原药材质量标准分析方法验证.docx

药材质量标准方法建立
1．仪器与材料
UV－1601紫外－可见分光光度计 (日本岛津)
AB204-N电子天平 (万分之一天平，METTLER TOLEDO)
BP211D电子天平 （十万分之一天平，Sarlorius）
葡萄糖 (分析纯，天津市化学试剂一厂)
苯酚 (分析纯，天津市化学试剂一厂)
蒽酮 分析纯，国药集团化学试剂有限公司）
硫酸 (分析纯，天津市凯信化学试剂有限公司)

当归药材购于甘肃岷县，经天津药物研究院中药现代研究部张铁军研究员鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv)Diels的干燥根，经检测符合《中华人民共和国药典》（2010版）一部的有关规定。
黄芪药材购于甘肃岷县，经天津药物研究院中药现代研究部张铁军研究员鉴定为蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge．Var．mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，经检测符合《中华人民共和国药典》（2010版）一部的有关规定。

2．方法与结果
2.1药材中多糖含量测定方法
本试验采用比色法对药材中的多糖含量进行测定，并建立了含量测定方法。
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品30.43mg，置100ml量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水葡萄糖0.3043mg）。
2.1.2 5％苯酚试剂的配制
取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集182℃馏分，称取此馏分5g置棕色容量瓶中溶解后定容，存冰箱备用。
2.1.3 供试品溶液制备方法的考察与确定
水提时间的考察
分别取60℃干燥至恒重的当归及黄芪药材细粉5份，每份约0.50g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取2小时，残渣挥干溶剂后，再继续以水分别回流提取1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h，反复洗至250ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml具塞干燥试管中，采用改良后的苯酚-硫酸法测定吸光度，计算含量，结果见表1-1。
表1-1 水提不同提取时间对当归含量测定的影响结果
样品
提取时间（h）
当归多糖含量（%）
黄芪多糖含量（%）
1
1.0
7.568
5.501
2
2.0
8.599
6.511
3
3.0
8.583
6.600
4
4.0
8.594
6.589
5
5.0
8.580
6.590
从表1-1可知，水提提取时间为2.0h时，药材含量达到最大值且保持恒定，延长提取时间药材含量变化不大，故选择提取时间为2.0h。
2.1.4 供试品溶液的制备
分别取60℃干燥至恒重的当归及黄芪药材细粉约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取1小时，残渣挥干溶剂后，再继续以水回流提取2小时，反复洗涤残渣及烧瓶至250ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，备用。

2.1.5 最大吸收波长选择
取2.1.1项下对照品溶液，在200nm-700nm波长间进行紫外吸收光谱扫描，最大吸收波长为490nm，确定选择490nm作为检测波长。
2.1.6 标准曲线的制备
精密量取对照品溶液1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液1ml，置具塞试管中，分别加5％苯酚溶液0.6ml，混匀，迅速加入硫酸3.0ml，摇匀，于90℃水浴中15分钟，取出，置冰水浴中15分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外－可见分光光度法（附录VA），在490nm的波长处测定吸光度，结果见表1-2。以吸光度为纵坐标，葡萄糖取样量为横坐标，绘制标准曲线，可得回归方程：y=0.0045x-0.0011，r=0.9995(n=6)。葡萄糖在24.24～145.44 μg范围内，与吸光度呈良好的线性关系，结果见图1-1。
表1-2 葡萄糖线性范围考察
取样量(μg)
吸光度
24.24
0.115
48.48
0.209
72.72
0.330
96.96
0.433
121.20
0.554
145.44
0.655

图1-1 葡萄糖标准曲线
Fig 1-1 Standard Curve of glucose
2.1.6 精密度试验
精密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测吸光度，重复测定6次，求得吸光度值的RSD值为0.33%。结果见表1-3，说明仪器的精密度符合要求。
表1-3 精密度试验结果
测定次数
吸光度A
1
0.387
2
0.386
3
0.389
4
0.388
5
0.386
6
0.386
RSD（%）
0.33
2.1.7 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，每10分钟测定一次吸光度，到1小时后改为30分钟测一次，求得多糖含量的RSD值为1.02％，结果见表1-4，测定值在120分钟内保持稳定。以下吸光度的测定均在120分钟内完成。
表1-4 稳定性试验结果
测定时间(min)
多糖含量（％）
0
8.491
10
8.380
20
8.602
30
8.447
40
8.647
50
8.624
60
8.536
90
8.491
120
8.513
RSD（%）
1.02
2.1.8 重现性试验 取60℃干燥至恒重的当归药材细粉6份，精密称定，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，计算多糖含量，求得多糖含量值RSD值为1.68％，结果见表1-5，表明方法重现性良好。
表1-5 重现性试验结果
样品
多糖含量（%）
1
8.710
2
8.895
3
8.505
4
8.602
5
8.609
6
8.519
平均含量
8.640
RSD（%）
1.68
2.1.9 加样回收率试验 取上述已知多糖含量的当归药材细粉6份，每份约0.125g，精密称定，精密加入浓度为2.111 mg/ml标准葡萄糖对照品溶液5 ml按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，计算多糖含量，计算回收率，结果见表1-6。平均回收率为99.12%，RSD值1.96%。结果表明：本法回收率较好，方法可行。
表1-6 加样回收率试验结果
样品
取样量（g）
样品含量（mg）
对照品加入量（mg）
实测量（mg）
回收率（％）
平均回收率（％）
RSD（%）
1
0.1242
10.70
10.56
20.97
97.25

2
0.1256
10.82
10.56
21.61
102.18

3
0.1257
10.83
10.56
21.33
99.43
99.12
1.96
4
0.1254
10.80
10.56
21.22
98.67

5
0.1255
10.81
10.56
21.39
100.19

6
0.1250
10.77
10.56
21.01
96.97

2.1.10 当归药材中多糖含量测定 取60℃干燥至恒重的当归药材细粉三份，每份约0.25g，精密称定，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测定吸光度，计算多糖含量，求得当归药材中平均多糖含量为8.58％，结果见表1-7。
表1-7 当归药材中多糖含量测定结果
样品
取样量（g）
多糖含量（％）
平均多糖含量（％）
1
0.2501
8.44

2
0.2498
8.54
8.58
3
0.2500
8.76

2.2 黄芪药材中多糖含量测定方法
本试验采用比色法对药材中的含量进行测定，建立了含量测定方法。
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品0.03260g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水葡萄糖0.3260mg）。
2.2.2 0.2%蒽酮-硫酸溶液的配制 称取蒽酮粉末0.2g，置100ml棕色量瓶中，加硫酸至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备[67] 取黄芪药材粗粉约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水100ml，加热回流1.5h，用脱脂棉滤过，再重复提取2次，三次滤液合并，浓缩，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25 ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2 ml，置10ml具塞干燥试管中，备用。
2.2.4 供试品溶液制备方法的考察与确定
2.2.4.1 加水量的考察 取黄芪药材粗粉4份，每份约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加水50ml、100ml、150ml、200ml，加热回流1h，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2 ml，测定吸光度，计算含量，结果见表1-8和图1-2。
表1-8 不同溶剂用量对含量测定的影响结果
样品
加水量（ml）
多糖含量（%）
1
50
4.812
2
100
7.874
3
150
7.702
4
200
7.774

图1-2不同溶剂用量对含量测定的影响结果
从表1-8和图1-2可知，加水量为100ml时，药材含量达到最大值且保持恒定，故选择加水量为100ml。
2.2.4.2 提取时间的考察 取黄芪药材粗粉5份，每份约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水100ml，分别加热回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2 ml，测定吸光度，计算含量，结果见表1-9和图1-3。
表1-9 不同提取时间对含量测定的影响结果
样品
提取时间（h）
多糖含量（%）
1
0.5
7.598
2
1.0
8.125
3
1.5
8.594
4
2.0
8.597
5
2.5
8.585

图1-3 不同提取时间对含量测定的影响结果
从表1-9和图1-3可知，提取时间为1.5h时，药材含量达到最大值且保持恒定，延长提取时间药材含量变化不大，故选择提取时间为1.5h。
2.2.4.3 提取次数的选择 取黄芪药材粗粉5份，每份约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水100mll，加热回流1.5h，分别再重复提取0、1、2、3、4次，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2 ml，测定吸光度，计算含量，结果见表1-10和图1-4。
表1-10 不同提取次数对含量测定的影响结果
样品
提取次数（次）
多糖含量（%）
1
1
7.869
2
2
8.750
3
3
10.130
4
4
9.973
5
5
9.702

图1-4 不同提取次数对含量测定的影响结果
从表1-10和图1-4可知，次数对多糖提取有影响，随着次数增加多糖含量上升，提取次数为三次时，药材含量达到最大值且保持恒定，增加提取次数药材含量变化不大，故选择提取次数为三次。
2.2.5 标准曲线的制备[66] 精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置10ml具塞刻度试管中，各加水至2.0ml，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10分钟，取出，立即置冰水浴中冷却10分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（附录VA），在582nm波长处测定吸光度，结果见表1-11。以吸光度为纵坐标，葡萄糖取样量为横坐标，绘制标准曲线，可得回归方程：y = 0.0041x + 0.0337，r=0.9992(n=6)。葡萄糖在32.60～195.60 μg范围内，与吸光度呈良好的线性关系，结果见图1-5。
表1-11 葡萄糖线性范围考察
取样量(μg)
吸光度A
32.60
0.158
65.20
0.312
97.80
0.426
130.40
0.573
163.00
0.685
195.60
0.833

图1-5 葡萄糖标准曲线
2.2.6 精密度试验 精密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测吸光度，重复测定6次，求得吸光度值的RSD值为0.14%。结果见表1-12，说明仪器的精密度符合要求。
表1-12 精密度试验结果
测定次数
吸光度A
1
0.754
2
0.753
3
0.753
4
0.753
5
0.752
6
0.755
RSD（%）
0.14
2.2.7稳定性试验 精密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，每10分钟测定一次吸光度，到1小时后改为30分钟测一次，求得多糖含量的RSD值为1.17％，结果见表1-13，测定值在120分钟内保持稳定。以下吸光度的测定均在120分钟内完成。
表1-13 稳定性试验结果
测定时间(min)
多糖含量（％）
0
10.84
10
10.72
20
10.74
30
11.12
40
10.98
50
11.01
60
10.95
90
10.93
120
10.92
RSD（%）
1.17
2.2.8 重现性试验 取黄芪药材粗粉6份，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，计算多糖含量，求得多糖含量值RSD值为1.14％，结果见表1-14，表明方法重现性良好。
表1-14 重现性试验结果
样品
多糖含量（%）
1
10.77
2
11.02
3
10.93
4
11.12
5
10.97
6
11.08
平均含量
10.98
RSD（%）
1.14
2.2.9 加样回收率试验 取上述已知多糖含量的黄芪药材粗粉6份，每份约0.5g，精密称定，精密加入浓度为10.978mg/ml标准葡萄糖对照品溶液5 ml按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，计算多糖含量，计算回收率，结果见表1-15。平均回收率为99.61% ，RSD值1.73%。结果表明：本法回收率较好，方法可行。
表1-15 加样回收率试验结果
样品
取样量（g）
样品含量（mg）
对照品加入量（mg）
实测量（mg）
回收率（％）
平均回收率（％）
RSD（%）
1
0.4999
54.89
54.89
109.65
99.76

2
0.5005
54.95
54.89
110.18
100.62

3
0.5003
54.93
54.89
110.82
101.82
99.61
1.73
4
0.5007
54.98
54.89
110.02
100.27

5
0.4995
54.85
54.89
108.19
97.18

6
0.4998
54.88
54.89
108.66
97.98

2.2.10 黄芪药材中多糖含量测定 取黄芪药材粗粉三份，每份约1g，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测定吸光度，计算多糖含量，求得黄芪药材中平均多糖含量为10.98％，结果见表1-16。
表1-16 黄芪药材中多糖含量测定结果
样品
取样量（g）
多糖含量（％）
平均多糖含量（％）
1
1.0002
10.95

2
0.9998
10.98
10.98
3
1.0003
11.01