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第 40 卷第 4 期2023 年 8 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.4August 2023论著收稿日期:2022-06-06作者简介:董浩(1985),男,兽医师,研究方向:实验动物学与布鲁氏菌病防控技术研究.E-mail:tunghao 通信作者:马丽颖(1972),女,主任技师,研究方向:实验动物设施运行管理.E-mail:maliyinglw 从腹泻实验兔分离的一株大肠埃希菌的生物学特性研究董 浩 刘志国 李 楠 邢 进 许中衎 邢壮壮 冯育芳 马丽颖(中国食品药品检定研究院 国家啮齿类实验动物资源库,北京102629)摘要:目的研究从腹泻实验兔分离到的大肠埃希菌的生物学特性。方法对一株从因腹泻而死亡的 SPF 级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌的遗传谱系、抗生素敏感性、消毒液敏感性以及细菌携带的耐药基因和毒力基因进行较为全面的研究。结果该大肠埃希菌属于 B1 型遗传谱系,携带毒力基因 eaeA,属于肠致病性大肠埃希菌。对常用的 5 种消毒液敏感,对于青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、米诺霉素、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、复方新诺明等 11 种抗生素耐药,携带 aadA1,gyrA,sul1 和 tetA 等 4 个抗生素耐药基因。结论从因腹泻而死亡的 SPF 级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌为一株 B1 型遗传谱系的肠致病性大肠埃希菌,具有多重耐药性,对常用的消毒剂均敏感。关键词:肠致病性大肠埃希菌;耐药性;毒力基因;腹泻中图分类号:S855.1文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)04-0049-06DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.010Study on Biological Characteristics of Escherichia Coli Isolated fromExperimental Rabbits with DiarrheaDONG Hao,LIU Zhiguo,LI Nan,XING Jin,XU Zhongkan,XING Zhuangzhuang,FENG Yufang,MA Liying(National Institutes for Food and Drug Control,National Rodent Laboratory Animal Resources Center,Beijing 102629,China)Abstract:ObjectiveTo reveal the biological characteristics of E.coli isolated from experimental rabbits with diarrhea.Method The genetic lineage,antibiotic sensitivity,disinfectant sensitivity,drug resistance gene and virulence related gene of the pathogenic Escherichia coli strain isolated from SPF rabbits died of diarrhea were studied comprehensively.ResultThe Escherichia coli strain belonged to B1 type genetic lineage,and carried the virulence gene eaeA,which was the classic virulence genes of enteropathogenic Escherichia coli(EPEC).In addition,this isolated strain was sensitive to 5 commonly used disinfectants.Besides,it was resistant to 11 antibiotics including penicillin,ampicillin,cephalexin,cephradine,tetracycline,doxycycline,minocycline,erythromycin,midecamycin,vancomycin and cotrimoxazole,and carried 4 drug resistance genes,including aadA1,gyrA,sul1 and tetA.ConclusionThe pathogenic Escherichia coli strain isolated from SPF rabbits died of diarrhea is a type B1 genetic pedigree EPEC with multiple drug resistance and it is sensitive to common disinfectants.Key words:EPEC;drug resistance;virulence gene;diarrhea 实验动物科学40 卷大肠埃希菌是兔肠道内的常见菌,在正常情况下并不会引起动物的发病,但是在饲养管理不善或气候环境突变等应激因素的作用下,常会导致兔的肠道菌群紊乱,机体抵抗力降低而引发大肠埃希菌病。发病兔排出的大肠埃希菌污染了饲料、饮水和环境等,又经消化道等途径感染同群健康兔,严重时可以造成大批死亡。各种年龄和性别的兔均有易感性,尤其是仔兔和幼兔最易感,发病率、死亡率都较高。目前,在临床上兔大肠埃希菌病的报道较多,尤其 是 大 肠 埃 希 菌 与 球 虫 共 感 染 的 情 况 比 较 常见1-3,但是屏障设施内饲养的 SPF 级实验兔感染大肠埃希菌的报道却并不多见。在前期研究中,对本单位屏障设施内饲养的发生腹泻的 SPF 级实验兔进行剖检,从病变脏器中分离到了一株大肠埃希菌4。鉴于大肠埃希菌是引起兔腹泻的病原菌之一,因此对该细菌的生化特性、遗传谱系、毒力基因、消毒液敏感性、抗生素敏感性、以及细菌携带的耐药基因进行较为全面的研究,为屏障设施内有效预防实验兔的大肠埃希菌感染提供数据支持。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂与耗材:新洁尔灭消毒液(山东安捷高科消毒科技有限公司),消毒液原液的苯扎溴铵含量为 2.7%3.3%(W/V);健之素消毒泡腾片(北京长江脉医药科技有限责任公司),有效氯含量为(353.5)%;百毒杀消毒液(癸甲溴铵溶液)(上海派斯德生化有限公司),规格为 100 mL:10 g;百胜-30(碘酸混合溶液 3.0%)由 Evans 生产厂生产,成分为醇乙氧基化物 20%25%,硫酸 5%10%,磷酸5%10%,碘 1%3%;75%乙醇(北京鸿志伟达工贸有限公司)。胰酪大豆胨液体培养基(Trypticase Soy Broth)、D/E 中和肉汤培养基和吐温 80(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)。2Taq PCR StarMix(北京康润诚业生物科技有限公司);DNA marker DL2000(大连宝生物公司)。大肠埃希菌耐药基因和毒力基因的扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.1.2菌株:大肠埃希菌(ILAREc-01)分离自中国食品药品检定研究院动物实验室饲养的一只腹泻的SPF 级实验兔。1.1.3主要仪器:生物安全柜(Nuaire 公司);恒温培养箱(Thermo 公司);全自动细菌鉴定仪(BD 公司);Veriti 96 孔 PCR 仪(Applied Biosystems 公司);电泳仪和凝胶成像仪(伯乐公司)。1.2方法1.2.1细菌的生化鉴定:将冻存的 ILAREc-01 菌株在 TSA 培养基上划线复苏,使用全自动细菌鉴定仪进行细菌各项生化指标的鉴定。1.2.2细菌的遗传谱系分析:根据文献5报道的Clermont 四重 PCR 方法对分离到的 ILAREc-01 菌株进行遗传谱系分析。根据文献5进行引物合成,以灭活的 ILAREc-01 菌液为模板,进行 PCR 扩增。PCR 反应程序为:预变性 94 4 min;变性 94 5 s,退火 59 20 s,延伸 72 30 s,30 个循环;延伸 72 5 min。PCR 产物使用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。1.2.3消毒剂敏感性分析1.2.3.1消毒剂的配置:百毒杀消毒液:将百毒杀原液进行 600 倍稀释;健之素消毒液:1 片健之素泡腾片(250 mg)加入 500 mL 蒸馏水中混匀;新洁尔灭消毒液:按照使用说明将新洁尔灭消毒液原液与蒸馏水按照 1 4 的比例混合;75%乙醇:直接使用产品原液;百盛-30 消毒液:使用蒸馏水将百盛-30原液进行 1 000 倍稀释。1.2.3.2悬液定量杀菌实验:参考消毒剂实验室杀菌效果检验方法(GB/T 385022020),略有改动。取 0.3 mL 的大肠埃希菌 ILAREc-01 细菌悬液分别加入 1.2 mL 的百毒杀消毒液、健之素消毒液、新洁尔灭消毒液、75%乙醇和百盛-30 消毒液中,混匀后室温孵育 1.5、5 和 10 min。随后,分别取出0.5 mL 的上述混合液加入 4.5 mL D/E 中和肉汤培养基,并进行充分混匀。室温放置 10 min 后,进行细菌涂板,16 24 h 培养后计数。上述实验进行 3次重复。1.2.4药物敏感性分析:参照卫生行业标准抗菌药物敏感性试验的技术要求(WS/T 6392018)的要求,将 ILAREc-01 菌液浓度调整至 1 108 CFU/mL,均匀涂布与 MH 固体培养基上,依次贴药敏纸片,37 培养 18 h 后测量抑菌环的直径。结果判定按照杭州微生物试剂有限公司官网提供的药敏实验纸片法的抑菌范围解释标准执行。1.2.5耐药基因和毒力基因的 PCR 检测:根据相05第 4 期董浩等:从腹泻实验兔分离的一株大肠埃希菌的生物学特性研究 关参考文献6-7,分别合成了耐药基因和毒力基因的扩增引物。其中,耐药基因的检测包括耐受氨基糖苷类抗生素基因 aacC2、aph(3)-I a、aadA1 和aadB;耐受-内酰胺类抗生素基因 blaTEM、blaSHV和 blaCTX-M;耐受四环素类抗生素基因 tetA、tetB 和tetC;耐 受 喹 诺 酮 类 抗 生 素 基 因 qnrA、oqxAB、aac(6)-I b 和 gyrA;耐受磺胺类抗生素基因 sul1、sul2和 sul3。毒力基因包括产肠毒素大肠埃希菌黏附素K88、K99、F41 和 987P 基因,肠致病性大肠埃希菌的毒力基因 eaeA 和 bfpA,肠出血性大肠埃希菌的特征性毒力因子基因 stX1 和 stX2。PCR 扩增体系为:模板 2 L,PCR mix 25 L,上下游引物各 0.5 L,加入双蒸水补齐 50 L 体系。PCR 反应程序为:预变性 94 5 min;变性 94 30 s,退火 54 30 s,延伸 72 45 s,30 个循环;延伸 72 10 min。PCR产物使用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。2结果2.1分离细菌的生化鉴定采用 BD 公司的全自动细菌鉴定仪进行大肠埃希菌 ILAREc-01 的生化特性鉴定,全自动细菌鉴定仪共进行了 16 h 的检测,实验结果如表 1 所示。表 1大肠埃希菌 ILAREc-01 的生化鉴定结果Table 1Results of biochemical identification of Escherichia coli ILAREc-01测试项目检测结果测试项目检测结果测试项目检测结果精氨酸-精氨酸-AMC-甘氨酸-脯氨酸-AMC-甘氨酸-AMC-戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC-L-精氨酸-AMC-L-谷氨酸-AMC+L-亮氨酸-AMC-L-苯丙氨酸-AMC-L-脯氨酸-AMC-L-焦谷氨酸-AMC-L-色氨酸-AMC-赖氨酸-丙氨酸-AMC-乙酸-福寿草醇-柠檬酸盐-多黏菌素 E-D-甘露醇+ALPHA-酮戊二酸-丙二酸-多黏菌素 B-顺芷酸-U-N-乙酰-BD-氨基葡萄糖-GAMMA-L-谷氨酰-NA+L-脯氨酸-NA-PNP-BD=葡糖苷-BIS(PNP)磷酸盐-BETA-阿洛糖-BETA-龙胆二糖-右旋糖+D-果糖+D-半乳糖-D-葡糖酸+D-蜜二糖+山梨醇+蔗糖-半乳糖醛酸+L-阿拉伯糖+L-鼠李糖+甲基-B-葡糖苷-麦芽酮糖-N-乙酰-氨基半乳糖-N-乙酰-葡糖胺+鸟氨酸-尿素-七叶酸-2.2细菌的遗传谱系分析基于 Clermont 四重 PCR 方法对 ILAREc-01 菌株进行遗传谱系分析,PCR 扩增结果如图 1 所示,未扩增出 chuA 和 yjaA 基因的目的条带,而扩增获得 TspE4.C2 和 arpA 基因相应大小的 PCR 产物。上述结果表明,ILAREc-01 属于大肠埃希菌的 B1 型遗传谱系。2.3毒力基因的 PCR 扩增结果对产肠毒素大肠埃希菌黏附素 K88、K99、F41和 987P 基因,肠致病 性大肠埃希 菌的毒力基 因eaeA 和 bfpA,肠出血性大肠埃希菌的特征性毒力因子基因 stX1 和 stX2 进行 PCR 扩增的结果如图 2 所示,在 ILAREc-01 菌株中只扩增到了 eaeA 基因,而其他毒力基因的扩增结果均为阴性。由于 eaeA 基因是肠致病性大肠埃希菌的标志性毒力基因,因此,ILAREc-01 菌株是一株肠致病性大肠埃希菌。2.4不同消毒液对大肠埃希菌的消毒效果为了检测不同消毒液对引起家兔腹泻的大肠埃希菌的杀灭效果,将大肠埃希菌从单菌落接种至TSB 培养基 37 培养 12 h 后稀释至 1109 CFU/mL,测试 5 种消毒液在室温下对大肠埃希菌的杀菌效果。5 种消毒液在作用 1.5、5 和 10 min 后,取200 L 涂板,经过 1624 h 培养后培养基上没有任何菌落生长,此时细菌的浓度小于 5 CFU/mL,这 5种消毒液的杀灭效果均符合消毒剂实验室杀菌效果检验方法(GB/T 385022020)的要求,说明 5种消毒液对该大肠埃希菌的杀灭效果均比较理想。2.5药物敏感性实验结果药敏实验的结果按照杭州微生物试剂有限公司官网提供的药敏实验纸片法的抑菌范围解释标准判15 实验动物科学40 卷注:M.DL2000 Marker;1.chuA 基因的 PCR 扩增结果;2.yjaA 基因的 PCR 扩增结果;3.TspE4.C2 基因的 PCR 扩增结果;4.arpA 基因的 PCR 扩增结果Note:M.DL2000 Marker;1.PCR amplification results of chuA gene;2.PCR amplification results of yjaA gene;3.PCR amplification results of TspE4.C2 gene;4.PCR amplification results of arpA gene图 1ILAREc-01 菌株基于 Clermont 四重 PCR 方法的 PCR 扩增结果Fig.1Amplification results of ILAREc-01 strain based on Clermont quadruple PCR method注:M.DNA maker DL2000;18.eaeA 基因、bfpA 基因、stX1 基因、stX2 基因、黏附素 K88、K99、F41 和 987P 基因的扩增结果Note:M:DNA maker DL2000;1-8.amplification results of eaeA gene,bfpA gene,stX1 gene,stX2 gene,adhesins K88,K99,F41 and 987P gene图 2ILAREc-01 菌株中大肠埃希菌毒力基因的 PCR 扩增结果Fig.2PCR amplification result of Escherichia coli virulence gene in ILAREc-01 strain定如下:ILAREc-01 菌株对于青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、米诺霉素、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、复方新诺明等 11 种抗生素耐药(R),对哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、丁胺卡那、庆大霉素、氧氟沙星等 9 种抗生素敏感(S)(表 2)。2.6耐药基因的 PCR 扩增结果对 17 种抗生素耐药基因的 PCR 扩增结果如图3 所示,白色箭头从左向右依次指示了 ILAREc-01中耐受氨基糖苷类抗生素基因 aadA1,耐受喹诺酮类抗生素基因 gyrA,耐受磺胺类抗生素基因 sul1 和耐受四环素类抗生素基因 tetA 等 4 个耐药基因的PCR 阳性产物的电泳结果。第 1 泳道的 aacC2 基因的 PCR 扩增产物略大于目的片段(697 bp)长度,经过测序分析为非特异性扩增产物。其他 11 个耐药基因均未扩增出目的片段大小的产物。3讨论兔的大肠埃希菌病是危害家兔养殖业的主要传染病之一8,研究表明,在自然感染病例中该病的发病 率 为 50%68%,病 死 率 可 以 达 到 50%92.3%9。兔大肠杆菌病的主要临床症状主要表现有腹泻型、败血型和混合型 3 种。病程短的在 1 2 d 内死亡,长的经 7 8 d 死亡。急性发病的病例突然死亡而不显示任何症状。患病兔会出现精神沉25第 4 期董浩等:从腹泻实验兔分离的一株大肠埃希菌的生物学特性研究 表 2大肠埃希菌 ILAREc-01 的药物敏感性实验结果Table 2Drug sensitivity test results of ILAREc-01 strain抗生素抑菌环直径(mm)结果判定抗生素抑菌环直径(mm)结果判定青霉素0R卡那霉素15I呋喃唑酮15I新霉素14I氨苄西林13R四环素0R羧苄西林21I多西环素0R哌拉西林21S米诺环素0R头孢氨苄13R红霉素0R头孢唑啉18S麦迪霉素0R头孢拉定12R诺氟沙星14I头孢呋辛18S氧氟沙星17S头孢他啶20S环丙沙星19I头孢曲松22S万古霉素0R头孢哌酮22S多黏菌素 B11I丁胺卡那17S复方新诺明0R庆大霉素16S注:S 表示敏感,R 表示耐药,I 表示中介Note:S.susceptible,R.resistant,I.intermediate注:117:aacC2、aph(3)-Ia、aadA1、aadB、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、qnrA、oqxAB、acc(6)-Ib、gyrA、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetC 基因的扩增结果;M:DL2000 MarkerNote:1-17:Amplification results of aacC2,aph(3)-Ia,aadA1,aadB,blaTEM,blaSHV,blaCTX-M,qnrA,oqxAB,acc(6)-Ib,gyrA,sul1,sul2,sul3,tetA,tetB and tetC genes;M:DL2000 Marker图 3ILAREc-01 菌株中 17 种耐药基因的 PCR 扩增结果Fig.3PCR amplification result of 17 drug resistance genes in ILAREc-01 strain郁、被毛粗乱、脱水、消瘦、腹胀、剧烈腹泻、肛门和后肢被毛常沾有大量黏液或水样粪便,有时会排除两头尖的干粪球,最终往往因衰竭而死亡10。在本研究中,SPF 级实验兔发病后也出现了精神沉郁、食欲和饮水明显下降、脱水、消瘦和排出水样粪便等临床症状,未经过及时治疗的实验兔发生腹泻后 72 h 内以死亡转归。经过对腹泻死亡实验兔进行剖检,从病变脏器中 分 离 到 了 一 株 大 肠 埃 希 菌(ILAREc-01)。经过大肠埃希菌毒力因子鉴定,发现 ILAREc-01 中含有 eaeA 基因,表明其属于肠致病性大肠埃希菌,而这一类大肠埃希菌是引起兔大肠杆菌病的主要病原体。在同一个环境内长期使用一种消毒剂,会使细菌产生耐药性,导致消毒效果下降11,在临床养殖环节和食品生产加工环节都有耐受不同类型消毒剂的大肠埃希菌的相关报道12-13。为了测定 ILAREc-01 菌株是否对设施中常用的几种消毒剂具有耐受性,本实验参考消毒剂实验室杀菌效果检验方法(GB/T 385022020)进行了杀菌效果的测试,结果表明新洁尔灭、百毒杀、健之素泡腾片、百胜-30 和75%乙醇均可以有效杀灭大肠埃希菌 ILAREc-01。使用上述消毒剂加强设施环境的消毒,可以有效切断 ILAREc-01 菌株的传播,保护易感动物。由于抗生素滥用,使得临床上分离到的致病性35 实验动物科学40 卷大肠埃希菌常具有多重耐药性。有研究14从肉鸡舍中分离到的大肠埃希菌对林可霉素、青霉素、卡那霉素、磺胺异噁唑的耐药性较高。有研究15对一株引起仔猪腹泻的大肠埃希菌进行耐药性分析,发现其对四环素和环丙沙星具有耐药性。有研究16对某奶牛场引起犊牛腹泻的大肠埃希菌进行研究发现,其对阿莫西林、红霉素、四环素、青霉素、利福平、林可霉素、头孢噻呋具有耐药性。在本研究中,通过药敏实验发现,ILAREc-01 菌株对 9 种抗生素敏感,对多达 11 种抗生素耐药。针对 ILAREc-01 菌株耐药基因检测结果表明,该菌株携带了耐受氨基糖苷类抗生素基因 aadA1,耐受四环素类抗生素基因 tetA,耐受喹诺酮类抗生素基因 gyrA 和耐受磺胺类抗生素基因 sul1,上述结果与该菌株对于部分四环素类抗生素(四环素、多西环素和米诺环素)和磺胺类抗生素(复方新诺明)耐药存在一定关联。有研究17对 28 株河南省分离的兔源大肠埃希菌氨基糖苷类、四环素类和磺胺类耐药基因检测结 果也发现,tetA 基 因的阳性率 为85.71%,sul1 基因的检出率为 100%。有研究8对兔源大肠埃希菌、喹诺酮药物耐药性及质粒介导的耐药基因进行了检测,发现 acc(6)-Ib 基因检出率最高为 80.4%,qnrD、qnrS、oqxA 和 oqxB 检出率分别为59.8%、59.8%、63.9%和 51.5%,未检出 qnrA、qnrB、qnrC、qnrVC 和 qepA,但是该研究未进行喹诺酮类抗生素耐药基因 gyrA 的检测。有研究18对 15 株水貂源致病性大肠埃希菌的喹诺酮类药物耐药基因检测表明,耐药基因 gyrA、gyrB、qnrA 和 pare 检出率高达为 100%。有研究19对 216 株禽致病性大肠埃希菌的氨基糖苷类耐药基因的分子流行病学检测表明,aadA1 基因的阳性率高达 49.1%。由此可见,在本研究中 ILAREc-01 菌株检测出的 4 个耐药基因,在临床上分离的致病性大肠埃希菌中分布也是十分普遍的。考虑到本研究中分离的大肠埃希菌为一株 B1型遗传谱系的肠致病性大肠埃希菌且具有多重耐药性,因此进行了菌株的初步溯源分析。使用 PCR 方法对 18 份采自 SPF 兔生产群的新鲜粪便样品进行了 eaeA 基因检测,结果均为阴性(该数据未展示)。由此分析该肠致病性大肠埃希菌并非来自 SPF 兔的生产群,而有可能是由实验人员或其携带物品带入动物实验室屏障设施。参 考 文 献 1 肖春新.一例兔球虫病与大肠杆菌病共感染的诊治J.福建畜牧兽医,2022,44(1):78-79.2 胡辉,黄光中,尧国民,等.兔感染球虫病继发大肠杆菌病的诊断及病因分析J.江苏农业科学,2013,41(7):201-202.3 王俊江,单红艳,王文木.兔球虫与大肠杆菌病混合感染的诊治J.中国兽药杂志,2007,41(8):48,53.4 董浩,刘洋,冯育芳,等.基于纳米孔测序技术对兔腹泻病原的鉴定J.畜牧与兽医,2022,54(6):126-131.5 CLERMONT O,CHRISTENSON J K,DENAMUR E,et al.The Clermont Escherichia coli phylo-typing method revisited:improvement of specificity and detection of new phylo-groupsJ.Environ Microbiol Rep,2013,5(1):58-65.6 顾晓晓,邬琴,陶乔孝慈,等.犊牛肺源致病性大肠杆菌分离鉴定、耐药性及耐药基因检测 J.中国畜牧兽医,2020,47(1):240-248.7 崔一晨.非典型肠致病性大肠杆菌流行病学调查与特性研究D.江苏:扬州大学,2009.8 坤清芳,耿毅,余泽辉,等.兔源大肠埃希菌对喹诺酮药物耐药性及质粒介导的耐药基因检测J.中国预防兽医学报,2016,38(12):944-948.9 何少杰.溶菌酶预防与治疗兔大肠杆菌病的效果研究D.浙江:浙江师范大学,2017.10吴清民.兽医传染 病学 M.北京:中国农业大学 出版社,165-166.11陆若辰,邓超澄,谭强.金黄色葡萄球菌对抗生素和消毒剂的抗性机制研究进展J.抗感染药学,2015,12(2):161-165.12邹立扣,吴国艳,程琳,等.季铵盐类消毒剂及大肠杆菌对其耐药性研究进展J.食品科学,2014,35(17):338-345.13李军,谢宇舟,冯世文,等.猪源大肠杆菌 0157:H7 耐药表型和消毒 剂 抗 性 调 查 J.中 国 畜 牧 兽 医,2012,39(2):203-206.14牛晋国,申李琰,李惠龙,等.山西“农谷”肉鸡舍致病性大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析J.中国兽医杂志,2021,57(6):53-57.15陈亮,刘雪松,黄思琪,等.一株仔猪腹泻致病性大肠埃希菌的分离鉴定J.兽医导刊,2021(21):136-137.16周婷婷,凌晨,张慧敏,等.新疆某牛场大肠埃希菌的分离鉴定及 16S rRNA 序列分析J.中国奶牛,2021(3):30-35.17刘保光,李胜利,杨东东,等.河南省兔源大肠埃希菌氨基糖苷类、四环素类和磺胺类耐药基因检测J.家畜生态学报,2016,37(7):60-63.18郭家媚,葛成,张文斌,等.水貂源致病性大肠埃希菌对喹诺酮类药物耐药表型与耐药基因型检测与分析J.野生动物学报,2021,42(1):166-170.19金文杰,秦爱建,郑志明,等.禽致病性大肠埃希菌中四种抗氨基糖苷类药物耐药基因的分子流行病学调查J.中国预防兽医学报,2007,29(5):401-404.45