氨基酸分析仪基本原理及应用_56页.pdf

氨基酸分析仪基本原理及应用氨基酸分析仪基本原理及应用上海交通大学分析测试中心上海交通大学分析测试中心侯敬丽侯敬丽内容内容一、一、一、一、氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸二、二、二、二、氨基酸分析仪氨基酸分析仪氨基酸分析仪氨基酸分析仪三三三三、样品的制备样品的制备样品的制备样品的制备四、四、四、四、应用应用应用应用（一）氨基酸的定义（一）氨基酸的定义（一）氨基酸的定义（一）氨基酸的定义氨基酸：氨基酸：是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。氨基酸含有一个碱性氨基和一个酸性羧基，氨基一般连在是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。氨基酸含有一个碱性氨基和一个酸性羧基，氨基一般连在-碳上。碳上。一、氨基酸一、氨基酸一、氨基酸一、氨基酸（amino acidsamino acidsamino acidsamino acids）?组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即-碳原子。组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即-碳原子。?-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和R基团，不同氨基酸的R基团不同。-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和R基团，不同氨基酸的R基团不同。?每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L-构型。每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L-构型。?广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样等）。广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样等）。-氨基酸在溶液中受溶液pH的影响存在着下列平衡：氨基酸在溶液中受溶液pH的影响存在着下列平衡：pHpIpH=pIpHpIpHpIpH=pIpHpI偶极离子-净电荷为零-在电场中不移动，此时溶液的pH值称为等电点偶极离子-净电荷为零-在电场中不移动，此时溶液的pH值称为等电点（pIpI）。OH-H+OH-H+R CH COO-NH2+NH3_R CH COOHR CH COONH3+氨基酸等电点氨基酸等电点?丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸Ala(AAla(AAla(AAla(A)6.02 )6.02 )6.02 )6.02 精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸Arg(RArg(RArg(RArg(R)10.76)10.76)10.76)10.76?天冬酰胺天冬酰胺天冬酰胺天冬酰胺Asn(NAsn(NAsn(NAsn(N)5.41 )5.41 )5.41 )5.41 天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸 Asp(DAsp(DAsp(DAsp(D)2.98)2.98)2.98)2.98?半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸Cys(CCys(CCys(CCys(C)5.02 )5.02 )5.02 )5.02 谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸Glu(EGlu(EGlu(EGlu(E)3.22)3.22)3.22)3.22?谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺Gln(OGln(OGln(OGln(O)5.65 )5.65 )5.65 )5.65 甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸Gly(GGly(GGly(GGly(G)5.97)5.97)5.97)5.97?组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸His(HHis(HHis(HHis(H)7.58 )7.58 )7.58 )7.58 亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸Leu(LLeu(LLeu(LLeu(L)5.98)5.98)5.98)5.98?赖氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸Lys(KLys(KLys(KLys(K)9.74 )9.74 )9.74 )9.74 蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸Met(MMet(MMet(MMet(M)5.75)5.75)5.75)5.75?苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸Phe(FPhe(FPhe(FPhe(F)5.48 )5.48 )5.48 )5.48 脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸Pro(PPro(PPro(PPro(P)6.30)6.30)6.30)6.30?丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸Ser(SSer(SSer(SSer(S)5.68 )5.68 )5.68 )5.68 苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸Thr(TThr(TThr(TThr(T)6.53)6.53)6.53)6.53?色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸Trp(WTrp(WTrp(WTrp(W)5.88 )5.88 )5.88 )5.88 酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸Tyr(YTyr(YTyr(YTyr(Y)5.65)5.65)5.65)5.65?缬氨酸缬氨酸缬氨酸缬氨酸Val(VVal(VVal(VVal(V)5.97 )5.97 )5.97 )5.97 异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸 Ile(IIle(IIle(IIle(I)6.026.026.026.02按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：中性氨基酸：中性氨基酸：中性氨基酸：中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨基酸类）氨基酸类）氨基酸类）氨基酸类）酸性氨基酸：酸性氨基酸：酸性氨基酸：酸性氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸天门冬氨酸、谷氨酸天门冬氨酸、谷氨酸天门冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸：碱性氨基酸：碱性氨基酸：碱性氨基酸：赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸（二）氨基酸的分类氨基酸的分类酸性氨基酸酸性氨基酸pIpI2.8-3.2中性氨基酸2.8-3.2中性氨基酸pIpI5.0-6.3碱性氨基酸5.0-6.3碱性氨基酸pIpI7.6-10.87.6-10.8（三）（三）氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质氨基酸分子中都具有氨基酸分子中都具有氨基酸分子中都具有氨基酸分子中都具有氨基和羧基氨基和羧基氨基和羧基氨基和羧基，因此它们都能产生氨基与羧基的一般反因此它们都能产生氨基与羧基的一般反因此它们都能产生氨基与羧基的一般反因此它们都能产生氨基与羧基的一般反应，如应，如应，如应，如脂化、甲基化、乙酰化脂化、甲基化、乙酰化脂化、甲基化、乙酰化脂化、甲基化、乙酰化以及以及以及以及酸碱酸碱酸碱酸碱的中和的中和的中和的中和作用等。有些氨基酸由于存在其作用等。有些氨基酸由于存在其作用等。有些氨基酸由于存在其作用等。有些氨基酸由于存在其它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的巯基（巯基（巯基（巯基（SH)SH)SH)SH)。茚三酮反应茚三酮反应茚三酮反应茚三酮反应（四）氨基酸的分离分析（四）氨基酸的分离分析（四）氨基酸的分离分析（四）氨基酸的分离分析?特殊沉淀法特殊沉淀法特殊沉淀法特殊沉淀法?离子交换法离子交换法离子交换法离子交换法?萃取法萃取法萃取法萃取法?毛细电渗析毛细电渗析毛细电渗析毛细电渗析离子交换法分离分析氨基酸的原理离子交换法分离分析氨基酸的原理离子交换法分离分析氨基酸的原理离子交换法分离分析氨基酸的原理根据氨基酸是两性电解质这一特性，根据氨基酸是两性电解质这一特性，根据氨基酸是两性电解质这一特性，根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与杂质氨基酸以及目的氨基酸与杂质氨基酸以及目的氨基酸与杂质氨基酸以及目的氨基酸与杂质氨基酸pKpKpKpK、pIpIpIpI值值值值的差异，利用离子交换树脂对各种氨基的差异，利用离子交换树脂对各种氨基的差异，利用离子交换树脂对各种氨基的差异，利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同进行分离纯化。酸吸附能力的不同进行分离纯化。酸吸附能力的不同进行分离纯化。酸吸附能力的不同进行分离纯化。二、氨基酸分析仪二、氨基酸分析仪二、氨基酸分析仪二、氨基酸分析仪氨基酸分析仪的定义：氨基酸分析仪的定义：氨基酸分析仪的定义：氨基酸分析仪的定义：氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各行各业。它与其它分析仪器区别在于行各业。它与其它分析仪器区别在于行各业。它与其它分析仪器区别在于行各业。它与其它分析仪器区别在于只能检测只能检测只能检测只能检测氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸不能作为它用，具有专一性。从仪器的不能作为它用，具有专一性。从仪器的不能作为它用，具有专一性。从仪器的不能作为它用，具有专一性。从仪器的配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法（离子交换柱后茚三酮衍生方法）。（离子交换柱后茚三酮衍生方法）。（离子交换柱后茚三酮衍生方法）。（离子交换柱后茚三酮衍生方法）。氨基酸分析仪基本分析原理氨基酸分析仪基本分析原理氨基酸分析仪基本分析原理氨基酸分析仪基本分析原理各种蛋白质都是由各种蛋白质都是由各种蛋白质都是由各种蛋白质都是由20202020种氨基酸首尾相连，并以一定的种氨基酸首尾相连，并以一定的种氨基酸首尾相连，并以一定的种氨基酸首尾相连，并以一定的顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。所有的氨基酸在低基酸进行分析。所有的氨基酸在低基酸进行分析。所有的氨基酸在低基酸进行分析。所有的氨基酸在低PHPHPHPH值的条件下都带有正值的条件下都带有正值的条件下都带有正值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、的洗脱程序，用不同离子强度、的洗脱程序，用不同离子强度、的洗脱程序，用不同离子强度、PHPHPHPH值的缓冲液依次将氨基值的缓冲液依次将氨基值的缓冲液依次将氨基值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应（在加热的条件下反应（在加热的条件下反应（在加热的条件下反应（135135135135度），生成可在分光光度计中度），生成可在分光光度计中度），生成可在分光光度计中度），生成可在分光光度计中570nm570nm570nm570nm和和和和440nm440nm440nm440nm检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质440nm440nm440nm440nm检测检测检测检测)，外标法定量。，外标法定量。，外标法定量。，外标法定量。氨基酸分析仪洗脱过程氨基酸分析仪洗脱过程氨基酸分析仪洗脱过程氨基酸分析仪洗脱过程1 1 1 1.氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸在在在在PH2.2PH2.2PH2.2PH2.2的条件下的条件下的条件下的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均都带正电荷，在阳离子交换树脂上均都带正电荷，在阳离子交换树脂上均都带正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附被吸附被吸附被吸附,但结合强度各不相同。但结合强度各不相同。但结合强度各不相同。但结合强度各不相同。2 2 2 2.随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地吸附、解吸附吸附、解吸附吸附、解吸附吸附、解吸附。由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）,吸附强度吸附强度吸附强度吸附强度有差异。有差异。有差异。有差异。3 3 3 3.不同氨基酸与离子交换树脂的不同氨基酸与离子交换树脂的不同氨基酸与离子交换树脂的不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力亲和力亲和力亲和力不同：不同：不同：不同：碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸 芳香芳香芳香芳香族氨基酸族氨基酸族氨基酸族氨基酸 中性氨基酸中性氨基酸中性氨基酸中性氨基酸 酸性氨基酸及羟基氨基酸。酸性氨基酸及羟基氨基酸。酸性氨基酸及羟基氨基酸。酸性氨基酸及羟基氨基酸。4.4.4.4.提高流动相提高流动相提高流动相提高流动相PHPHPHPH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱上洗脱下来。子交换柱上洗脱下来。子交换柱上洗脱下来。子交换柱上洗脱下来。洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸基酸、碱性氨基酸基酸、碱性氨基酸基酸、碱性氨基酸。5 5 5 5.氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺被洗脱的顺被洗脱的顺被洗脱的顺序一定序一定序一定序一定;标准液各种氨基酸的浓度一定标准液各种氨基酸的浓度一定标准液各种氨基酸的浓度一定标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定，洗脱峰的面积一定，洗脱峰的面积一定，洗脱峰的面积一定;由此由此由此由此可计算出样品中各种氨基酸的含量。可计算出样品中各种氨基酸的含量。可计算出样品中各种氨基酸的含量。可计算出样品中各种氨基酸的含量。离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂?专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树脂的粒度一般在脂的粒度一般在脂的粒度一般在脂的粒度一般在之间，交联度多为之间，交联度多为之间，交联度多为之间，交联度多为。?交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用于蛋白质、肽类的分离。于蛋白质、肽类的分离。于蛋白质、肽类的分离。于蛋白质、肽类的分离。日立日立日立日立L L L L-8900890089008900全自动氨基酸分析仪全自动氨基酸分析仪全自动氨基酸分析仪全自动氨基酸分析仪日立氨基酸分析仪的历史日立氨基酸分析仪的历史日立氨基酸分析仪的历史日立氨基酸分析仪的历史Sold KLAin 1962Sold KLAin 1962KLA-5835L-8500KLA-5835L-8500四十多年的历史，拥有2000多用户四十多年的历史，拥有2000多用户L-8800L-8800L-8900L-8900L L-8900 AAA8900 AAA的内部结构的内部结构L L-8900 AAA8900 AAA的组成的组成组件名称组件名称组件名称组件名称参数参数参数参数缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液6 6 6 6种（试剂与清洗液）种（试剂与清洗液）种（试剂与清洗液）种（试剂与清洗液）色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱4.6mm id x 60mm4.6mm id x 60mm4.6mm id x 60mm4.6mm id x 60mm，阳离子树脂填充（标配阳离子树脂填充（标配阳离子树脂填充（标配阳离子树脂填充（标配)泵泵泵泵0.0010.0010.0010.001-0.999ml/min,00.999ml/min,00.999ml/min,00.999ml/min,0-20MPa,220MPa,220MPa,220MPa,2自动进样器自动进样器自动进样器自动进样器1500150015001500 l;200vial(200 cooler);0.1l;200vial(200 cooler);0.1l;200vial(200 cooler);0.1l;200vial(200 cooler);0.1-100100100100 l l l l柱温箱柱温箱柱温箱柱温箱20202020-85858585（1 1 1 1）,电子加热电子加热电子加热电子加热/制冷的温控装置。制冷的温控装置。制冷的温控装置。制冷的温控装置。反应单元反应单元反应单元反应单元50505050-140140140140,电子加热的温控系统电子加热的温控系统电子加热的温控系统电子加热的温控系统检测单元检测单元检测单元检测单元可见分光光度计（可见分光光度计（可见分光光度计（可见分光光度计（570570570570，440nm440nm440nm440nm）控制系统控制系统控制系统控制系统EZChromEZChromEZChromEZChromElite Elite Elite Elite 分析软件分析软件分析软件分析软件CPU:32bits OS,Windows CPU:32bits OS,Windows CPU:32bits OS,Windows CPU:32bits OS,Windows xpxpxpxpL L-8900 AAA8900 AAA的分析原理的分析原理L-8900 AAA的流程图的流程图1、样品中的氨基酸在低PH的条件下都带有正电荷,在阳离子交换树脂上均被吸附,但吸附的程度不同,碱性氨基酸结合力最强其次为中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。2、按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来，3、分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。、样品中的氨基酸在低PH的条件下都带有正电荷,在阳离子交换树脂上均被吸附,但吸附的程度不同,碱性氨基酸结合力最强其次为中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。2、按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来，3、分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。L L-8900 AAA8900 AAA的性能指标的性能指标的性能指标的性能指标以蛋白水解液标准分析方法为例：以蛋白水解液标准分析方法为例：以蛋白水解液标准分析方法为例：以蛋白水解液标准分析方法为例：?净分析时间：净分析时间：净分析时间：净分析时间：30303030分钟分钟分钟分钟?检出限：检出限：检出限：检出限：3 3 3 3 pmolpmolpmolpmol(信噪比信噪比信噪比信噪比=2=2=2=2，天门冬氨酸），天门冬氨酸），天门冬氨酸），天门冬氨酸）?保留时间重现性：保留时间重现性：保留时间重现性：保留时间重现性：CV 0.3%CV 0.3%CV 0.3%CV 0.3%（精氨酸）（精氨酸）（精氨酸）（精氨酸）?峰面积重现性：峰面积重现性：峰面积重现性：峰面积重现性：CV 1.0%(CV 1.0%(CV 1.0%(CV 1.0%(甘氨酸、组氨酸）甘氨酸、组氨酸）甘氨酸、组氨酸）甘氨酸、组氨酸）氨基酸分析仪最大的特点：氨基酸分析仪最大的特点：1 1 灵敏、快速、提供数据准确可靠：分辨灵敏、快速、提供数据准确可靠：分辨率高、操作简单，分析周期短（水解率高、操作简单，分析周期短（水解3030分分钟、体液钟、体液110110分钟）。分钟）。2 2 保留时间、峰面积、重现性好，检出限保留时间、峰面积、重现性好，检出限可达可达3pmol3pmol。3 3 不存在液相方法生成二级衍生物的问题。不存在液相方法生成二级衍生物的问题。4 4 峰形显高斯分布，体系稳定快（半小时峰形显高斯分布，体系稳定快（半小时即可）。即可）。氨基酸分析仪法与氨基酸分析仪法与HPLCHPLC法比较法比较近年来常见常用的检测氨基酸的液相方法不少，主近年来常见常用的检测氨基酸的液相方法不少，主要介绍以下几种常用的方法与氨基酸分析仪法进行比较：要介绍以下几种常用的方法与氨基酸分析仪法进行比较：（一）（一）OPAOPA法（邻苯二甲醛）（法（邻苯二甲醛）（反应机理略）反应机理略）最大的不足之处是：最大的不足之处是：做全分析时需配以其他技术一起使做全分析时需配以其他技术一起使用，方可与带有仲氨基团的氨基酸进行反应。用，方可与带有仲氨基团的氨基酸进行反应。赖氨酸及赖氨酸及胱氨酸衍生物荧光较弱，灵敏度低。胱氨酸衍生物荧光较弱，灵敏度低。因为因为OPAOPA是快速反应是快速反应剂，有些氨基酸反应极其不稳定，剂，有些氨基酸反应极其不稳定，特别是甘氨酸、赖氨特别是甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号衰减很快，一天变化很大酸衍生物的信号衰减很快，一天变化很大。从以往我们。从以往我们做的实验来看此方法的变异系数做的实验来看此方法的变异系数CV%CV%一般为一般为5 5左右左右，个，个别的氨基酸如组氨酸可达别的氨基酸如组氨酸可达9%9%左右左右，尤其对带有盐分的，尤其对带有盐分的饲饲料氨基酸类样品特别不适合料氨基酸类样品特别不适合，因样品中带有的盐分直接，因样品中带有的盐分直接影响衍生（紫外法基线不好）。影响衍生（紫外法基线不好）。（二）（二）PITCPITC法（异硫氰酸苯脂）法（异硫氰酸苯脂）（反应机理略）（反应机理略）此方法的重现性明显低于茚三酮法，此方法的重现性明显低于茚三酮法，最大最大的缺点是的缺点是：一个组分衍生后可生成：一个组分衍生后可生成2 2个以上的个以上的衍生物，而且和其它组分峰重叠，灵敏度比较衍生物，而且和其它组分峰重叠，灵敏度比较低。由于有残留的衍生剂，柱效与柱寿命降低低。由于有残留的衍生剂，柱效与柱寿命降低很快（做很快（做200200左右样品），变异系数在左右样品），变异系数在4%4%左左右右，也偏大，个别氨基酸如组氨酸可达，也偏大，个别氨基酸如组氨酸可达8%8%，某，某些氨基酸在些氨基酸在2424小时内即降解。小时内即降解。（三）（三）D D-CLCL法（丹酰氯）法（丹酰氯）（反应机理略）（反应机理略）反应比较简单以反应比较简单以5 5个个mol/Lmol/L比例，在室温、避光条件下几时比例，在室温、避光条件下几时分钟即可完成反应。分钟即可完成反应。缺点不足之处是：缺点不足之处是：衍生物对紫外比较敏感，反应必需要在衍生物对紫外比较敏感，反应必需要在避光下进行，赖氨酸、组氨酸和胱氨酸均生成二级衍生物避光下进行，赖氨酸、组氨酸和胱氨酸均生成二级衍生物影响准确测量。影响准确测量。（四）（四）2 2、4 4-二硝基氟苯法二硝基氟苯法（反应机理略）（反应机理略）此方法是比较常见的液相测定方法，此方法是比较常见的液相测定方法，最大的缺点是最大的缺点是衍生剂衍生剂峰比较大，对柱子危害比较厉害。组氨酸分离不好、组氨峰比较大，对柱子危害比较厉害。组氨酸分离不好、组氨酸的二级衍生物与丝氨酸重叠，另一个峰柱效降低时完全酸的二级衍生物与丝氨酸重叠，另一个峰柱效降低时完全溶入到前面苯丙峰中，直接影响定量，日间变化比较大。溶入到前面苯丙峰中，直接影响定量，日间变化比较大。氨基酸分析仪与氨基酸分析仪与氨基酸分析仪与氨基酸分析仪与HPLCHPLC常规比较常规比较常规比较常规比较三、样品的制备三、样品的制备三、样品的制备三、样品的制备（一）（一）（一）（一）蛋白质的水解蛋白质的水解蛋白质的水解蛋白质的水解（二）（二）（二）（二）游离氨基酸样品的制备游离氨基酸样品的制备游离氨基酸样品的制备游离氨基酸样品的制备（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，的都要进行水解处理，的都要进行水解处理，的都要进行水解处理，水解方法有三种：水解方法有三种：水解方法有三种：水解方法有三种：1.1.1.1.酸水解法酸水解法酸水解法酸水解法：标准水解法，是普遍采用的水解方法，在水：标准水解法，是普遍采用的水解方法，在水：标准水解法，是普遍采用的水解方法，在水：标准水解法，是普遍采用的水解方法，在水解过程中采用解过程中采用解过程中采用解过程中采用6N6N6N6N的盐酸作为水解剂，此方法的特点是水的盐酸作为水解剂，此方法的特点是水的盐酸作为水解剂，此方法的特点是水的盐酸作为水解剂，此方法的特点是水解彻底，水解后的氨基酸全部以解彻底，水解后的氨基酸全部以解彻底，水解后的氨基酸全部以解彻底，水解后的氨基酸全部以L L L L-型形式存在，但色氨型形式存在，但色氨型形式存在，但色氨型形式存在，但色氨酸遭破坏。（酸遭破坏。（酸遭破坏。（酸遭破坏。（6NHCL6NHCL6NHCL6NHCL、110110110110真空水解真空水解真空水解真空水解24242424小时）小时）小时）小时）优点：优点：优点：优点：HCLHCLHCLHCL本身加热可以蒸发除掉。本身加热可以蒸发除掉。本身加热可以蒸发除掉。本身加热可以蒸发除掉。缺点：缺点：缺点：缺点：溶液显黒褐色、与含醛基化合物作用的结果。溶液显黒褐色、与含醛基化合物作用的结果。溶液显黒褐色、与含醛基化合物作用的结果。溶液显黒褐色、与含醛基化合物作用的结果。提示：提示：提示：提示：盐酸中的重金属，作为接触剂可使氨基酸遭受破盐酸中的重金属，作为接触剂可使氨基酸遭受破盐酸中的重金属，作为接触剂可使氨基酸遭受破盐酸中的重金属，作为接触剂可使氨基酸遭受破坏，故要求用高纯度的盐酸水解样品。坏，故要求用高纯度的盐酸水解样品。坏，故要求用高纯度的盐酸水解样品。坏，故要求用高纯度的盐酸水解样品。2 2 2 2、碱水解法：碱水解法：碱水解法：碱水解法：用用用用2.5N2.5N2.5N2.5N氢氧化钠（氢氧化锂）作为水解氢氧化钠（氢氧化锂）作为水解氢氧化钠（氢氧化锂）作为水解氢氧化钠（氢氧化锂）作为水解剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、胱氨酸遭到不同程度的破坏。氨酸、精氨酸、胱氨酸遭到不同程度的破坏。氨酸、精氨酸、胱氨酸遭到不同程度的破坏。氨酸、精氨酸、胱氨酸遭到不同程度的破坏。(水解水解水解水解时时时时20202020小时）小时）小时）小时）优点：优点：优点：优点：水解液清亮。水解液清亮。水解液清亮。水解液清亮。缺点：缺点：缺点：缺点：使氨基酸发生外消旋作用，水解产物氨基酸使氨基酸发生外消旋作用，水解产物氨基酸使氨基酸发生外消旋作用，水解产物氨基酸使氨基酸发生外消旋作用，水解产物氨基酸有有有有L L L L-型和型和型和型和D D D D-型，水解过程中会放出氨气和硫化氢。型，水解过程中会放出氨气和硫化氢。型，水解过程中会放出氨气和硫化氢。型，水解过程中会放出氨气和硫化氢。提示：提示：提示：提示：只是为了测定蛋白质中色氨酸含量才会采用只是为了测定蛋白质中色氨酸含量才会采用只是为了测定蛋白质中色氨酸含量才会采用只是为了测定蛋白质中色氨酸含量才会采用此水解方法。此水解方法。此水解方法。此水解方法。3 3 3 3、酶水解法酶水解法酶水解法酶水解法：酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是：酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是：酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是：酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。优点：优点：优点：优点：水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破坏；产物中除氨基酸外尚有较多肽类，目前来讲还没有坏；产物中除氨基酸外尚有较多肽类，目前来讲还没有坏；产物中除氨基酸外尚有较多肽类，目前来讲还没有坏；产物中除氨基酸外尚有较多肽类，目前来讲还没有一种酶能全部完全水解蛋白质；与酸法比较酶法要考虑一种酶能全部完全水解蛋白质；与酸法比较酶法要考虑一种酶能全部完全水解蛋白质；与酸法比较酶法要考虑一种酶能全部完全水解蛋白质；与酸法比较酶法要考虑酶试剂的种类、量、温度、酶试剂的种类、量、温度、酶试剂的种类、量、温度、酶试剂的种类、量、温度、PHPHPHPH值等因素，值等因素，值等因素，值等因素，此方法主要用此方法主要用此方法主要用此方法主要用于生产水解蛋白及蛋白肽。于生产水解蛋白及蛋白肽。于生产水解蛋白及蛋白肽。于生产水解蛋白及蛋白肽。缺点：缺点：缺点：缺点：水解时间长、而且不易水解完全。水解时间长、而且不易水解完全。水解时间长、而且不易水解完全。水解时间长、而且不易水解完全。提示：提示：提示：提示：作为氨基酸全分析不可采用此法。作为氨基酸全分析不可采用此法。作为氨基酸全分析不可采用此法。作为氨基酸全分析不可采用此法。目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺均为均为均为均为酸水解法。酸水解法。酸水解法。酸水解法。4 4 4 4、微波消解法：、微波消解法：、微波消解法：、微波消解法：微波消解技术，近年来在化学领域尤其是在氨基酸样品前微波消解技术，近年来在化学领域尤其是在氨基酸样品前微波消解技术，近年来在化学领域尤其是在氨基酸样品前微波消解技术，近年来在化学领域尤其是在氨基酸样品前处理方面显示出了良好的应用前景。处理方面显示出了良好的应用前景。处理方面显示出了良好的应用前景。处理方面显示出了良好的应用前景。常规的水解方法：常规的水解方法：常规的水解方法：常规的水解方法：需要在一定条件下水解需要在一定条件下水解需要在一定条件下水解需要在一定条件下水解2222222224242424小时，该法存在水解时间小时，该法存在水解时间小时，该法存在水解时间小时，该法存在水解时间长、耗时耗电、不利于快速检测大量样品前处理工作。长、耗时耗电、不利于快速检测大量样品前处理工作。长、耗时耗电、不利于快速检测大量样品前处理工作。长、耗时耗电、不利于快速检测大量样品前处理工作。微波消解技术：微波消解技术：微波消解技术：微波消解技术：与传统的水解方法相比，有明显的优势。其原理是能量的与传统的水解方法相比，有明显的优势。其原理是能量的与传统的水解方法相比，有明显的优势。其原理是能量的与传统的水解方法相比，有明显的优势。其原理是能量的传递是通过分子的极化，而不是分子间的碰撞完成的，依赖水分子的高效传递是通过分子的极化，而不是分子间的碰撞完成的，依赖水分子的高效传递是通过分子的极化，而不是分子间的碰撞完成的，依赖水分子的高效传递是通过分子的极化，而不是分子间的碰撞完成的，依赖水分子的高效极化作用，样品可以快速吸收微波辐射的能量，微波技术还有一个重要的极化作用，样品可以快速吸收微波辐射的能量，微波技术还有一个重要的极化作用，样品可以快速吸收微波辐射的能量，微波技术还有一个重要的极化作用，样品可以快速吸收微波辐射的能量，微波技术还有一个重要的特性，即能穿透一些介质，直接把能量辐射作用到反应物上，使之极性分特性，即能穿透一些介质，直接把能量辐射作用到反应物上，使之极性分特性，即能穿透一些介质，直接把能量辐射作用到反应物上，使之极性分特性，即能穿透一些介质，直接把能量辐射作用到反应物上，使之极性分