地黄饮子加减方对APP_PS1双转基因痴呆小鼠行为学及突触可塑性相关蛋白的影响.pdf

论著地黄饮子加减方对 /双转基因痴呆小鼠行为学及突触可塑性相关蛋白的影响谢芳 周兰【摘要】目的 观察地黄饮子加减方对/双转基因痴呆小鼠行为学及海马突触可塑性相关蛋白的影响探讨地黄饮子加减方保护海马神经元及改善海马突触可塑性可能作用机制 方法 将 只/痴呆小鼠随机分为模型组、模型西药组(盐酸多奈哌齐片)、模型中药组(地黄饮子加减方)每组各 只另将 只 小鼠设为空白组 水迷宫、旷场实验检测各组小鼠行为学 染色、尼氏染色检测各组小鼠海马神经元数量差异免疫荧光检测各组小鼠、表达情况结果 与模型组比较模型中药组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短、穿越平台次数增加(.)与模型组比较模型中药组小鼠进入中央区次数及中央区活动时间明显增加(.)与模型组比较模型中药组小鼠海马神经元损伤情况得到明显改善与模型组比较模型中药组小鼠海马突触可塑性相关蛋白、荧光表达明显增强 结论 地黄饮子加减方可改善痴呆小鼠学习记忆能力改善痴呆小鼠神经元损伤增强海马神经元突触可塑性相关蛋白表达从而起到防治痴呆的作用【关键词】地黄饮子加减方 阿尔茨海默病 学习记忆能力 突触可塑性中图分类号 文献标识码:././.:.【】/./()().(.).(.).【】阿尔茨海默病()即老年性痴呆属于慢性、进行性及获得性的认知障碍不但表现为智能减退且伴有不同程度的人格改变是老年人最常见的痴呆病因其发病人数多约占痴呆总人数的/是现公共卫生最紧迫的挑战之一 研究发现目前全球约有 万的痴呆患者 基金项目:蚌埠医学院自然科学重点项目()作者单位:安徽蚌埠蚌埠医学院第一附属医院 通信作者:周兰:.且预计到 年全球痴呆发病人数高达 万给家庭、社会带来极大经济负担和思想压力我国也将面临高额 治疗费用 学习记忆是指大脑各神经元、突触之间相互作用及相关联系而形成的复杂生物活动属于大脑高级活动 突触可塑性是指可调节性的神经系统细胞间的信息传递包括突触结构、传递效能的改变 二者之间互相影响、关系密切突触可塑性是学习记忆发生改变的物质基础而学习记忆能力提高又可促进突触数量、体积及面积等的增加进而形成新的神经回路 研究显示突齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 .触可塑性具有随外部环境改变特性以维持内部环境的相对稳定性其作为独特的神经网络可能与学习记忆关系密切 神经元损伤、神经细胞及突触数量减少被认为是 发病 的 神 经 病 理 学 基 础 等认为突触数量减少突触可塑性相关蛋白如生长相关蛋白()、突触后致密物()、突触素()等水平下降、突触结构模糊、突触效能降低、突触间隙增大是学习记忆能力降低产生的重要因素其与 认知功能障碍程度呈正相关 因此通过提高突触可塑性功能减轻神经元损伤可能是防治 的有效治疗措施目前地黄饮子通过改善学习记忆能力、提高突触可塑性功能在/动物模型方面的研究较少其潜在作用机制尚不明确 本研究运用地黄饮子加减方干预/痴呆小鼠探讨地黄饮子加减方对 神经突触可塑性改善作用及其机制以期为 防治提供详实的实验数据支持一、材料与方法.实验材料:()实验动物:选择 月龄清洁级 小鼠体重()雄性 只 月龄 级/小鼠 只购自北京斯贝福生物技术有限公司(京)饲养于蚌埠医学院动物实验中心 分笼饲养每笼 只室温(.)湿度(.)严格按照蚌埠医学院动物实验中心要求的对动物护理、使用规则完成实验中的所有操作并给予实验动物人道主义关怀 动物实验的开展得到了本院动物实验伦理委员会批准(批号:伦动科批字 第 号)()实验药物与试剂:所用地黄饮子为加减方剂是由古代经典名方地黄饮子去附子去肉桂变桂枝加人参、血竭等药物化裁而成全方具有开窍、化痰、补肾、活血的功效 药材购自蚌埠医学院第一附属医院药材合格且符合 版中华人民共和国药典中记载的中药材标准 在蚌埠医学院动物实验中心以纯净水配置成等成人剂量水煎液体含生药量./冷藏保存备用 盐酸多奈哌齐片由卫材(中 国)药 业 有 限 公 司 制 造 批 准 文 号:用纯净水配置成含药量为./的溶液 冷藏备用 无水乙醇、甲酚紫(中国国药公司货号分别为、)冰醋酸(中国科密欧公司货号)多聚甲醛、戊二醛(中国 公司货号分别为、)二甲苯、柠檬酸钠(中国阿拉丁公司货号分别为 、)牛血清白蛋白 ()(公司货号)即用型 染液(凯基生物公司货号)一抗:、(公司货号分别为、)二抗:()(公司货号)()实验仪器及设备:水迷宫装备(德国 公司)组织脱水(浙江金华科迪仪器设备有限公司)石蜡包 埋()切 片 机()摊片机()显微镜()全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司)电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)微型离心机()紫外分光光度仪()高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)电泳仪(北京六一生物科技有限公司)旋涡混合器(常州越新仪器制造有限公司).方法:()实验分 组 及 给 药:空 白 对 照 组 小鼠 只将 只/小鼠随机分为模型组、西药组、中药组共 组每组各 只 给药方法:空白组、模型组小鼠用纯净水 /灌胃 次/中药组小鼠分别按体重用含生药量分别为./地黄饮子中药汁灌胃 次/西药组小鼠以./盐酸多奈哌齐片溶液灌胃 次/给药结束后每组随机取 只用于实验指标的检测()水迷宫实验:水迷宫设备检测区域避光、周围安静水温保持在 左右 测试前一天对每只小鼠进行 适应性游泳训练 实验小鼠需完成定位航行实验、空间探索实验两项检测 定位航行实验:定位航行实验进行 每只小鼠每天训练 次每次 记录小鼠找寻到安全平台需要的时间(逃避潜伏期)若小鼠在 内发现安全平台则允许小鼠在安全平台上站立 若小鼠在 之内未能找到安全平台则将小鼠引至安全平台上站立 其潜伏期记录为 逃避潜伏期越短则表明小鼠学习能力越好 空间探索实验:第 天将安全平台撤除让小鼠凭记忆找寻安全平台的位置 记录每只小鼠 内经过安全平台位置的次数 小鼠穿越平台次数越多则表明学习能力越强()旷场实验:旷场实验装置为内壁和底面为白色、内径为 的敞箱被分割为面积相等的 个小格子中间 格为中央区域其余 格为外周区域 旷场实验上方安置红外摄像头记录小鼠 内进入中央区域次数及活动时间每只小鼠重复检测 次 每只小鼠实验结束后清理残留物并使用 酒精擦拭旷场实验装置以防对后续实验小鼠造成影响 患者常有一定程度的精神焦虑状态并伴随着自发活动能力与探索行为能力的衰减 旷场实验是检测动物焦虑程度、自发活动与探索行为能力的有效设施小鼠在旷场中央区的活动时间反映其焦虑程度中央区活动时间越长则反映小鼠焦虑程度越低()取材:水迷齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 .宫实验及旷场实验完成后小鼠摘取眼球取血后分离血清(离心 /)小鼠断头处死后在冰台上迅速开颅取脑每组取出 个全脑置于中性福尔马林固定液里固定 其余小鼠大脑剥离海马和脑组织放置于液氮罐中备用()染色:取动物组织样本固定:中性福尔马林固定 脱水:乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯浸蜡包埋切片 脱蜡:二甲苯、二甲苯水化:无水乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、自来水冲洗染色:苏木精染液浸染、自来水冲洗分化:盐酸乙醇、自来水冲洗蓝化:弱氨水溶液反蓝、蒸馏水冲洗染色:.伊红染液浸染脱水:乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯封片:中性树胶封片、镜下观察拍照()尼氏染色:取动物组织样本固定:中性福尔马林固定 脱水:乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯浸蜡包埋切片 脱蜡:二甲苯、二甲苯水化:无水乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、自来水冲洗染色:焦油紫染液浸染、自来水冲洗脱色:乙醇脱水:乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯封片:中性树胶封片镜下观察拍照()免疫荧光法检测突触可塑性相关蛋白表达:取处理后的细胞用 多聚甲醛固定 .通透 经 在 下封闭 后分别用()、()和()抗体在 下孵育过夜洗涤后滴加荧光二抗在复染 后封片在荧光显微镜()下观察.统计学处理:使用 .统计软件分析实验数据统计资料以平均数标准差()表示满足正态分布时两组相较采用 检验多组相较则采用单因素方差分析不满足正态分布则采用非参数分析.表示有统计学意义二、结果.各组定位航行实验结果比较:与空白组比较模型组小鼠逃避潜伏期时间明显增加有显著性差异(.)与模型组比较模型西药组、模型中药组两组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短有显著性差异(.、.)与模型西药组比较模型中药组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短有显著性差异(.)见表、如图 表 各组小鼠平均逃避潜伏期的比较()组别第 天第 天第 天第 天第 天空白组().模型组().模型西药组().模型中药组().注:与空白组比较.与模型组比较.、.与模型西药组比较.与空白组比较.与模型组比较.、.与模型西药组比较.图 各组小鼠平均逃避潜伏期的比较 .各组空间探索实验结果比较:与空白组比较模型组小鼠穿越平台次数明显减少有显著性差异(.)与模型组比较模型西药组、模型中药组两组小鼠穿越平台次数显著增加有显著性差异(.、.)与模型西药组比较模型中药组小鼠穿越平台次数增加有显著性差异(.)见表、如图 .各组旷场实验结果比较:与空白组比较模型组小鼠进入中央区次数、中央区活动时间明显减少有显著性差异(.)与模型组比较模型西药组、模型中药组小鼠进入中央区次数、中央区活动时间明显增加有显著性差异(.)与模型西药组比较模型中药组有显著性差异(.)见表、如图 表 各组小鼠穿越平台的次数比较()组别样本量(只)穿越平台的次数空白组.模型组.模型西药组.模型中药组.注:与空白组比较.与模型组比较.、.与模型西药组比较.齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 .表 各组旷场实验()分组样本量(只)进入中央区次数中央区活动时间()空白组.模型组.模型西药组.模型中药组.注:与空白组比较.与模型组比较.、.与模型西药组比较.注:与空白组比较.与模型组比较.、.与模型西药组比较.图 各组小鼠穿越平台的次数比较 注:与空白组比较.与模型组比较.、.与模型西药组比较.图 各组旷场实验 .各组 染色结果比较:空白组小鼠海马神经元细胞数量丰富结构形态完整规则且排列整齐、紧密胞质核仁致密、清晰与空白组比较模型组小鼠海马神经元细胞数量明显减少细胞间隙增大胞核固缩、肿胀排列紊乱层次不清提示神经元细胞凋亡严重与模型组相比模型西药组小鼠海马神经元细胞数量有所增加排列较整齐细胞间隙有一定减少说明海马神经元细胞凋亡现象得到一定改善与模型组比较模型中药组小鼠海马神经元细胞数量明显增加结构形态完整细胞间隙明显缩小胞核深染、固缩现象明显改善提示细胞凋亡现象得到明显改善 如图 .各组尼氏染色结果比较:各组小鼠海马神经元尼氏染色结果显示空白组小鼠海马神经元细胞数量致密富含丰富紫蓝色尼氏小体排列整齐、均匀与空白组比较模型组小鼠海马神经元细胞中尼氏小体脱失严重细胞稀疏排列紊乱提示神经元细胞凋亡严重与模型组比较模型西药组小鼠海马神经元细胞尼氏小体数量增加细胞排列较整齐说明海马神经元细胞凋亡现象得到一定改善与模型组比较模型中药组小鼠海马神经元细胞尼氏小体显著增加细胞排列均匀、整齐未见明显胞核深染、固缩等病理情况提示细胞凋亡现象得到明显改善如图 图 各组小鼠海马 染色图 各组小鼠海马尼氏染色 .各组免疫荧光法检测突触可塑性相关蛋白表达结果比较:各组小鼠海马、免疫荧光表达结果显示 染出来的正常细胞核为蓝色阳性表达的荧光表达为红色 与正常组比较模型组小鼠海马、红色荧光面积明显增加蓝色荧光面积减少明显提示突触可塑性相关蛋白、表达量明显降低与模型组比较模型西药组和模型中药组小鼠海马齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 .、红色荧光面积减少蓝色荧光面积明显增多且神经细胞排列整齐、规则细胞核清晰可见提示突触可塑性相关蛋白表达量增加神经元细胞凋亡情况得到明显改善 见图 图 各组小鼠海马、免疫荧光表达 讨论地黄饮子为古代经典名方原方由熟地黄、山萸肉、麦冬、石斛、五味子、远志、石菖蒲、茯苓、肉苁蓉、肉桂、巴戟天、附子、薄荷、生姜、大枣组成熟地黄、山萸肉、石斛、五味子、麦冬可滋补肾精肾阴肉苁蓉、肉桂、巴戟天、附子能温肾阳远志、茯苓、菖蒲可交通心肾、化痰开窍薄荷一方面可疏肝解郁另一方面又可加强开窍功效大枣、生姜既可调脾胃补气血又能调和诸药全方共奏滋肾阴、补肾阳、化痰开窍功效本实验所用地黄饮子加减方为导师谢宁教授所拟为原方去肉桂变桂枝加人参、血竭等药物化裁而成全方具有开窍、化痰、补肾、活血的功效符合老年性痴呆之肾精不足、痰瘀互结病因病机突触被认为是学习记忆形成、维持的物质基础是神经元之间相关联系、传递信息的关键结构多项研究发现突触可塑性相关蛋白可调控突触生长、发育、成熟等过程其表达水平降低会引起认知功能障碍突触数量减少、突触可塑性相关蛋白表达降低、突触功能传递信息减慢是 发病的重要因素 大量实验研究结果表示地黄饮子具有改善学习记忆能力、抗氧化、抑制细胞凋亡、保护线粒体、调节突触可塑性、增强突触结构稳定性等功能 是一种存在于神经组织中的特异性磷蛋白与突触可塑性密切相关主要分布于轴突末端和突触前膜对其生长、分化及再生有重要意义对神经纤维的生长、分化及修复损伤亦有重要作用 此外当 被激活后可与肌动蛋白发生相互作用进而影响突触和树突棘的形态变化所以 被认为是研究神经可塑性的必不可少的标志物 主要位于突触囊泡膜上的糖蛋白可与 进行特异性结合在突触可塑性及认知功能中发挥重要作用能够维持突触结构稳定性改善神经可塑性 含量可反映突触数量、突触密度及神经传递效能 是突触后膜上的支架蛋白通过与特异性蛋白结合并整合信号分子、靶蛋白分子后进而维持突触结构和功能的可塑性因此、含量的检测可表示突触发生及突触数量多少表现突触传递功能是神经元突触可塑性的重要标志物本实验研究在中医基础理论指导下运用地黄齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 .饮子加减方进行干预治疗观察不同组别/双转基因痴呆小鼠 水迷宫实验逃避潜伏期时间、穿越平台次数旷场实验进入中央区次数、中央区活动时间海马 染色、尼氏染色及海马、免疫荧光表达实验结果显示地黄饮子加减方治疗后小鼠 水迷宫逃避潜伏期时间明显缩短、穿越平台次数增加旷场实验进入中央区次数及中央区活动时间明显增加说明小鼠学习记忆能力得到明显提高焦虑水平降低 染色及尼氏染色小鼠海马区神经元细胞数量明显增加、细胞排列整齐规则神经元细胞损伤得有效改善免疫荧光结果显示突触可塑性相关蛋白、表达量显著增加提示海马神经元突触可塑性损伤得到明显改善 上述实验结果提示地黄饮子加减方可有效防治老年性痴呆但其详细神经元突触可塑性损伤保护机制有待进一步深入研究参 考 文 献 .():.邵淑君邬继红李华岳等.督脉电针对 /双转基因痴呆小鼠行为学和海马区 沉积的影响.中华中医药学刊():.():.:.:.():.():.杨美丽吴振刚肖尧等.突触可塑性与学习记忆关系的研究进展.现代医药卫生():.:.():.薛彦宇曹靖宜沈杨等.基于突触可塑性探讨抗阿尔茨海默症作用机制的理论研究.中央民族大学学报:自然科学版():.许玉珉沈晓明马云枝等.开心散对/小鼠学习记忆能力和突触功能的机制.中国实验方剂学杂志():.史珊怡邢菁郭文海等.“原络通经”针刺法治疗痴呆小鼠学习记忆能力机制研究.辽宁中医药大学学报():.:.():.钱红月侯吉华肖移生等.黄精丸抑制 半乳糖和冈田酸所致学习记忆障碍小鼠海马神经元 蛋白过磷酸化的作用机制.中国实验方剂学杂志():.谢芳谢宁于水澜等.地黄饮子治疗老年痴呆研究进展.辽宁中医药大学学报():.谢芳谢宁.地黄饮子加减方对 半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化作用的影.山东中医杂志():.:.王其琼吕俊玲胡咏川等.阿尔茨海默病致病机制及治疗药物研究新进展.中国药学杂志():.谭雪高莉任佳等.突触可塑性对阿尔茨海默病影响的研究进展.中国医药导报():.杜果何婧黄燕等.突触丢失在认知障碍中的作用.中华老年心脑血管病杂志():.关慧波刘莹徐丽等.地黄饮子对转 基因果蝇 模型/信号通路基因表达的影响.上海中医药杂志():.谢宁刘艳丽宋琳等.地黄饮子的实验研究进展.中华中医药学刊():.牛英才李鸿梅兴桂华等.损伤后大鼠 和 的变化及加减地黄饮子的干预作用.四川中医():.:.韩冉马涛张志辰等.地黄饮子治疗阿尔茨海默病的实验研究进展.中国实验方剂学杂志():.():.叶海森陈曦李韧娇等.养血清脑颗粒对认知功能障碍大鼠学学习、记忆及、表达的影响.世界中医药():.:.():.吴世卫关建军陈瑜.醒神益智颗粒对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马突触后致密蛋白 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