肝微粒体细胞色素CYP450研究进展.pdf

16 2023.8试验研究0 引言肝脏是机体进行药物代谢和生物转化的主要场所。肝微粒体含有多种药物代谢酶系，主要包括以肝微粒体细胞色素CYP450（Cytochrome pigment 450，CYP 450）为代表的相代谢酶系及以葡萄糖醛酸转移酶（Glucuronyl transferase）等为代表的相代谢酶系。肝微粒体CYP450是一类主要负责内、外源性物质代谢的超家族酶系统1-2，目前已知90%以上的药物在体内代谢时，都要依赖肝微粒体CYP450催化完成3-5。目前可查阅到的有关CYP450的相关研究实验对象主要为人类和实验动物（大鼠、小鼠），有关食品动物CYP450的研究实验对象为家畜和家禽，有关鱼类肝微粒体CYP450研究较少，但随着大规模地对海洋进行开发利用，水生生物的生存环境日渐受到环境污染物的影响甚至危害，水生生物的CYP450研究也越来越受到人们的关注。本文就肝微粒体细胞色素CYP450的研究现状作简要的综述。1 肝微粒体的制备药物在肝微粒体CYP450作用下发生代谢转化、发收稿日期：2023-06-07基金项目：山东省鱼类产业技术体系（SDAIT-12-08）；山东省藻类产业技术体系加工与质量控制岗（SDAIT-26-05）作者简介：李佳蔚（1984-），女，硕士，中级工程师，研究方向：食品安全检测。*通信作者简介：刘慧慧（1980-），女，硕士，研究员，研究方向：水产品质量与安全。李佳蔚，曹伟，黄会，等肝微粒体细胞色素CYP450研究进展J现代畜牧科技，2023，99（8）：16-22doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.004LI Jiawei，CAO Wei，HUANG Hui，et alResearch Progress of Liver Microsomes Cytochrome CYP450JModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：16-22肝微粒体细胞色素CYP450研究进展李佳蔚1，2，曹伟1，黄会1，2，韩典峰1，2，姜芳1，薛敬林1，刘慧慧1，2*（1.山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室，山东 烟台 264006；2.烟台市海珍品质量安全控制与精深加工重点实验室，山东 烟台 264006）摘要：肝微粒体CYP450是一类主要负责内、外源性物质代谢的超家族酶系统，药物在肝微粒体CYP450作用下发生代谢转化、发挥药理学作用的同时，也会诱导或抑制CYP450的活性。CYP450具有复杂的功能，广泛地参与物质的生物转化，并且随着生物学技术的发展其研究对象也越来越广泛，是目前药物代谢研究的热点和重点。该文从肝微粒体CYP450的制备、组成，以及鱼类、哺乳动物类、禽类及昆虫类，等多种生物的CYP450研究现状作简要的综述。关键词：肝微粒体；CYP450；酶的诱导或抑制；药物代谢中图分类号：R394文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.004Research Progress of Liver Microsomes Cytochrome CYP450LI Jiawei1，2，CAO Wei1，HUANG Hui1，2，HAN Dianfeng1，2，JIANG Fang1，XUE Jinglin1，LIU Huihui1，2*（1.Shandong Marine Resource and Environment Research Institute，Shandong Key Laboratory of Marine Ecological Restoration，Yantai Shandong 264006，China；2.Yantai Key Laboratory of Quality and Safety Control and Deep Processing of Marine Food，Yantai Shandong 264006，China）Abstract：Liver microsomes CYP450 is a superfamily enzyme system that is mainly responsible for the metabolism of endogenous and exogenous substancesDrugs can induce or inhibit the activity of CYP450 while undergoing metabolic transformation and pharmacological effects under the action of liver microsomes CYP450CYP450 has complex functions and is widely involved in the biological transformation of substancesWith the development of biological technology，its research objects are becoming more and more widespread，and it is currently the focus and focus of drug metabolism researchThis article briefly reviews the preparation and composition of liver microsomes CYP450，as well as the current research status of CYP450 in various organisms such as fish，mammals，birds，and insectsKeywords：liver microsomes，CYP450，induction or inhibition of enzymes，drug metabolism172023.8试验研究挥药理学作用的同时，也会诱导或抑制CYP450的活性，引起药物半衰期延长、药效降低、残留增加、甚至严重的药物毒性6-8。为研究肝微粒体CYP450酶与药物的代谢关系，需要建立肝微粒体CYP450酶的体外活性定量分析方法9。目前，多将具有CYP酶活性的肝微粒体用于药物相互作用的体外试验10-11，以能够更直观的观察CYP酶对底物的代谢，研究来源主要集中于人、哺乳动物及禽类。自1945年第1次通过电镜研究内质网12，人们对肝微粒体溶液的研究一直在不断深化，但是在分离纯化方面一直没有一个很有优势的方案。目前，关于肝微粒体的提取、制备方法，学者们进行各种研究，常见的有超速离心、钙沉淀和差速离心等方法13。1.1 超速离心法超速离心法是指使用超速离心机进行分离的方法。张沂等14采用超速离心法制备，将肝匀浆于4，离心20 min，得到上清液后于4 离心60 min获得大鼠肝微粒体。杨海峰等15应用超速离心法，先将肝剪碎后按质量体积比加入Tris HCl缓冲液，后制备匀浆液于4 先后 2次离心获得红色沉淀及肝细胞微粒体组分。高翔等16用超速离心法分离得到人肝微粒体。这种方法制备肝微粒体操作简单，无需其他试剂辅助，但需要昂贵的超速离心机，且相对费时，对仪器设备要求比较高。1.2 钙沉淀法钙沉淀法是利用沉淀反应进行分离的一种方法。Cinti D L等17用钙沉淀法从大鼠肝脏中提取得到鼠肝微粒体。向云亚18用钙沉淀法，先将肝匀浆于0 离心 20 min，取上清液加入CaCl2溶液，再于0 离心20 min，弃去上清液，即得到大鼠肝微粒体。田世杰等19采用钙沉淀法制备获得猪肝微粒体。钙沉淀法是采用试剂辅助分离的方法20，利用钙离子沉降作用，在离心前加入CaCl2使微粒体沉降。该方法具备一定可行性，相对省时，易于普及，但在肝微粒体制备过程中可能引入钙离子。1.3 差速离心法差速离心法原理是是逐步提高离心速度以分离得到不同大小的目标物。李晶21采取差速离心方法，先将肝匀浆于4，9 000 r/min离心20 min，再于4，15 000 r/min离心45 min，弃去上清液，即得到大鼠肝微粒体。贺晓佩22用差速离心方法，制备得到了人肝微粒体。该方法在微粒体制备过程中多增加1次离心，起到了一定的纯化作用，并且在第2次离心时提高离心机的转速，更能使溶酶体、线粒体充分沉淀下来，同时小颗粒物质仍然保留在匀浆组织，提高了蛋白质的含量。提取肝微粒体效果好坏的主要差别是冲洗液和缓冲液2个方面，其中很大一部分因素是缓冲液。沈钧等23研究发现，在冲洗、匀浆过程中，与Tris-HCl缓冲液和蔗糖缓冲液相比，使用磷酸缓冲液更符合动物生理状态，更能保护CYP450的活性。近年关于肝微粒体的制备方法，很多学者在优化制备过程中从冲洗液、匀浆程度、离心速度、离心时间、缓冲液等几个方面着手，对操作流程进行优化，使肝微粒体CYP450酶在使用前得以保存。不同的肝微粒体的提取、制备方法各有优劣，见表1。表1 不同的肝微粒体制备方法的比较制备方法原理优点不足超速离心法通过离心机的超高速运转，使离心加速度达到重力加速度的万倍以上，以加速肝匀浆液中肝微粒体沉淀1.操作简单2.无需其他试剂辅助1.对仪器设备的要求较高，需要昂贵的超速离心机2.离心相对费时3.可行性受到限制钙沉淀法上清液去线粒体后加入钙离子，内质网部分发生聚集，在低速离心下使肝微粒体沉淀1.对设备要求不高2.相对省时，易于普及1.在制备过程中有可能引入钙离子2.钙离子会影响酶活以及造成核糖体的丢失差速离心法利用颗粒大小、密度的差异性使其在差速离心场中沉降1.操作简单2.方法较为经典3.易于普及1.细胞色素P450易失活2.受外界因素影响较大3.含量测定时不宜测准2 肝微粒体CYP450的组分及其研究进展2.1 肝微粒体CYP450的组分肝微粒体CYP450也称混合功能氧化酶（OFM）系统，组成部分为原卟啉IX和底物特异的脱辅基蛋白，血红素通过碳末端的半胱氨酸结合。CYP450包括细胞色素P450和细胞色素b5、还原性辅酶（NADPH）-细胞色素P450还原酶和还原性辅酶（NADH）-细胞色素b5还原酶以及磷脂等24-26。CYP450在生物体中具有重要的生理功能，参与环境污染物以及某些生理功能的内源性底物的代谢过程。经过代谢作用后，部分代谢物可更易被生物体排泄出体内，或与水溶性物质结合后排出，或转变成细胞毒性、致癌性更强的化合物27。Guengerich F P等28在大鼠的肝微粒体中发现的细胞色素P450酶参与了体内大量代谢过程。2.2 肝微粒体CYP450的研究CYP450酶系是由多种同功酶组成29，也是最重要的一类肝脏代谢酶，当细胞色素酶受外源物影响而产生氧化应激反应时酶活性改变，导致药效变化，甚至药物自身的代谢特征也受到影响30。因此肝微粒体CYP450酶的诱导或抑制效应被广泛关注。CYP450酶诱导的发生是在一种药物刺激一种或不18 2023.8试验研究同种酶情况下，而使联合使用的药物生物转化发生诱导。酶的诱导使相应底物的生物转化率提高，从而发挥减毒或增毒的作用。另外，在2种以上药物竞争同种CYP450酶时就会发生竞争性抑制作用，其主要原因是药物的浓度因素和其他特异性因素。2.2.1 鱼类肝微粒体CYP450的研究概况（1）鱼类肝微粒体CYP450的研究。目前国内外有关CYP450的研究对象主要为人类和实验动物，有关食品动物CYP450的研究对象主要为哺乳动物或家禽，对鱼类肝微粒体CYP450研究比较少31。最初Brodie B B等32研究认为，鱼类中缺乏细胞色素P450氧化酶，这可能与水生动物的生活环境，和鱼类的独特排泄方式有关。但在1960年代末期，有研究发现鳟鱼和其他一些鱼类的肝微粒体中存在着催化各种外源性物质进行氧化反应的P450单氧酶系33-35。Goksoyr A等36和Stegeman J J等37研究表明鱼类细胞色素P450加单氧酶是一组主要存在肝和肾脏组织中的异构酶系，在生物体的解毒过程中具有重要作用。（2）鱼类CYP450的生物学功能。Porter T D38、Sasame H A39等研究鱼类肝微粒体的氧化酶系，发现可催化苯胺的羟化反应和氨基比林的N-脱甲基反应。1972年James W H40等研究发现鲶鱼肝微粒体P450混合功能酶能够催化二嗪农（有机磷杀虫剂）代谢。1975年Ahokas T J41等对鳟鱼肝微粒体混合功能氧化酶的研究发现其对3，4-苯并芘的羟化作用甚至比雄性大鼠的能力还强。Nelson D R42等鉴定20多种鱼的CYP450基因，以及发现细胞色素P450加单氧酶系在外源污染物解毒和维持机体种族稳定性，等方面发挥重要作用。（3）鱼类CYP450作为生物标志物评价环境污染的研究。近年海洋环境污染日趋严重，为更加深入了解环境污染问题，加强保护生态环境的意识，有关环境污染的各种药品，包括农药、兽药，等被越来越多的学者所研究43。鱼类作为海洋生态系统中分布最广泛的生物群体之一，海洋污染也制约渔业的发展。有关鱼类在海洋污染压迫下的研究中，鱼类的CYP450主要被作为指示工农业污水对水环境污染的生物标志物，其生物催化能力和酶活性调节适应能力已成为水生毒理学研究的重要研究内容。CYP1A1是一种单加氧酶，催化多种有机异生物质发生生物转化的第相反应，刘宛等44研究发现CYP4501A1与环境污染物浓度存在较明显的剂量效应关系。Collier T K等45的实验结果表明，卤代化合物如PAHs、PCBs和环境污染物混合体都可诱导鱼肝微粒体CYP4501A1发生生理指标变化。挪威把鲶鱼CYP4501A1作为监测海域中石油类化合物、卤代化合物和农药，等污染物的指标物46。朱必凤等47研究表明鲫鱼肝微粒体芳烃羟化酶对2,6-二甲基萘有很大的亲和力，其活力的大小可作为指示多环芳烃对淡水污染的指标。由此可见，细胞色素P450作为环境污染物的一种生物标志物适用性较高 48。环境污染物进入生物体内后发生生物转化，其中亲脂性化合物被CYP450氧化代谢后形成的中间代谢物具有很高的生物活性，易对生物体产生毒性。7-乙氧基异吩恶唑-O-脱乙基酶（EROD）是该酶系中的一种。Grosvik B E等49发现鳗鲡中EROD活性与BaP、PCB污染水平有很强的相关性。Flammarion P等50通过测定白鲑（ceuciscus cepHalus）肝中EROD活性发现上下游鱼类EROD酶活性相差很大，可作为评价河流水质的生物标志物。郑榕辉等51研究结果表明，对于石油污染物，黑鲷、黄鳍鲷和褐菖鲉肝EROD活性都可以作为污染生化效应监测指标，褐菖鲉最敏感，更适合于作为石油类污染及其生化效应。Jnsson M52和Christine V等53研究证实了鱼类CYP450酶系中CYP1A表达水平和EROD活性可以作为PAHs、PCBs、二噁英类有机物质的分子标志物。（4）鱼类CYP450的药理学代谢研究。我国是鱼类食品的消费大国，渔药在鱼类疾病的控制上有着举足轻重的作用。渔药的发展与水产养殖、病害研究及药物科学的进展密切相关54。目前，国内对渔业用药的研究较少，缺乏对药物在生物体内代谢方面的系统研究，某些药物在实际应用中存在使用方法错误和药物残留超标等问题55。鱼类作为人类动物性食品的重要来源之一，残留药物可通过食物链的富集作用对人类健康构成威胁。因此研究鱼类CYP450的药理学代谢对于药物的环境生态风险评价具有重要意义。Ulrich M Z等56研究发现78%的肝细胞清除药物是通过CYP450酶系进行代谢转化。张莉57研究鱼类肝脏微粒体P450酶对有机磷杀虫剂的代谢作用，结果发现P450酶氧化有机磷生成的产物对探针胆碱酯酶（AChE）抑制率越大，P450酶活性就越高，其耐药性水平就越低。边文杰等58研究4种鱼类肝脏细胞色素P450对毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷的脱硫代谢作用，发现P450能阻碍鱼类产生耐药性。贾娴59研究恩诺沙星在异育银鲫肝微粒体的代谢情况，结果发现恩诺沙星对银鲫肝微粒体主要药酶具有较强的抑制作用。2.2.2 哺乳动物肝微粒体CYP450的研究目前，有关肝微粒体CYP450的研究多集中在哺乳动物（大鼠、小鼠、猪）上。学者们针对不同药物对大鼠肝微粒体CYP450酶的诱导效应方面做了研究。张希凤等60测定大鼠肝微粒体CYP450总量及研究192023.8试验研究P450亚型的特异催化反应，探究复方丹参片、阿斯匹林和潘生丁对大鼠肝微粒体CYP450及其亚型的影响。结果显示，3种药物能降低CYP450总量且能诱导与前致癌物活化有关的CYP1A1和CYP2E。鲍珍贝等61研究西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响，发现大鼠肝微粒体CYP1A2活性、mRNA和蛋白表达与西洋参总皂苷剂量有一定的正相关性，非那西丁的代谢速率加快。近年介于药物间相互作用而引起的不良反应越来越多。由于药物对肝微粒体CYP450的抑制作用，使酶的活性发生变化，药物自身的代谢特征也受到影响62。Thomas K H等63在研究10、100 g反式白藜芦醇对大鼠肝微粒体CYP3A4、CYP3A5活性影响，结果表明CYP3A4、CYP3A5活性被显著抑制且呈剂量效应。李雪等64研究反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷对大鼠肝微粒体CYP450的影响，发现其可抑制CYP450酶活性，并可改变肝药酶对某些药物的代谢作用。除药物、毒物及食物等多种外源性物质对肝药酶有诱导作用外，近年来，有学者发现糖皮质激素、性激素、维生素D3，等也是一些肝外药酶的诱导剂。Thummel K E等65研究发现1,25-二羟维生素D3及19-去甲-1,25-二羟维生素D2是肠道CYP3A4的诱导剂。莫启忠66用Western免疫印迹技术检测生长激素对大鼠肾脏微粒体细胞色素P4504A2的影响，发现其表现出种属、性别差异特异性。正常雄性大鼠肾微粒体细胞色素P4504A2含量大于雌性大鼠的含量。切除垂体的雄性和雌性大鼠肾微粒体细胞色素P4504A2含量明显高于对照组，而雌雄的差异不明显，研究结果说明生长激素对大鼠肾P4504A2有显著影响。2.2.3 禽类肝微粒体CYP450的研究有关禽类的CYP450研究报道较少，并且研究内容比较单一，一般多为外源性物质对禽类CYP450的诱导。唐洪鹏等67在研究中探讨了锰对公鸡肝脏细胞色素P450酶系的影响，分别在饲料中添加不同剂量的MnCl2建立亚慢性锰中毒模型，检测肝微粒体细胞色素P450酶系活性，结果显示NADPH-细胞色素C还原酶和红霉素-N-脱甲基酶的活性变化规律不明显，锰中毒可影响鸡肝微粒体细胞色素P450酶系活性。范桂兰等68研究了呋吗唑酮对小鸡肝微粒体蛋白的影响，结果发现呋吗唑酮对肝微粒体蛋白含量影响不大，但对苯丙胺羟化酶活性和细胞色素P450含量有较明显的影响，且与药物浓度呈正相关。杨海峰等69先通过连续对实验组公鸡腹腔注射80 mg/kg苯巴比妥和空白组公鸡腹腔注射4 mL/kg生理盐水，然后进行体外肝微粒体酶活性测定，结果显示实验组肝微粒体蛋白含量和细胞色素P450含量、氨基比林-N-脱甲基酶、红霉素-N-脱甲基酶和苯胺羟化酶的活性均显著升高，表明苯巴比妥能显著诱导鸡肝微粒体CYP450活性变化。2.2.4 昆虫类肝微粒体CYP450的研究细胞色素P450酶系在昆虫生长发育中具有重要的意义。艾国民等70研究发现，P450能够参与昆虫体内多种外源性物质和内源性物质的代谢，其含量的升高和活性的增强能帮助害虫产生抗药性。郭艳琼等71研究有机磷杀虫剂毒死蜱对飞蝗体内细胞色素P450的影响，结果显示某些细胞色素P450基因受毒死蜱的抑制作用而表达水平下降，导致飞蝗整体细胞色素P450酶活性降低。另外，有研究发现在某些P450被诱导时，其它P450酶活性有可能被抑制72。Yu S J等73发现草地粘虫幼虫在摄入含有0.025%黄原毒素的人工食物时，总P450含量升高了1.6倍，并测定4种P450酶活性，其中七氯环氧化活性增强，其余减弱。综上所述，肝微粒体CYP450是目前药物代谢研究的热点和重点，它具有复杂的功能，广泛地参与物质的生物转化，并且随着生物学技术的发展其研究对象也越来越广泛，目前报道的有关肝微粒体CYP450的研究，见表2。表2 不同生物的肝微粒体CYP450的研究研究对象研究内容对CYP450的影响参考文献鱼类PAHs、PCBs及其他卤代化合物和原油等诱导48恩诺沙星抑制59有机磷杀虫剂诱导57哺乳动物类复方丹参片、阿斯匹林和潘生丁诱导60西洋参总皂苷诱导61反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷抑制63-64禽类锰锰中毒影响其活性67苯巴比妥诱导69昆虫类有机磷杀虫剂毒死蜱抑制7120 2023.8试验研究3 结束语肝微粒体CYP450是重要的药物代谢酶系统，大多数药物的相反应和相反应都依靠肝脏酶系统产生作用。肝微粒体CYP450种类繁多、分布广泛、影响因素多，研究起来较为复杂，但对于体外代谢有着重要的意义。通过研究药物对肝微粒体CYP450的调控作用，有助于揭示药物之间并用的相互作用，阐明药物作用机制及毒副作用发生机制，指导临床合理用药，避免药物相互作用的发生，提高药物使用安全性和时效性。目前，关于肝微粒体CYP450诱导/抑制参与的代谢研究已有相当多的研究，但研究内容过于单一的状况不可避免，能应用到实际生产的研究也较少。随着传统医药学与系统生物学和现代生物医学发展的交叉渗透，药物对CYP450调控、体外代谢清除及药物间相互作用的研究也会不断深入和完善。日后的研究中，在应用体外肝代谢方法时可针对药物代谢特性，如代谢速率过快或中间代谢物的毒性，进行结构改造，进行药物的开发利用以及临床合理用药，将具有较高的研究价值及广阔的应用前景。参考文献1Gonzalez F JRole of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress：studies with CYP2E1JMutation 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