花径测量：植株进入开花期后，选择开花阶段为S5的花朵，使用游标卡尺测定其最大花径.（4）基因组DNA提取：使用十二烷基硫酸钠（SDS）法提取辐照材料的基因组DNA.取0.10.2 g样品，经过液氮冷冻处理后研磨成粉；加入65 预热的DNA提取缓冲液600 L，于65 保温30 min，加入200 L乙酸钾，摇匀，静止20 min；12 000 rmin-1离心6 min后取500 L上清液，加入等体积异丙醇，静置20 min；进行12 000 rmin-1离心10 min，弃上清液并加入2倍体积的70%（体积分数）的乙醇，洗去盐离子，离心后晾干；加入50 L无菌水溶解，并将样品质量浓度稀释至10 ngL-1，备用.（5）引物筛选及扩增反应：引物从University of British Columbia所设计的引物中挑选，并由上海擎科公司合成，从中筛选出7条引物进行PCR分析.扩增反应在Biometra Tone 96G PCR仪上进行.实验体系（20 L）为：Taq DNA聚合酶，0.2 L；10PCR buffer，2.0 L；25 mmolL-1 MgCl2，2 L；dNTPs，0.8 L；引物，2 L；ddH2O，7 L；DNA（10 ngL-1）模板，1 L.扩增程序：94 预变性4 min；进行45个循环，循环包括94 变性1 min，4853 退火55 s，72 延伸1.5 min；最后，72 延伸8 min.电泳条件：采用1.5%琼脂糖凝胶，1TBE缓冲液，EB染色，120 V电压下电泳4045 min，凝胶成像仪观察并拍照分析.1.3.3数据处理（1）用Excel进行数据整理与分析；用Photoshop整合图片；用Prism 9制图；用Student s t-test进行显著性检验和分析.（2）ISSR条带统计及数据分析：每个引物对8份样品（含CK）进行扩增，对PCR产物电泳后，在凝胶的某一多态位置上将 DNA 条带按有（记为“1”）或无（记为“0”）进行人工统计，利用非加权组平均法（UPGMA）法构建聚类树状图.2 结果分析 2.1辐照对植株生长发育状况的影响由于辐照处理具有滞后效应，自辐照处理后，以30 d为一个周期统计植株成活情况（图1）.由图1可知：经辐照处理后的植株与对照组（CK）相比，生长发育均受抑制，成活率低.且随着辐照剂量的增加，植株受损伤和抑制生长的效应愈加明显，50，60 Gy处理组的死亡率均显著高于40 Gy处理组，且植株在生长早期出现衰亡现象.辐照处理120 d后，高剂量处理组的植株成活率显著低于低剂量处理的植株，且在生长过程中出现自行枯死的现象，表现为植株生长点或老叶叶尖枯死、新叶生长缓慢、新芽不再萌发，植株根部萎蔫且出现腐烂发黑，其中60 Gy处理组在辐照处理60 d后最早出现自行枯死现象.2.2辐照对植株花期、花色、花型、花瓣形态的影响2021年38月，持续观察比较月季“蜻蜓”辐照处理组与CK的进入生殖生长期的生长情况（表2）.表1辐照处理剂量及分组辐照剂量/Gy040编号CK1CK2CK31-11-21-3辐照剂量/Gy5060编号2-12-22-33-13-23-34452023年上海师范大学学报（自然科学版）J.Shanghai Normal Univ.（Nat.Sci.）各处理组开花情况如下：CK进入生殖生长期植株长势良好，均能正常开花；40 Gy处理组1-2植株虽能存活，但植株孱弱，生殖生长受到辐照影响，无花苞、不开花，1-1、1-3植株存活，正常开花且花朵出现特异性表型；50 Gy处理组2-2，2-3植株凋亡，2-1植株正常开花且花朵出现特异性表型；60 Gy处理组3-2，3-3植株凋亡，3-1植株存活但仅开出少量花朵，且出现花朵畸变表型.实验结果显示：辐照处理对植株正常开花产生抑制作用，辐照处理后植株开花率约为44.4%，而CK开花率为100%.同时，随辐照处理剂量增大，辐照对开花的抑制效应愈加明显，具体表现为，40 Gy处理组植株开花率约 66.7%，而 50 Gy 和 60 Gy 处理组开花率均降至33.3%.以下进一步比较辐照处理后的正常开花植株与 CK 在花型、花期、花色、花瓣数量及形态4个方面的变异情况.2.2.1辐照对植株花型的影响统计正常开花植株的花朵表型，结果显示：辐照处理对植株花型均产生了一定的诱变效应，如图2（a）所示，其中1-1，1-3，2-1植株特异性表型尤为明显（1-1植株在开花过程中出现两种花型，分别图1辐照处理后0210 d植株成活情况.（a）CK；（b）40 Gy；（c）50 Gy；（d）60 Gy（*表示差异，*表示显著性差异，*表示极显著性差异，下同）.表2植株生殖生长期的生长发育及开花情况辐照剂量/Gy0405060实验组编号CK1CK2CK31-11-21-32-12-22-33-13-23-3植株生殖生长期生长发育及开花情况植株存活、开花植株存活、开花植株存活、开花植株存活、开花，且出现特异性表型植株存活、不开花植株存活、开花，且出现特异性表型植株存活、开花，且出现特异性表型植株凋亡植株凋亡植株存活、开花，但花朵畸变植株凋亡植株凋亡446第4期夏萌，左悠，杨碧楠，等：60Co-射线辐照对月季“蜻蜓”的诱变效应及突变体ISSR分析编号为1-1-1，1-1-2）.测量各突变体花朵最大花径，如图2（b）所示，辐照产生的诱变效应体现在花径增大和减小两个方面，且对于花径减小的突变体，其花色、花质改变程度更大.记录辐照处理后植株的开花表型，发现高剂量辐照大大增加了植株的不利突变率，使植株丧失观赏价值，具体表现为3-1植株开花后出现花朵畸变现象，表现为花瓣数目减少、花瓣畸形、花萼及花冠无法正常展开，如图2（c）所示.2.2.2辐照对植株花期的影响统计正常开花植株由S1S5花期的长短，结果显示：40 Gy辐照处理组1-1，1-3植株与CK相比花期差异不显著，而50 Gy处理组2-1植株由S1S5花期相较于CK明显缩短，开花速度明显增快，如图3（c）所示.进一步对比CK与2-1植株在开花过程中S1S5各阶段的表型变化，如图3（a）和3（b）所示，2-1的花期缩短是因其在开放过程中由S2进入S3的时间缩短.2.2.3辐照对花瓣花色的影响辐照处理后持续观察植株开花后花色的变化，如图4（a）所示，经辐照处理后的植株花色与CK的相比，均有一定程度的改变，其中1-1-2和2-1的花色与CK的相比，改变程度最大.使用分光测色仪测量花朵的CIE值，辐照处理后植株的CIE值与CK的相比均有差异，其中花色改变最为明显的1-1-2和2-1与CK相比，在CIE值中的b*和a*上差异最大，如图4（b）所示.2.2.4辐照对植株花瓣形态和数量的影响对辐照处理后的开花植株S5期花朵花瓣进行计数、形态观察，如图5（a）和5（b）所示.经辐照处理图2开花植株表型观察.（a）辐照处理后CK与突变体表型；（b）辐照处理后CK与突变体花朵平均花径；（c）突变体3-1开花后出现的花朵畸变现象图3CK，2-1植株开花期表型及CK与各突变体花瓣表型.（a）CK植株在S1S5期额表型变化；（b）2-1植株在S1S5期的表型变化；（c）CK与各突变体花期长度统计4472023年上海师范大学学报（自然科学版）J.Shanghai Normal Univ.（Nat.Sci.）产生的开花突变体的平均花瓣数量与CK相比有所改变，1-1-1花瓣数量增加，1-1-2，1-3，2-1花瓣数目显著减少.同时，辐照处理后，植株花瓣形态有所改变，CK花瓣近卵形，边缘有轻微锯齿状，而辐照处理后的植株花瓣边缘锯齿状更明显.1-1-1，1-1-2花瓣边缘呈明显波浪状，边缘缺刻呈掌状裂纹.1-3花瓣形状更为狭长，基部较CK明显变窄，花瓣边缘锯齿状更为明显.2-1个别花瓣出现独特的缺刻、不对称生长现象.图5CK与各突变体S5期（a）离体花瓣形态（从左向右依次为第15轮花瓣）和（b）平均花瓣数目统计图4CK与花色改变程度较大的突变体（a）花朵表型及（b）CIE值测定.注：a*代表亮度从红色（正）到绿色（负），b*代表从黄色（正）到蓝色（负），L*代表从黑色（0）到白色（100）448第4期夏萌，左悠，杨碧楠，等：60Co-射线辐照对月季“蜻蜓”的诱变效应及突变体ISSR分析2.3突变体ISSR分析2.3.1ISSR及多态性分析本研究在李敏等27的ISSR-PCR反应体系上进行改良后，对辐照处理后的植株1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1和CK进行ISSR分子标记（3-2、3-3植株死亡）.通过对引物退火温度、循环数等的筛选，对月季“蜻蜓”的ISSR-PCR的反应体系做了调整（见1.3.2（5）.分析结果（表3）显示：通过与Marker进行比较，发现辐照处理后的月季“蜻蜓”材料及CK的全基因组模板DNA的ISSR-PCR扩增的片段在2502 000 bp范围内，7条引物共扩增出44个条带，其中多态性条带有 35 条，总体多态性比例为 79.5%.其中有些引物获得的条带多态性较高，例如引物 UBC808，UBC891多态性比例高达100%.2.3.2辐照处理后月季“蜻蜓”种间遗传相似聚类分析根据ISSR扩增的结果，使用UPGMA法构建聚类树状图，对辐照处理后的植株1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1和CK处理后进行聚类分析，如图6所示.图中可见，1-1，2-2与CK聚在同一个主支上，表明其虽然有突变，但突变程度不高.根据聚类图进行划分，其中2-1，3-1与CK遗传距离最远，突变程度最高.推测2-1，3-1突变体基因组DNA相对正常的植株在多位点发生了变异.表37个ISSR引物序列的反应体系和多态性分析引物名称UBC808UBC880UBC891UBC807UBC840UBC842UBC809引物序列AGAG AGAG AGAG AGAG CGGAG AGGA GAGG AGAHVH TGT GTG TGT GTG TGAGAG AGAG AGAG AGAG TGAGA GAGA GAGA GAGA YTGAGA GAGA GAGA GAGA YGAGAG AGAG AGAG AGAG G退火温度/53.048.050.550.553.053.053.0扩增条带5574689多态性条带5473457多态性比例/%10080.010075.066.762.577.8图6ISSR图谱及各植株聚类分析图.（a）部分引物ISSR图谱（UBC809，UBC891，UBC808）（从左向右植株依次为：CK，1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3植株死亡，M为DL2000Marker）；（b）各植株聚类分析图4492023年上海师范大学学报（自然科学版）J.Shanghai Normal Univ.（Nat.Sci.）3 讨 论 植物在受到电离辐照后，会表现出种子萌发、植物生长、开花等被刺激现象，植株大小和产量也会受影响，同时，活性氧产生以及DNA链发生断裂的情况都会增加28.JAN等29认为，辐照后的植物器官可能由于产生自由基、细胞损伤，以及辐照次生效应的影响，出现发芽率和存活率下降的现象，这与本研究的结果基本一致.辐照诱变不同于一般的方法，它可以单一地改变植株的某个基因或性状，其突变谱特别宽，突变频率也很高30.据李多芳等31的报道，利用中子辐照百日草干种子之后，得到了花部性状变异类型多样的植株.在本研究中，辐照对月季“蜻蜓”产生的诱变效应主要体现在花部性状上，其花期、花色、花型、花瓣4个方面均发生改变.已有利用ISSR技术对兰花辐照诱变苗的遗传变异进行分析，研究其突变性状形成原因的相关报道32，本研究对月季“蜻蜓”诱变苗进行了ISSR遗传变异分析，比较突变体与CK谱带，发现两者存在差异，推测诱变苗是由基因突变引起的.因此，突变植株需要特别加强管理，防止中途死苗，对发现的突变现象要仔细观察，同时结合各自花卉的生长习性，严格控制肥、水条件，加强病虫害防治.4 结论 本研究通过60Co-射线对切花月季“蜻蜓”进行辐照诱变，发现诱变效应体现在突变体花期、花色、花型、花瓣等花部性状上，与CK有明显差别.结合ISSR分子标记技术对产生突变的植株进行聚类分析，发现突变体与CK在遗传层面存在一定差异.本研究为开展月季新品种培育提供了一定参考.参考文献：1王丽娜，刘青林.月季主要性状的遗传规律 J.农业科技与信息（现代园林），2008（6）：79-83.WANG L N，LIU Q L.The inheritance of major traits in roses J.Agricultural Science and Information（Modern Garden），2008（6）：79-83.2陈俊愉.中国花卉品种分类学 M.北京：中国林业出版社，2001.CHEN J Y.Taxonomy of Chinese Flower Varieties M.Beijing：China Forestry Press，2001.3中国农学会遗传资源分会.中国作物遗传资源 M.北京：中国农业出版社，1994.Genetic Resources Society of Chinese Agricultural Society.Crop Genetic Resources in China M.Beijing：China Agricultural Press，1994.4贺蕤，杨希，刘青林.月季育种的国内现状和国际趋势 J.中国园林，2017，33（12）：41-47.HE R，YANG X，LIU Q L.Domestic status and international trend for rose breeding J.Chinese Garden，2017，33（12）：41-47.5连莉娟，李漫莉，刘青林.中国现代月季品种的引进、培育及生产 C/中国观赏园艺研究进展，2011.北京：中国林业出版社，2011：362-366.LIAN L J，LI M L，LIU Q L.Introduction，breeding and production of modern rose cultivars in China C/Progress of ornamental horticulture research in China，2011.Bejing：China Forestry Publishing House，2011：362-366.6袁媛，刘春贵，包建忠，等.观赏植物射线辐射育种研究进展 J.分子植物育种，2022，20（24）：8207-8215.YUAN Y，LIU C G，BAO J Z，et al.Ornamental plant research progress in radiation breading J.Molecular Plant Breeding，2022，20（24）：8207-8215.7王丹，任少雄，苏军，等.核技术在观赏植物诱变育种上的应用 J.核农学报，2004，18（6）：443-447.450第4期夏萌，左悠，杨碧楠，等：60Co-射线辐照对月季“蜻蜓”的诱变效应及突变体ISSR分析WANG D，REN S X，SU J，et al.Application of nuclear technology in radiation breeding of ornamental plants J.Acta Agriculturae Nucleatae Sinica，2004，18（6）：443-447.8吴潇，齐开杰，殷豪，等.诱变技术在落叶果树育种中的应用 J.园艺学报，2016，43（9）：20.WU X，QI K J，YIN H，et al.Application of mutagenesis in breeding deciduous fruit trees J.Journal of Horticulture，2016，43（9）：20.9郭安熙，陈树国.菊花花色辐照诱变研究 J.核农学报，1997，11（2）：65-73.GUO A X，CHEN S G.Study on the technique of inducing mutation breeding in chrysanthemum J.Acta Agriculturae Nucleatae Sinica，1997，11（2）：65-73.10强继业，陈宗瑜，李佛琳，等.60Co-射线辐照对球根海棠、蝴蝶兰生长及SOD和CAT活性影响 J.种子，2004，23（4）：8.QIANG J Y，CHEN Z Y，LI F L，et al.Effects of 60Co-rays irradiation on the growth，SOD and CAT activities of Begonia and Phalaenopsis J.Seeds，2004，23（4）：8.11魏国，王雯雯，项艳.晚香玉射线辐照的生物学效应 J.核农学报，2009（5）：799-804.WEI G，WANG W W，XIANG Y.Mutagenic effects of-rays irradiation on Polianthes tuberose L.J.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2009，23（5）：799-804.12李树发，张颢，邱显钦，等.切花月季60Co-辐照诱变育种初报 J.核农学报，2011，25（4）：713-718.LI S F，ZHANG H，QIU X Q，et al.Preliminary report on 60Co-rays irradiation mutagenesis breeding in cut-flower roses J.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2011，25（4）：713-718.13龚束芳，刘恩慧，姜童童，等.尖叶石竹种子的EMS和60Co-诱变 J.草业科学，2017，34（11）：2226-2234.GONG S F，LIU E H，JIANFG T T，et al.Analysis of EMS and 60Co-mutagenesis of of Dianthus spiculifolius seeds J.Pratacultural Science，2017，34（11）：2226-2234.14李瑜，王萍，耿兴敏，等.60Co-辐照对桂花幼苗生长及生理指标的影响 J.西北农业学报，2017，26（1）：61-69.LI Y，WANG P，GENG X M，et al.Effects of 60Co-rays irradiation on seedling growth and physiological indexes of Osmanthus fragranss J.Acta Agriculturae Boreali-accidentalis Sinica，2017，26（1）：61-69.15傅巧娟，李春楠，沈国正，等.一串红新品种红运的选育与SRAP鉴定 J.分子植物育种，2018，16（6）：2053-2059.FU Q J，LI C N，SHEN G Z，et al.Breeding and SRAP identification of a new scarlet sage variety Hongyun J.Molecular Plant Breeding，2018，16（6）：2053-2059.16熊燕，韩辉，刘畅，等.60Co-辐照对丛生福禄考植株形态的影响 J.林业科技，2019，44（3）：33-34，46.XIONG Y，HAN H，LIU C，et al.Effects of 60Co-rays irradiation on growthform of Phlox subulate J.Forestry Science and Technology，2019，44（3）：33-34，46.17林兵，钟淮钦，黄敏玲，等.60Co-射线辐照对荷兰鸢尾花色诱变效应的研究 J.核农学报，2019，33（4）：633-639.LIN B，ZHONG H Q，HUANG M L，et al.The study of 60Co-ray irradiation effects on flower color of Iris hollandica J.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2019，33（4）：633-639.18ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification J.Genomics，1994，20（2）：176-183.19李娟玲，刘国民，宫庆龙，等.鹧鸪茶种质资源 ISSR 分子标记中的引物筛选 J.农业科学与技术：英文版，2009，10（6）：40-43，46.LI J L，LIU G L，GONG Q L，et al.Primer screening on germplasm resources of Mallotus oblongiolus by ISSR molecular marker J.Agricultural Science and Technology：English Edition，2009，10（6）：40-43，46.20BORNET B，ANTOINEE，BARDOUIL M，et al.ISSR as new markers for genetic characterization and evaluation of relationships among phytoplankton J.Journal of Applied Phycology，2004（16）：285-290.4512023年上海师范大学学报（自然科学版）J.Shanghai Normal Univ.（Nat.Sci.）21谢启鑫，缪南生，宋小民，等.蝴蝶兰种质资源遗传多样性的ISSR分析 J.西北植物学报，2010，30（7）：1331-1336.XIE Q X，MIAO N S，SONG X M，et al.Genetic diversity analysis of Phalaenopsis by ISSR markers J.Acta Botanica-Occidentalia Sinica，2010，30（7）：1331-1336.22HAN X Y，WANG L S，SHU Q Y，et al.Molecular characterization of tree Peony germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers J.Biochemical Genetics，2008，46（3）：162-179.23索志立，张会金，张治明，等.紫斑牡丹与牡丹种间杂交后代的DNA分子证据 J.云南植物研究，2005，27（1）：42-48.SUO Z L，ZHANG H J，ZHANG Z M，et al.DNA molecular evidences of the hybrids between Paeonia rockii and P.suffruticosa based on ISSR markers J.Acta Botanica Yunnanica，2005，27（1）：42-48.24周俐宏，张金柱，李振，等.利用ISSR揭示不同类型月季遗传多样性 J.基因组学与应用生物学，2009，28（2）：311-315.ZHOU L H，ZHANG J Z，LI Z，et al.Genetic diversity of different roses revealed by ISSR J.Genomics and Applied Biology，2009，28（2）：311-315.25杨帆，曾丽，叶康，等.17份蔷薇属植物的亲缘关系的形态学和ISSR分析 J.植物研究，2011，31（2）：193-198.YANG F，ZENG L，YE K，et al.Relationship of 17 Rosa plants detected by morphology and ISSR analysis J.Bulletin of Botanical Research，2011，31（2）：193-198.26MA N，CAI L，LU W J，et al.Exogenous ethylene influences flower