化学发光法的原理技术要点及评价应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,化学发光免疫技术,第一节 发光与化学发光剂,第二节 发光酶免疫测定（C,LEIA）,（chemiluminescence enzyme immunoasssay,）,第三节,化学发光免疫测定技术,(CLIA),（chemiluminescence immunoassay）,第四章 电化学发光免疫测定技术(,ECLI),(electrochemiluminescence immunoassay),1,化学发光免疫技术：,集灵敏的化学,发光分析和特异的抗原抗体免疫测,定于一体的检测技术。,概 念,特点：,特异性高、敏感性高、分离简便、,快速、试剂无毒、安全稳定、,可自动化。,2,化学发光免疫技术的类型,按,发光,剂,不同分为,1.,发光酶免疫测定,（,C,LEIA,）,chemi,luminescence,enzymeimmunoasssay,2.,化学发光免疫测定技术,(,CLIA),chemiluminescence,immunoassay,3.,电化学发光免疫测定技术(,ECLI),electrochemiluminescence,immunoassay,按分离方法不同分,1.微粒子化学发光免疫测定,2.磁颗粒化学发光免疫测定,3,第一节 发光与化学发光剂,一、发光,一种物质由电子激发态回复到基态时，,释放出的能量表现为光的发射。,1.光照发光:,发光剂经短波长入射光照射后进入激,发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。,2.生物发光:,反应底物在荧光素酶的催化下利用,ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回,复到基态时多余的能量以光子形式放出。,3.化学发光:,在常温下由化学反应产生的光的发射。,化学发光是一个多步骤的过程。,4,荧光素酶,ATP；O,2,；Mg,2+,氧化萤火虫荧光素,萤火虫荧光素,生物发光,返回,光,+AMP+O,2,+CO,2,+,5,化学发光,机制：,某些化合物可以利用化学反应产生的能,量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子,激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基,态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。,二、化学发光剂,化学发光剂或发光底物：,在化学发光反应中参,与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量,的化合物。,发光剂分为,荧光素、生物发光剂、化学发光剂,6,能参与化学发光反应；,与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；,偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；,应不改变或极少改变被标记物的理化特性，,特别是免疫活性。,化学发光剂应符合以下几个条件,返回,7,1.酶促反应的发光底物,是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。,CLEIA,中常用的酶有,HRP,和,AP,HRP,的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸,AP,的发光底物有,AMPPD、4-MUP（,荧光底物）,特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物,1.1 鲁米诺,H,2,O,2,/OH,HRP,+N,2,+H,2,O,+,光,8,对-羟基苯乙酸（HPA）,HPA,在,H,2,O,2,存在下被,HRP,氧化成氧化二聚体（荧光,物质），在350,nm,激发光作用下，发出450,nm,波长,的荧光，可用荧光光度计测量。,1.2 HPA,H,2,O,2,HRP,+,荧,光,氧化二聚体,9,AMPPD,AMPPD,在碱性条件下，被,AP,酶解生成相当稳定的,AMP-D,阴离子，其有230,min,的分解半衰期，发,出波长为470,nm,的持续性光，在15,min,时其强度,达到高峰，1560,min,内光强度保持相对稳定。,光,AP,/OH,HPO,4,2,1.3 AMPPD,10,4-MUP,4-,MUP,被,AP,催化生成4-甲基伞形酮，在360,nm,的,激发光的作用下，发出448,nm,的荧光，可用荧,光光度计进行测量。,荧光,AP,1.4 4-MUP,4-MU,360nm,激发光,H,3,PO,4,+,11,2.直接化学发光剂,特点：,不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件,就能发光的物质。反应迅速、背景低、,信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。,常用试剂：,吖啶酯（,acridinium,，AE）,+CO,2,+光,12,3.电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出,光的物质。,特点：,反应在电极进行；,电子供体为：三丙胺（,TPA）,化学发光剂：三联毗啶钌,返回,三联毗啶钌,分子结构图,13,第二节 发光酶免疫测定,（CLEIA）,一、原理,属于酶免疫测定的一种。只是最后一,步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应,发出的光在特定的仪器上进行测定。,二、技术类型,根据酶促反应底物不同可分为：,1.荧光酶免疫测定技术,2.化学发光酶免疫测定技术,根据免疫学反应模式分,1.双抗体夹心法和双抗原夹心法,3.固相抗原竞争法：,14,荧光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤,弃上清,是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有,强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。,15,化学发光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤,弃上清,是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，,通过光强度的测定而直接进行定量。,16,电化学发光原理图,这一过程可在电极表面周而复始地进行,产生许多光子，使光信号增强,返回,激发态,不稳定,基态,电极,17,1.抗原抗体结合反应,将已包被了抗体的乳胶微,粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间,后,再加入AP标记抗体，温育,形成固相包被抗,体-抗原-酶标抗体复合物,技术要点,2.分离技术,将复合物转移到玻璃纤维上，用缓,冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗,原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。,3.酶促发光反应,加入4-MUP，酶标抗体上AP将,4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激发光的照,射下，发出448nm的荧光，经荧光仪记录，放大，,根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量,18,1.磁颗粒分离法：,用抗原或抗体包被磁颗粒,与标,本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过,一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合,酶标记物,IC,和游离酶标记物进行分离的技术。,分离技术,2.微粒子捕获法：,所用颗粒是无磁性微粒子作为,抗体或抗原的包被载体,然后用纤维膜柱子进,行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。,3.包被珠分离法：,用聚苯乙稀等材料制成小珠,在,小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将,结合状态和游离状态的酶标记物进行分离.,19,第三节 化学发光免疫测定技术,（CLIA）,一、原理,用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与,待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反,应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离,状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入,发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的,检测进行定量或定性检测。,二、技术类型,1.分离方法 常用磁颗粒分离技术,2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术,3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶,20,1.抗原抗体结合反应,将包被McAb的磁颗粒和待,测标本加入到反应管中，标本中待测,Ag,与磁珠,上,Ab,结合，再加上AE标记,Ab,，经过温育，形成,磁珠,Ab,-,Ag,-AE标记,Ab,复合物。,技术要点,2.分离技术,在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快,地将未结合的多余Ag和标记Ab洗去。,3.化学发光反应,经洗涤的磁,珠,中，加入H,2,O,2,和,pH纠正液NaOH，这时AE不需要催化剂即分解并,发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记,录1,S,内所产生的光子能，其积分与被测物含量,成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。,21,1.AE其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催,化剂。,方法评价,2.AE与大分子的结合并无减少所产生的光量，,从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml。,3.AE标记试剂有效期长，可达一年。,4.固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被,面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更,简易、快捷。,22,第四节 电化学发光免疫测定技术,（ECLI）,一、原理,是一种在电极表面由电化学引发的特,异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化,学发光二个过程。ECL是电启动发光反应，而CL,是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光,剂三联吡啶钌Ru(bpy)3,2+,标记Ab，通过Ag-Ab,反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极,上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。,二、技术类型,1.分离方法 常用磁颗粒分离技术,2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术,3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶,23,1.三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本,同时加入一个反应杯中孵育反应,技术要点,2.将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次,孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合，,将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。,3.蠕动泵将形成的,Ru(bpy),3,2+,-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠,复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁,吸附于电极表面。同时，游离的,Ab,也被吸出测量室。,4.蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。,该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，,光电倍增管检测光强度，其与Ru(bpy)3,2+,的浓度呈,线性关系,故可测出待测Ag的含量。,24,原理图,返回,抗体包被 样本 Ru(byp),2+,TPA缓冲,的磁珠 抗原 标记抗体 液洗涤,3,25,方法评价,标记物的再循环利用，使发光时间更长、强,度更高、易于测定；,敏感度高，可达pgml或pmol水平；,线性范围宽10,4,；,反应时间短，20min以内可完成测定；,试剂稳定性好，25可保持一年以上。,26,五、临床应用,1.甲状腺激素 2.生殖激素,3.肾上腺/垂体激素 4.贫血因子,5.肿瘤标记物 6.感染性疾病,7.糖尿病 8.心血管系统,9.病毒标记物 10.骨代谢,11.过敏性疾病 12.治疗药物监测,返回,27,