冷藏期内猪肉肌苷酸与生物胺的变化规律及其相关分析.doc

冷藏期内猪肉肌苷酸与生物胺的变化规律及其相关分析
姚振乐，刘国庆收稿日期：
基金项目：安徽省重大科技攻关项目（08010301079）
作者简介：姚振乐（1984-），男，硕士研究生，主要从事食品科学研究。
* 通讯作者：刘国庆（1963-），男，副教授，主要从事肉类科学研究。Email: liugq_168@
，谢科，高潮，朱明
（合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

摘要：采用高效液相色谱法测定生鲜猪肉的背最长肌在4℃温度条件下肌苷酸(IMP)和腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺这六种生物胺含量的变化规律，从而进一步分析它们之间的相关性。结果表明，随着货架期的延长，IMP含量呈先上升后降低的趋势，并在第二天达到最高；精胺含量基本维持在4.0mg/kg左右，组胺的含量一直很低，其它的胺类物质都有所增加，以尸胺的变化最为明显，虽然腐胺和亚精胺的含量比较低，但是仍然有明显的变化，酪胺则变化也非常明显；从person积差相关系数可以看出，IMP与其他指标相关系数呈负相关显著，有的指标是不显著的；在0.01水平上，IMP与亚精胺之间的负相关性最强，达到了-0.981，其次是尸胺与IMP之间，相关系数是-0.960，显著负相关，酪胺也与IMP显著负相关；IMP与腐胺、组胺、精胺的相关系数都不显著。因此，通过测定IMP含量变化可以预测猪肉新鲜度，且可作为猪肉保藏与加工过程中品质控制的重要指标之一。
关键词：猪肉；IMP；生物胺；相关性；

Changes and the relationship of inosine -5’- monophosphate and biogenic amine of chilled pork during storage
Zhenle Yao,Guoqing Liu﹡,Ke Xie,Chao Gao,Ming Zhu
(School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:Changes of inosine- 5’-monophosphate(IMP), putrescine, cadaverine, histamine, tyramine, spermidine and Spermine contents in longissimus dorsi at 4℃ were analyzed by HPLC,and the relationship was further discussed.The result showed that storage time influenced concentration of IMP ,concentration of IMP increased until reaching top on the next day,then decreased gradually;The content of Spermine basically maintaine about 4.0mg/kg.The content of histamine keepped low during storage.The others all increased,especially cadaverine. Although the contents of putrescine and spermidine were low,but the changes were significant,so tyramine was.From the person correlation coefficient,IMP had remarkable negative relationship with spermidine, cadaverine and the correlation coefficient were respectively -0.981 and -0.960,which was the highest between spermidine and IMP on the level of 0.01.IMP also had remarkable negative relationship with tyramine except for putrescine, histamine and Spermine.Therefore，the fresh degree of pork could be forecasted by determining the change of IMP.And it was one of the major quality variables during storage and process.
Keywords:pork,IMP, biogenic amine, relationship

食品的腐败品质和风味特性已经成为人们选择食品的重要指标，其中腐败品质指标中的生物胺类物质是衡量其腐败程度的重要指标，而风味物质中的肌苷酸在肉类食品中含量丰富，不仅具有显著的增鲜作用，而且对于肉类食品的各种滋味具有一定的增减作用[1]。近些年来，国内外对不同动物肉品IMP的含量及变化进行过一些研究[2]，陈继兰等[3](2004)，王玉等[4]（2008）研究了不同贮藏条件下鸡肉IMP生成与降解规律，同时，陈继兰等[5]从遗传育种方面对其进行了大量的研究。王述柏等[6](2004)对影响IMP生成降解的各因素进行了系统的研究。徐昶，周光宏等[7]（2010）采用反相高效液相色谱法测定三黄母鸡胸肉在不同温度条件下僵直过程中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷以及IMP含量的变化。但对于其结合腐败品质指标中的生物胺类物质与肉品中IMP含量的相关性的研究甚少，作为肉品质中重要指标的IMP在各个品种的变化规律及与其它肉品质、生化指标的相关性却未进行过系统性研究，本实验通过测定IMP和腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺这六种生物胺含量随着货架期延长的变化规律，分析并初步探讨了它们之间的相关性，这不仅仅为建立肉的品质腐败预测模型提供理论依据，而且对于研究遗传育种和饲养管理方面改善IMP的沉积，从而改善肉的品质具有深远的影响。

1． 材料与方法
1.1主要材料与试剂
从安徽省春然食品有限公司屠宰基地（合肥）无菌操作取常规屠宰后内部无污染的背最长肌。无菌薄膜包装后置于0-4℃冷却24h。
试剂标准品:酪胺(tyramine，Tyr)、组胺(histamine，His)、腐胺(putrescine，Put)、尸胺(cadaverine，Cad)、亚精胺(spermidine，Spd)、精胺(Spermine，Spe)， 肌苷酸Na盐标准品(IMP，纯度98% ~100%) Sigma公司；
衍生剂 :丹磺酰氯(Dansyl chloride)，Sigma公司；乙睛和氨水为色谱纯，高氯酸(PCA)(优级纯，含量70% ~72%)，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等其余试剂均为分析纯；0.45μm过滤器购自Millipore公司，超纯水(电阻率≥18.2)。

1.2主要仪器与设备
Agilent1100 高效液相色谱仪(配ZORBAX SB-C18 色谱柱(5μm，4.6mm *250mm)、G1313A 100μl自动进样器、G1311A 四元泵、G1314A VWD 检测器和二极管阵列检测器（DAD）) 美国Agilent公司；CR22G 高速冷冻离心机 日本日立；台湾艾柯原子Ⅱ型超纯水器 台湾艾柯成都康林有限公司；PP-50E酸度计 德国Sartorius公司；BS200S-WE千分之一天平 德国Sartorius；BS21S 十万分之一天平 德国Sartorius 公司；真空泵 IDEX公司

1.3 样品前处理
1.3.1 IMP测定的样品前处理
将背最长肌样品修整、绞碎、混匀后，准确称取5 g，置于30ml离心管中；加入25ml 预冷的6%PCA 溶液[8]，超声波细胞破碎机冰浴中超声破碎，破碎后于冷冻离心机中以8000rpm离心15min，用中速定量滤纸滤移取上清液；沉淀物加15ml预冷的6%PCA溶液振荡后以8000rpm 离心10min，移取上清液；合并两次上清液，加少量超纯水，再以5、1和0.1mol/L 的NaOH 溶液调pH6.50，用超纯水定容至100ml，摇匀；样液经0.45μm 纤维素滤膜过滤后[9]，取清液进样至高效液相色谱仪进行测定。
1.3.2 生物胺测定的样品前处理
同上取5g样品加入20ml的0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)，匀浆机上彻底匀浆，冷冻离心机10℃以2500rpm离心10min，沉淀部分如前的方法再重新提取。取两次的上清液用0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)稀释到50ml。取1ml的样液如标准溶液一样进行柱前衍生（如下）。

1.4 色谱条件
1.4.1 IMP测定的色谱条件
参照Ryder J M.等[10]的方法并加以改进，ZORBAX SB-C18 色谱柱（5μm，4.6mm *250mm）；流动相为0.04mol/L的磷酸二氢钾和0.06mol/L的磷酸氢二钾溶液，流动相使用前通过0.45μm的合成纤维素膜真空抽滤并超声脱气；柱温30℃；流速为2.0ml/min；检测波长为254 nm；进样量为50μl。
1.4.2 生物胺测定的色谱条件
参照Vinci等[11]和Alberto等[12]的方法，并进行了适当的修改。ZORBAX SB-C18 色谱柱（5μm，4.6mm *250mm）；柱温30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254.8nm；进样量为20μl。流动相为水（A溶液)和乙腈acetonitrile(B溶液)，按下(表1)的梯度运行。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
时间（min）
B(%)
0.0
65.0
5.0
70.0
15.0
100.0
16.0
100.0
16.1
65.0
20.0
65.0
1.5 标准溶液配制及其柱前衍生
准确称取IMP标样5mg，超纯水定容至50 ml。用超纯水逐级稀释为20、40、60、80、100 μg／ml的不同质量浓度的IMP标准溶液。在上述色谱条件下进样50μl，以各组分质量浓度对峰面积作回归处理。再准确称取腐胺、酪胺、尸胺、组胺、精胺、亚精胺各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50ml，并分别稀释制成终浓度分别为:1.0、5.0、20、50、150μg/ml的混合标准溶液。取1ml的标准品混合溶液，加入200ul 2N NaOH使之呈碱性，再加入300μl的饱和的NaHCO3溶液进行缓冲，然后再加入2ml丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(10mg/ml溶于丙酮)，丹磺酰氯溶液在室温下处于黑暗中反应处理。30min后加入100μl的NH4OH中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。加入乙腈使终体积为5ml。衍生处理后用0.45μm滤膜过滤，待分析检测。检测结果以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标曲线。

1.6 数据处理
以自然腐败的冷鲜猪肉在4℃贮藏时的品质指标及其IMP指标为研究对象，采用SPSS中的Person系数来反映各指标之间的相关性及其相关程度。

2 结果与分析
2.1 标准品色谱图

图1 IMP标准品的色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of IMP standard solutions
图1是肌苷酸标准品的色谱图。由图1可知，肌苷酸的出峰时间为4.168min，有一些溶剂峰、杂质峰在3min前出完，不会对后面样品的测定造成影响，且峰形对称，没有基线漂移和拖尾等现象。

图2 六种生物胺标准品的色谱图
Fig2 HPLC chromatograms of biogenic amine standard solutions
图2是六种生物胺标准品的色谱图。由图2可知，腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺出峰时间分别为5.853、6.566、7.185、10.503、11.518、14.984min，无溶剂峰、杂质峰，各个组分能有效分离，峰形对称，无基线漂移和拖尾等现象，得到了理想的分离效果。
2.2 标准曲线

图3 IMP的标准曲线
Fig3 Standard curve of IMP content
图3结果表明IMP峰面积与其相应浓度分别呈良好的线性关系，它的相关系数为0.9993，大于0.99，则说明IMP在20～100μg／ml范围内线性良好，可以满足定量分析的需要。

图4 六种生物胺的标准曲线
Fig4 Standard curve of six biogenic amines content
从图4生物胺的标准曲线可以看出，六种生物胺的峰面积与其相应浓度分别呈良好的线性关系，其生物胺的相关系数都大于0.99，说明生物胺浓度在1‐100μg／ml范围内具有线性的相关关系。
2.3 IMP和生物胺含量的变化

图5 冷鲜猪肉贮藏期下IMP含量的变化
Fig5 Changes of content of IMP in chilled pork during storage period
肌苷酸含量由图5可得，在第1天IMP含量逐渐上升，贮藏到第2天达到最高峰，随后开始逐渐下降，这是由于宰后肌肉达到最高pH值时，大部分ATP被分解，在ATP酶的作用下分解成ADP，ADP又在肌酸激酶的作用下，分解成AMP，AMP在腺苷酸脱氢酶的作用下进一步形成IMP，IMP含量逐渐上升，当IMP前体物充分降解成IMP后，部分IMP在磷酸单酯酶的作用下形成肌苷(HxR)，并在最后的代谢过程中在核苷水解酶的作用下分解成次黄嘌呤(Hx)和核糖，IMP含量则逐渐下降[13]。

图6 冷鲜猪肉贮藏期下生物胺含量的变化
Fig6 Changes of content of biogenic amines in chilled pork during storage period
由图6可以看出，不同的生物胺随时间的变化各不相同，精胺始终保持在4.0mg/kg左右，含量较高；组胺在整个贮藏期内的含量一直很低，而其它的胺类物质在第4天都有不同程度的增加，其中以尸胺的变化最为明显，尽管腐胺和亚精胺的含量比较低，但是仍然有明显的变化，酪胺则变化也非常明显。
通过感官的指标发现，在第3d时已经开始出现腐败现象，尸胺含量随着贮藏时间的延长而不断的增加，4d后略有下降;而腐胺的变化，4d前没有太大变化,之后却急剧增加，此时鲜肉已经开始出现腐败现象。由此也说明随着微生物的生长,肉品中的一些物质随着其变化发生了一些规律性的变化。

2.4 IMP含量变化与各生物胺含量变化的相关性分析
IMP含量与其他指标的相关性分析中，各变量之间都是动态的变化过程，不能控制某一变量不变。因此，选用person积差相关系数进行分析。
表2 冷鲜猪肉贮藏期下各品质指标的皮尔逊相关系数
Table 2 Pearson correlation coefficient of chilled pork during storage period

IMP
腐胺
尸胺
组胺
酪胺
亚精胺
精胺
IMP
1
-0.835
-.960 * *
0.779
-.895 *
-.981 * *
0.144
腐胺

1
.948 *
-.721
.975 * *
.803
-.616
尸胺

1
-.749
.962 * *
.950 *
-.348
组胺

1
-.730
-.686
.308
酪胺

1
.846
-.561
亚精胺

1
-.042
精胺

1
* * Correlation is significant at the 0.01 level
* Correlation is significant at the 0.05 level
由表2可以看出，person积差相关系数可以用来评价IMP和其他指标变化之间的相关程度。从IMP与其他指标的相关性来看，其相关系数呈负相关显著，有的指标是不显著的；在各指标中IMP与亚精胺之间的负相关性最强，达到了-0.981，其次是尸胺与IMP之间，相关系数是-0.960，并且可以看出IMP与尸胺、亚精胺在0.01水平上显著负相关，说明IMP的含量与尸胺、亚精胺的含量有反方向的影响，也就是IMP含量越多，则尸胺、亚精胺的含量越少，反之，亦然;虽然酪胺和亚精胺的含量不是很高，却同时与IMP显著负相关；从IMP与腐胺、组胺、精胺的相关性来看，其相关系数都不显著，而从这三种生物胺的含量来看，它们的含量是随着贮藏时间的延长而变化不显著，腐胺的含量基本上是在4d以后才开始急剧增加，对于产品的整个完全腐败的过程而言，它的变化与其它指标的变化不完全一致，然而对于产品在腐败临界点时候腐胺含量的急剧增加来看，它可以作为反映产品腐败的一个重要指标之一。[14]
可见，IMP含量变化与生物胺含量变化之间的相关性反映了对产品品质的控制，能有效的增加产品风味则具有重要的作用。

3 结论
（1）本试验通过高效液相色谱法测得肌苷酸含量在贮藏期里先上升，在第2天达到峰值，然后不断下降；精胺含量在4.0mg/kg左右，组胺的含量一直很低，其它的胺类物质都有所增加，以尸胺的变化最为明显，尽管腐胺和亚精胺的含量比较低，但是仍然有明显的变化，酪胺则变化也非常明显。
（2）选用person积差相关系数进行分析，结果可以得出，在0.01水平上，IMP与亚精胺之间的负相关性最强，达到了-0.981，其次是尸胺与IMP之间，相关系数是-0.960，显著负相关，酪胺也与IMP显著负相关；IMP与腐胺、组胺、精胺的相关系数都不显著。因此，通过测定IMP含量变化可以预测猪肉新鲜度，且可作为猪肉保藏与加工过程中品质控制的重要指标之一。

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