定向进化Rho1提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能.pdf

基金项目:国家自然科学基金计划项目()微生物代谢国家重点实验室开放课题项目()辽宁省教育厅科研项目()大连市青年科技之星项目()作者简介:谭慧萍 女硕士研究生 主要从事微生物细胞工厂构建:.通讯作者 王亮男讲师博士硕士生导师 主要从事微生物代谢研究:.李倩女副教授博士硕士生导师 主要从事微生物细胞工厂构建和微生物抗逆研究:.收稿日期:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能谭慧萍 王惠国 赵增彤 程杨好 刘晨光 王 亮 李 倩(.大连大学 生命健康学院辽宁 大连.大连工业大学 生物工程学院辽宁 大连.上海交通大学 生命科学与技术学院 微生物代谢国家重点实验室上海)摘 要 燃料乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制而导致发酵提前终止生产强度严重降低因此构建同时具有高耐受性、高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标 选取酿酒酵母细胞形态调节关键基因小 酶家族成员 构建易错 产物文库以酿酒酵母 为出发菌株采取“富集自然生长复筛”的筛选策略成功筛选得到两株乙醇胁迫耐受性与发酵性能均提高的突变株 和 测序发现突变株过表达的 序列出现了 个氨基酸的突变和大片段的缺失突变 以/起始葡萄糖进行乙醇发酵 时 和 的乙醇滴度比对照菌株分别提高了.和.超高浓度乙醇发酵能力显著提高 本研究为利用蛋白定向进化方法改良酵母菌复杂表型提供了新的作用靶点关键词 酿酒酵母乙醇胁迫 小 酶易错 超高浓度乙醇发酵中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.).微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 ./().()在“碳中和、碳达峰”战略目标背景下发展燃料乙醇这一可再生清洁能源是先进生物质能源转化利用的重要课题 其中超高浓度乙醇发酵(指采用超过(质量分数)的底物浓度得到的产物浓度超过(体积分数)具有更大的经济、环保优势 高终点乙醇浓度会极大降低乙醇精馏能耗和废槽液总量发酵过程还不易污染杂菌 在乙醇发酵菌株的选择上综合考虑乙醇转化效率、菌体回收利用和生物安全等方面酿酒酵母是最为优良的生产菌株 但在发酵过程中酵母菌受到温度、渗透压、纤维素原料降解产生的有毒副产物等环境胁迫因子的影响而且随着终产物乙醇浓度的提高乙醇逐渐成为主要的胁迫因素酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制甚至出现生长停滞和死亡的现象 从过程工程控制角度进行的工艺优化只能部分缓解这种胁迫不能完全弥补酵母菌本身性能下降引发的发酵效率的降低 因此揭示酵母细胞复杂的乙醇胁迫响应机制筛选或构建具有高耐受性高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标 组学的深入分析揭示应对乙醇胁迫细胞整体的转录/翻译水平发生了调整表达水平发生变化的基因数量依据不同乙醇作用方式可达上百甚至上千 乙醇耐受性的多基因、网络化的复杂调控模式意味着传统的单基因操作或单一代谢途径改造难以获得高乙醇耐受性的表型因此研究越来越偏向对细胞整体代谢网络的改造 其中易错 技术是一种简单高效的方法辅以合适的筛选策略可以快速筛选到目的菌株 等应用易错 的方法突变了 聚合酶 转录因子 ()中的 编码基因成功构建了乙醇生产率大幅提高的突变株(约)开创了全局转录调控策略()这一策略的运用还拓展到了多个物种、多种转录起始复合物元件(、因子等)以及环化腺苷酸受体蛋白()、等改造的性状包括乙醇/丁醇耐受性、渗透压耐受性、成膜性等 小 酶家族是酵母形态调节通路中重要的信号分子 以出芽为例 家族的 参与调控了出芽位点选择 家族众多小 酶参与肌动蛋白骨架的极化调控如 和在各个极化过程起核心作用的 家族的 调节从高尔基体向细胞膜的蛋白分泌等 小 酶的功能还涉及协调其他信号转导系统参与多种多样的生命活动如参与雷帕霉素靶 复合物()依赖的信号级联过程和 激酶途径这些信号途径都与细胞响应多种胁迫耐受性密切相关如细胞壁损伤修复、多效药物响应、离子胁迫响应、饥饿及耐热性、渗透压胁迫等 本研究选择 小 酶家族蛋白 作为易错 定向进化的靶点(图)它具有多个效应蛋白、调节了多条代谢途径并且有双元开关(结合 或)的活性调节方式在代谢重塑的过程中起到了关键的调节作用 随机发生的结构基因突变可能扰乱一组上/下游蛋白与小 酶的结合这些蛋白既可能是调节蛋白也可能是小 酶的效应物因而可以在细胞全局水平扰乱代谢网络筛选到含有目的表型的突变株 后续可以结合组学技术分析其重塑的代谢途径和关键基因靶点 材料与方法.材料.菌种和质粒本研究涉及的菌株和质粒如表 所示.培养基(/)培养基:酵母粉 胰蛋白胨 .培养 期 谭慧萍等:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能基:葡萄糖 蛋白胨 酵母粉 酵母高浓度()发酵培养基:葡萄糖 蛋白胨 酵母粉 酵母超高浓度()发酵培养基:葡萄糖 或 蛋白胨酵母粉 固体培养基添加(质量分数)的琼脂表 菌株和质粒 菌株和质粒描述材料来源菌株 、实验室保存.含 质粒本实验构建.含 质粒本实验构建.含 质粒本实验构建 .含 质粒本实验构建 感受态细胞购自 大连质粒 含 抗性基因美国 大学 博士惠赠 酵母表达载体实验室保存 被 取代本实验构建 质粒 插入 表达盒插入质粒 本实验构建 表达盒插入质粒 本实验构建.主要设备与仪器 仪(德国 公司)核酸电泳仪(北京市六一仪器厂)生化培养箱(上海一恒科技有限公司)电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)全温培养振荡器(上海精宏实验设备有限公司)垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)生物传感仪(山东省科学院生物研究所).方法.易错 体系构建 以 基因组为模板/为引物(表)进行常规 反应(产物为)或易错 反应(产物为)易错 使用 ()添加 至 /添 加浓度范围(/):、.、.、.、.、./各添加至 /各添加至 /反应条件:预变性、运行 其后进行变性、退火、延伸的 个循环()之后 延伸 保温 (质量分数)琼脂糖电泳检测 产物确定合适的 浓度.质粒构建以质粒 作为模板/为引物利用高保真 聚合酶()扩增 基因 纯化后的 产物末端加 连入 载体得到 利用 和 双酶切 载体和 连接酶连接胶回收片段得到载体 以酿酒酵母 为模板以/引物扩增酿酒酵母磷酸甘油酸激酶 基因启动子同上连入 载体得到载体 对 和 分别用 /进行双酶切利用 连接酶连接胶回收片段得到载体 上述载体送至华大基因科技有限公司测序验证序列是否正确插入 /双酶切 利用 试剂盒连接)片段构建载体 对照载体 连入 使用的引物序列 微 生 物 学 杂 志 卷如表 所示 利用 转化缓冲液(/、/、/、/)制备大肠埃希菌()超级感受态细胞热激法转化连接产物涂布含卡那霉素(/)的 平板以菌落 方法初步筛选阳性克隆并提取质粒进行 /双酶切验证表 引物序列 引物名称引物序列().酵母文库构建、筛选与鉴定 将混合了不同突变位点的 载体文库通过/化学转化法转入酿酒酵母 构建突变菌株文库对照组分别转入 质粒(菌株)和(菌株)转化后所有用到的 液体、固体培养基分别添加/和 /的 平板培养 后添加适量 液体培养基将菌落洗下至摇瓶补加 培养基、/培养 之后(体积比)比例转入含有 (体积分数下同)乙醇的 中震荡培养 /离心 收菌再于 乙醇的 溶液中培养 稀释涂布 平板(不含乙醇)挑取直径较大的菌落在 培养基中扩繁、/震荡培养 将上面扩繁的各突变株转接含乙醇的 培养基调至相等的起始 吸光度培养 后定期测定值比较各个突变株生长性状(组平行实验)同时配制含 乙醇的固体 平板将突变株和对照菌株的扩繁菌液梯度稀释()分别取 在平板点样培养 后观察 利用玻璃珠法提取酵母菌含有的游离质粒热激法转化.感受态细胞对提取的质粒进行 和 双酶切验证送至华大基因科技有限公司测序以获得 的突变位点信息与 数据库(.)序列比对并利用 对突变体的蛋白产物进行同源建模(:/./.).突变菌株发酵性能测定以(体积比)比例将过夜培养的酵母菌液转接至 或 发酵培养基(含 /)、/分别震荡培养是 或 定时取样测定 值 同时样品经 /离心 取上清液适当稀释利用 生物传感仪测定发酵液的葡萄糖和乙醇浓度 结果与分析.利用易错 方法定向进化.构建易错 产物文库 选择酿酒酵母 基因作为易错 的靶基因易错 产物质粒文库的构建过程如图 所示 和、一起构成 小 酶家族 与酵母细胞壁完整性密切相关受到细胞周期、细胞表面受体参与的信号转导系统调节可以激活一系列效应蛋白涉及的生物过程包括细胞壁重塑和肌动蛋白骨架发生(出芽、分裂等)、级联效应、囊泡转运蛋白复合体 定位、葡聚糖合酶复合体功能行使等直接影响细胞大小和形态具有多调节因子、多效应蛋白的特点是较为 理 想 的 用 来 实 现 代 谢 扰 动 的 中 心 靶 点(图)利用易错 体系的碱基错配、结合筛选手段可以实现蛋白序列的定向进化 改变 反应体系(如引入 、提高 浓度等)可以使 聚合酶在碱基插入时增加错配的频率并且保证非互补链稳定存在 碱基突变如果发生在氨基酸编码区就可能造成原来氨基酸的替换引发蛋白结构和功能的改变 一般 浓度、四种 的比例等都会直接影响到易错 的效率 浓度过高会导致过高的突变率而难以筛选到正突变甚至无法获得 产物 因此本研究首先在 体系中添加不同浓度的(、.、.、.、.、./)使用 聚合酶扩增结果如图 所示 超过./的 将无法获得正常的扩增产物因此 浓度最高选取了 期 谭慧萍等:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能 /图 为常规 体系扩增得到的 片段对比二者可以发现易错 的扩增相比常规 产物特异性降低获得的扩增产物分子量分布较宽且在低分子量区域()存在弥散条带 选取含./和./的 体系分别建立易错 产物质粒文库图 的调节蛋白和效应蛋白.调节因子包括鸟嘌呤核苷酸交换因子(、/和)用于激活 小 酶活化蛋白(、)用于抑制 功能 效应器在建立细胞极性和肌动蛋白细胞骨架重组的生物过程中发挥作用以应对各种类型的细胞壁应激激活细胞壁合成酶调节参与下游转录的蛋白激酶()活性并形成分泌囊泡 可定位于质膜、内体膜或过氧化物酶体膜 (/)().().构建表达载体文库进一步选择 酵母表达质粒为载体骨架构建含 的质粒文库 自身带有 营养缺陷型筛选标记但工业酵母多为原养型而且营养缺陷型酵母多存在生长缓慢的缺点不适用于工业生产过程因此对载体进行改造克隆 基因来替代 表达盒赋予酵母 抗性 载体上自带的 启动子也被磷酸甘油酸激酶启动子()替代使得基因表达不受限于半乳糖诱导系统 通过酶切连接或无缝克隆技术依次连入 基因、易错 扩增的 突变产物()最终建立 质粒文库图 为其双酶切验证结果.高乙醇耐受性突变菌株的筛选.“富集自然生长复筛”策略筛选高乙醇耐受性菌株 将构建的质粒文库通过化学转化的方法转入宿主酵母 筛选乙醇耐受性提高的突变株 对近 个突变株进行测试选取其中 株乙醇耐受性优良的菌株命名为 和均来自于./易错 体系将、菌株和对照株、接种于含乙醇的 液体培养基调节起始生物量相同测定其生长情况 如图 所示 的乙醇添加严重抑制菌体的生长延滞期由普通 培养基中的 增加至 左右 和 的生长延滞期相较对照组没有显著改善但从对数期开始其生长速率均显著高于对照组 突变株的生物量比对照组提高 以上 而单纯过表达未突变的 并不会提高菌株的乙醇耐受性(菌株)证明 或 的乙醇耐受性提高来自于蛋白序列的突变而并非 基因本身的过表达在含有乙醇的 固体培养基上点样同样证明了 和 的乙醇耐受性略优于对照组(图)更为显著 本研究采取了一种兼顾乙醇耐受性和生长速率的“富集自然生长复筛”叠加策略突变菌体文库先后经历了 乙醇冲击(过程)、自然生长(培养基未添加乙醇过程)、乙醇再次冲击(过程)三个步骤过程 淘汰掉了大多数弱胁迫耐受的突变株过程 使得未损失生长速率的菌株形成生长优势过程 为复筛乙醇耐受性 这种筛选策略有利于筛选到乙醇耐受性、发酵性能均提高的菌株且经过改进还可适用于高通量筛选设备和流程 此外在转化质粒文库进入酿酒酵母细胞时并没有使用含乙醇的 筛选条件这样可以获得尽可能多的转化子来扩大库容后续可以吸取液体方便将平板上所有菌落洗下以进行接下来的乙醇耐受性菌株筛选 微 生 物 学 杂 志 卷图 易错 产物文库构建.:易错 产物质粒文库构建流程图:不同 浓度下 的易错 结果 泳道 浓度:、.、.、.、.、./:扩增:重组质粒 利用 /双酶切电泳结果:./:/:图 突变株乙醇耐受性评价.:添加(/)乙醇下对照菌株()、过表达 菌株()与、突变菌株的生长曲线:突变菌株/和对照菌株乙醇耐受性测定 和 分别为转入 质粒和 质粒的对照菌株:(/):.突变分析提取突变株 和 中的质粒测序获得其 碱基序列氨基酸序列比对结果如表 所示 中突变蛋白有 个突变位点分别为、中突变蛋白有 个突变位点分别为、其中、为 和 共有突变位点且多个位点涉及了氨基酸类型的变化 期 谭慧萍等:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能 基因全长 非常出乎意料测序发现 和 的 有大片段的缺失()实际序列仅剩下不足 并且在原 的 向后整体出现移码(涉及 个氨基酸)直到遇到载体上序列形成终止密码子以已测定的酿酒酵母 蛋白结构为模板利用 (:/./)为突变体进行同源建模如图 所示和 中突变蛋白实际丢失了 个 螺旋结构但保留了结合 的基序 一般认为易错 导致的突变在点突变水平并不具有类似基因组改组这样具有大片段删除或重组的能力推测这种片段的大规模缺失可能来源于酵母基因组的同源重组事件表 突变位点 氨基酸突变位置 中氨基酸名称或序列 中氨基名称或序列(/)/缺失/缺失 /注:氨基酸位置基于未突变的 /中的 在其 端分别有额外的 个氨基酸残基图 蛋白三维结构预测.:与 和 结合的 三维结构:中 突变体三维结构预测:中 突变体结构预测:与其他小 酶结构类似有保守的/结合域和效应物结合域、结构域 末端还具有翻译后修饰 已有文献报道多为点突变对 功能影响如 会使 失去结合 功能、会影响 和靶蛋白的结合、会导致细胞温度敏感影响生长等但尚无此案例中这种大片段缺失对下游效应物产生影响的报道 后续可以利用免疫共沉淀法、酵母双杂交体系等寻找截短的 结合靶点探讨受其影响的代谢通路并且可以在出发菌株中构建表 所示单独点突变菌株来深入研究突变位点对菌体功能的影响 此外 和 中突变序列含有 个氨基酸突变后续实验可以考虑进一步降低 浓度来进行易错 从而降低突变频率有利于积累正突变表型.突变菌株发酵性能测定对突变菌株进行高浓度()和超高浓度 微 生 物 学 杂 志 卷()乙醇发酵通过测定其残余葡萄糖、乙醇、生物量(以菌体 表征)等参数的变化趋势来考察各菌株发酵性能 前期实验证明 和 发酵曲线相似对照菌株选择 起始葡萄糖浓度 /的 发酵过程生物量累积如图 所示相比对照菌株两株突变菌的生长不仅没有受到抑制反而在对数中后期开始显著加快说明过表达突变序列没有给菌体带来代谢负担而且对菌体的生长略有促进作用且这种促进作用来自突变后的 功能底物的消耗和乙醇生产能力如图 所示 与生长曲线类似对数中期之前突变株/和对照菌株 发酵性能差异不显著但从对数中后期开始突变株发酵速率相比对照菌株得到提升发酵终点 乙醇浓度比 提高了.而 则提高了.和 的乙醇转化率分别为 /和./发酵结果说明突变的 序列在提高乙醇转化率的同时还提高了发酵速率菌体的生长速率没有受到影响图 突变株 与 高浓度乙醇发酵.:初始葡萄糖 /发酵体系突变菌株的生物量积累曲线:初始葡萄糖 /发酵体系突变菌株的葡萄糖消耗与乙醇积累曲线:/:在 乙醇发酵过程中过高的乙醇浓度、底物浓度一般会引起细胞活力的损失导致发酵终点过高的残糖浓度和较低的发酵强度 但高乙醇浓度在分离、能耗成本上具有巨大的经济性优势因此 发酵一直是燃料乙醇工业追求的目标 实验选取 /和 /的起始葡萄糖浓度考察突变株的 发酵能力(图)结果如图 所示对照株的菌体活性已经受到严重抑制 在 /和 /起始底物浓度下发酵终点的残糖浓度分别超过 /和/而且 时/底物发酵体系较/生物量减少了.相比 和 无论是生物量积累、葡萄糖消耗速率还是终点乙醇滴度等参数均有显著的提升 /葡萄糖发酵体系中 和 乙醇生产速率从 附近与对照菌株开始呈现显著差别之后一直高于对照菌株 在 时、的乙醇浓度分别为.、./比 的乙醇浓度(./)分别高出.和.显示出更好的乙醇生产能力及生产强度 /底物浓度发酵体系中 和 的生物量分别较对照 增加了.和.在 时 和 的乙醇产量较 分别提高了.和.并且这种优势一直保持到发酵终点 可见无论是生物量积累、底物消耗还是终点乙醇浓度、生产强度等方面突变株都有很强的优势且 略优于 说明这种靶点定向进化策略不仅可以提高菌体的乙醇耐受性同时还提高了菌株生长速率和发酵终点乙醇浓度推测副产物生成比例降低使得碳流量更多流向乙醇的合成途径 期 谭慧萍等:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能图 突变株的超高浓度()乙醇发酵.():初始葡萄糖 /发酵体系中突变菌株的生物量积累曲线:初始葡萄糖 /发酵体系中突变菌株的葡萄糖消耗/乙醇累积曲线:初始葡萄糖添加 /发酵体系中突变菌株的生物量积累曲线:初始葡萄糖添加 /发酵体系中突变菌株的葡萄糖消耗/乙醇累积曲线:/:/:/:/讨 论.作为有效的蛋白定向进化靶点酿酒酵母有 个已知的 小 酶分别为 和 其活性受()或 ()调节()也是其功能重要调节蛋白影响到 小 酶的亚细胞定位 和 与()途径、激酶级联系统、复合物 ()依赖的信号级联过程等密切相关涉及肌动蛋白细胞骨架建立、细胞极性发生(出芽、交配、假菌丝生长)、分泌、依赖细胞周期调控或胞外信号刺激的转录和翻译后修饰等生物学过程 实验选取 作为定向进化的靶蛋白在 和 中并未敲除原始的 序列因此未突变的 和 同时发挥功能但实验证明单纯过表达(菌株)并不能带来显著的乙醇耐受性改善说明突变后的 与效应蛋白结合种类及方式的变化才是根本上改善复杂表型的原因而不仅仅是表达量的上调 和 同时提高了乙醇耐受性和发酵性能且糖醇转化率高于对照推测 改变了乙醇生成代谢途径的碳流量副产物生成一定程度受到抑制后续可测定其甘油等副产物含量进行深入分析 功能与细胞形态改变密切相关本研究获得的突变体在单次的批次发酵中(和)并未观察到与对照组相比显著的形态变化后续可考察其在重复批次发酵、连续发酵中突 微 生 物 学 杂 志 卷变体的形态变化考察从细胞形态调节角度选取定向进化的靶点的可能类似 复合物因子具有多种代谢调节作用的 小 酶因其足够广泛的下游作用靶点和上游调节靶基因可以实现充分的代谢扰动 后续可以利用 等其他家族基因成员进行类似的文库构建和改造工作本研究为复杂表型的获得提供了一类新的靶点和思路.改善工业微生物复杂表型的策略乙醇耐受性是多基因、多代谢途径共同参与调控的复杂表型而且提高乙醇耐受性最终目的是获得高发酵性能、可应用于工业生产的菌株又进一步提高了菌株构建、筛选的难度 高耐受性菌株筛选多为直接涂布含乙醇的固体平板挑取单菌落很少会经过无胁迫条件下“自然生长”过程 之前实验室也采用多种策略筛选过乙醇耐受性提高的菌株经常发现在含高浓度乙醇的平板上生长优势显著的突变株转接于普通 后相比对照生长速率削减严重乙醇耐受性和发酵性能改良往往不能兼得 推测其原因为乙醇耐受性提高的菌株可能经历了复杂的胞内代谢网络重塑代谢流更多流向抵御乙醇毒害的物质的合成这可能会带来额外代谢负担并以牺牲菌体的生长速率为代价 本研究改良的三步骤筛选方法成功获得了乙醇耐受性提高同时兼具高发酵效率的菌株可以应用到其他胁迫耐受菌株的筛选中近年来进行基因组快速进化、实现复杂表型提升的方法发展迅速包括随机突变方法和半理性进化技术前者如物理化学诱变、基因组改组、本研究使用的易错 技术、转座子突变、人工锌指蛋白文库方法、重组酶介导的基因 组 进 化 等 后 者 包 括、等(综述可见文献)这些方法借助了基因编辑技术、高通量测序技术等也有综合了合成生物学方法与常压室温等离子体诱变育种技术获得高性能多重抗逆工业酵母的实例 可以根据实验需求和实验室条件选择合适的方法特别是借助高效的筛选手段一般都可以获得目的表型 后期可以借助组学等手段分析相关基因和代谢途径有利于最终揭示菌体胁迫响应的机理参考文献:.():.许可王靖楠李春.智能抗逆微生物细胞工厂与绿色生物制造.合成生物学 ():.():.():.():.():.赵心清姜如娇李宁等.利用 的定向进化提高工业酿酒酵母乙醇耐受性.生物工程学报 ():.():.:.():.():.():.:.:.():.():.():.期 谭慧萍等:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能 ():.():./:.():.:.():.():.():.():.():.():./.():.():.():.():.:.():.():.():.:.:.():.():.():.().():.():.():.:.:.():.():.():.():.():.夏思杨 江丽红 蔡谨等.酿酒酵母基因组进化的研究进展.合成生物学 ():.().():.微 生 物 学 杂 志 卷